Name: in vitro modeling of cancerous neural invasion: the dorsal root ganglion model
Uploaded: 2016-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model at JoVE.com

Edith Suss-Toby is thanked for her assistance in the time-lapse microscopy and image analysis. Nofar Rada is thanked for the artistic work.

ארבע עד C57BL נקבה שישה בן-שבוע / CJ עכברים (הרלן, ירושלים, ישראל) שימשו בניסוי פי האגודה הערכה וההסמכה של מפרטים טיפול בבעלי חיים מעבדה. כל הפרוצדורות בוצעו בהתאם טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדה השתמש ומח&#39; תקנות חקלאות. 1. קציר חוט השדרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר באמצעות תא 2 CO. הימנע נקע בצוואר הרחם כיוון שהוא עלול לגרום נזק שורשי גנגליון בשל כוחות גזירה. מכאן ואילך, לבצע את כל השלבים בתנאים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את חיה עם 70% אתנול. שלב זה חשוב עבור עיקור למניעת השיער מגרירת דרך האיברים הפנימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את העכבר להתייבש מן אתנול. מנע כל מגע של אתנול עם האיברים הפנימיים בשל רעילות עצבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ייבוש העכבר, מקם אותו באמצעות סיכות אפרקדן(פנים למטה). מניחים את הפינים שעל כל hindlimb ו forelimb. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, לעשות חתך קו אמצע הארכת craniocaudally מהצוואר האחורי של הגב התחתון. לאחר מכן, להעלות דשי עורי באמצעות מלקחיים בילטרלי ולחשוף הרקמה התת עורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למשש גולגולת עכבר עד שמגיע לצומת craniocervical. בעזרת מספריים בניצב החיה, בקעה את שרירי צוואר רחם עמוד שדרה בצומת craniocervical (חוליות צוואר הרחם -7), באמצעות מלקחיים כבדים. לנתח את עמוד שדרת caudally, ולהסיר את עמוד השדרה עם מלקחיים כבדים עד שהגיע לרמת המותני (רמת גפיים אחורית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע חיתוך רוחב זנב מלא ברמת עמוד השדרה המותני (חוליות 5 th) באמצעות מלקחיים כבדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלגלים את העכבר מעל (עם הפנים כלפי מעלה). אין צורך לכסות את החתך מאז DRG מופק רמות שדרה תחתונות ולא צוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמצמו על קו האמצע מהצוואר אל הבטן, לחזור בועור רוחבי ואז לחתוך כדי לפתוח את הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את האיברים הפנימיים בתוך הצפק (כבד, טחול, לבלב, קיבה ומעי) כמקשה אחת. לאחר מכן, להסיר את איברי retroperitoneal (כלומר, כליות ולבלב). Cranially, לפתוח את בית החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים להב כירורגי, לחתוך את הצלעות, משאיר 5 מ&quot;מ של צלעות בילטרלי משם מעמוד השדרה. בשלב זה, עמוד השדרה מופרד משאר הגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את עמוד השדרה מדם עם בופר פוספט טרי קר (4 ° C) (PBS) פעמיים. </li></ol> 2. בידוד השורש הגבה גרעינים (DRG) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש stereomicroscope עם הגדלה 4X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את עמוד השדרה על פלטפורמה קולטת הלא לא חסידה (Telfa / ניילון). מקם את הפנים עמוד השדרה למעלה על האוריינטציה סקראל הזנב אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל שרירי עמוד שדרה ורקמות חיבור. השתמש צלעות כציון דרך לעצבים כפי שהםלעזוב את עמוד השדרה. צלעות גם להגן על העצבים מן הכלים כירורגיים. DRG ממוקמים בחלק הצווארי, החזי, ואתרי המותני של החוליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, מספריים באמצעות לחתוך את הגוף בחוליות קו האמצע ולחשוף את חוט השדרה ושורשי DRG ידי הכחשה לרוחב עדינה של הגוף בחוליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במרחב צלע, בצע את העצבים ההיקפיים מדיאלית לאורך לרוחב צלע אל DRG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את DRG. זה נראה כמו חלמון של &#39;ביצת עין&#39; שוכב על העצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את דיסטלי עצב צלעי אל DRG עוזב 2-3 מ&quot;מ של דיסטלי החוצפה הגרעינים, לשמש הכחשה. זה &quot;זנב&quot; יוסר לאחר הקטיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחוז העצב באמצעות מלקחיים. צביטת הגוף DRG עצמו יגרום נזק לתאים עצביים יש להימנע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתקרב DRG proximally יחד התקשרותו אל חוט השדרה, באמצעות הקדמי שלה ושורשים אחוריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל הכחשה עדינה על DRG ידי משייכת EFעצב ferent (גדם עצב צלעי) רוחבי, וחתך את הקדמי ואת האחורי שורשים הקרוב DRG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את DRG בצלחת פטרי 35 מ&quot;מ מלא DMEM טרי קר, קרח בתוספת 10% נסיוב עגל עוברית (FCS), 1%, סטרפטומיצין פניצילין, 1% חומצות אמינו לא חיוניות, ו פירובט סודיום 1%. </li></ol> 3. השרשה בצלחת פטרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את הצעדים הבאים על הקרח באמצעות פיפטה טיפים מראש מקורר כדי למנוע התמצקות ECM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת סטראו בהגדלה 2-4X, מניחים צלחת פטרי תחתית זכוכית 35 מ&quot;מ על רשת נייר. חשוב: עבודה על קרח כדי לשמור על ECM במצב נוזלי. צור נקודה בקוטר 1 מ&quot;מ (כ 20 μl) של ECM מדולדל גורם הגדילה במרכז הרשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת להדמיה ישירה, למקם את DRG במרכז המקום ECM קרוב לתחתית של המנה. הערה: התאים הסרטניים בשימוש בפרוטוקול זה הם תאים סרטניים בעכברי לבלב (KPC) establisהד מ דגימות הגידול מבודדים טרי מעכברים KPC כמתואר במקום אחר 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים 40,000 סרטן מתרבויות ומחוברות, לשטוף אותם פעם אחת עם PBS, resuspend אותם 40 ECM μl על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת ראיה ישירה של הרשת באמצעות מיקרומטר סטראו מידה 500 בכל כיוון מן DRG. בשלב זה לאט זרע 10,000 תאים / 10 μl ECM. השתמש טיפ 2-10 μl precooled להזריק את התאים קרובים לתחתית הצלחת, הימנעות ההתפשטות שלהם במטריצה ​​או הניתוק של מטריקס. (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משאיר את הכלי בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית במשך 10-15 דקות כדי לחזק. הימנע ייבוש ECM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להוסיף DMEM, שהוכן כאמור, על הקיר הצדדי של הצלחת. הוסף מספיק בינוני כדי לכסות את ECM (כ 2 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הצלחת בחזרה אל האינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלף בינוני עם בינוני טרי ביום הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיום כל 2 ימים. &lt;/ Li&gt; </ol> 4. רכישת נתונים, זמן לשגות Videomicroscopy <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 7 לאחר ההשתלה, לקחת את הצלחת עבור מיקרוסקופיה זמן לשגות. שים לב תאים מסוימים עשויים לחייב רכישה מוקדם יותר בגלל הגירה מהר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך ההדמיה לחיות, במקום צלחת בסביבה סגורה בטמפרטורה ממוצעת של 37 ± 0.1 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את התאים באמצעות מצלמת המכשיר מצמידים תשלום מושם על המיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות דיגיטציה כל 10 דקות עד 72 שעות כדי לעקוב אחרי תנועת תא בין שלושה לשישה תאים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלף בינוני לאחר 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע רכישת נתונים וניתוח פשוט באמצעות תוכנת מיקרוסקופ. </li></ol> ניתוח 5. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור יישומים מתקדמים יותר (כלומר, מעקב תא 2D או 3D) להשתמש בתוכנה מיוחדת (כגון Imaris 4D). הערה: תוכנה זו קובעת את קואורדינטות XY של תאבכל רגע נתון, יחד עם המרחק ממקור, ומהירות תנועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את המהירות הממוצעת על ידי מדידת מרחק הנסיעה בין עמדות שלאחר מכן ב 10 מרווחי דקות. חישוב מדד ההגירה הקדמי (FMI) המהווה את המרחק של חזית התא מן neurite ומתאר את התנועה חד כיווני של התאים כלפי DRG. </li></ol>

<ol>
	<li>Carter, R. L., Foster, C. S., Dinsdale, E. A., Pittam, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perineural+spread+by+squamous+carcinomas+of+the+head+and+neck,+a+morphological+study+using+antiaxonal+and+antimyelin+monoclonal+antibodies.">Perineural spread by squamous carcinomas of the head and neck, a morphological study using antiaxonal and antimyelin monoclonal antibodies.</a> J Clin Pathol. 36, 269-275 (1983).</li><li>Beard, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perineural+invasion+is+associated+with+increased+relapse+after+external+beam+radiotherapy+for+men+with+low-risk+prostate+cancer+and+may+be+a+marker+for+occult,+high-grade+cancer.">Perineural invasion is associated with increased relapse after external beam radiotherapy for men with low-risk prostate cancer and may be a marker for occult, high-grade cancer.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 19-24 (2004).</li><li>Maru, N., Ohori, M., Kattan, M. W., Scardino, P. T., Wheeler, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+the+diameter+of+perineural+invasion+in+radical+prostatectomy+specimens.">Prognostic significance of the diameter of perineural invasion in radical prostatectomy specimens.</a> Hum Pathol. 32, 828-833 (2001).</li><li>Ceyhan, G. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+neuropathy+and+neuropathic+pain--a+comprehensive+pathomorphological+study+of+546+cases.">Pancreatic neuropathy and neuropathic pain--a comprehensive pathomorphological study of 546 cases.</a> Gastroenterology. 136, 177-186 (2009).</li><li>Ceyhan, G. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotrophic+factor+artemin+promotes+pancreatic+cancer+invasion.">The neurotrophic factor artemin promotes pancreatic cancer invasion.</a> Ann Surg. 244, 274-281 (2006).</li><li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perineural+invasion+by+ductal+adenocarcinoma+of+the+pancreas.">Perineural invasion by ductal adenocarcinoma of the pancreas.</a> J Surg Oncol. 65, 164-170 (1997).</li><li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+expression+correlates+with+perineural+invasion+and+pain+in+human+pancreatic+cancer.">Nerve growth factor expression correlates with perineural invasion and pain in human pancreatic cancer.</a> J Clin Oncol. 17, 2419-2428 (1999).</li><li>Hirai, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perineural+invasion+in+pancreatic+cancer.">Perineural invasion in pancreatic cancer.</a> Pancreas. 24, 15-25 (2005).</li><li>Mitchem, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor-infiltrating+macrophages+decreases+tumor-initiating+cells,+relieves+immunosuppression,+and+improves+chemotherapeutic+responses.">Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses.</a> Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).</li><li>Kelly, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+multimutated+herpes+simplex+virus-1+effectively+treats+prostate+carcinomas+with+neural+invasion+while+preserving+nerve+function.">Attenuated multimutated herpes simplex virus-1 effectively treats prostate carcinomas with neural invasion while preserving nerve function.</a> FASEB J. 22, 1839-1848 (2008).</li><li>Dai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+survival+in+perineural+invasion+of+pancreatic+cancer,+an+in+vitro+approach.">Enhanced survival in perineural invasion of pancreatic cancer, an in vitro approach.</a> Hum Pathol. 38, 299-307 (2007).</li><li>Ayala, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-related+axonogenesis+and+neurogenesis+in+prostate+cancer.">Cancer-related axonogenesis and neurogenesis in prostate cancer.</a> Clin Cancer Res. 14, 7593-7603 (2008).</li><li>Ayala, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+antiapoptotic+paracrine+loop+in+perineural+invasion+of+prostatic+carcinoma.">Stromal antiapoptotic paracrine loop in perineural invasion of prostatic carcinoma.</a> Cancer Res. 66, 5159-5164 (2006).</li><li>Ceyhan, G. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+invasion+in+pancreatic+cancer,+a+mutual+tropism+between+neurons+and+cancer+cells.">Neural invasion in pancreatic cancer, a mutual tropism between neurons and cancer cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 374, 442-447 (2008).</li><li>Bapat, A. A., Hostetter, G., Von Hoff, D. D., Han, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perineural+invasion+and+associated+pain+in+pancreatic+cancer.">Perineural invasion and associated pain in pancreatic cancer.</a> Nat Rev Cancer. 11, 695-707 (2011).</li><li>Ketterer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcription-PCR+analysis+of+laser-captured+cells+points+to+potential+paracrine+and+autocrine+actions+of+neurotrophins+in+pancreatic+cancer.">Reverse transcription-PCR analysis of laser-captured cells points to potential paracrine and autocrine actions of neurotrophins in pancreatic cancer.</a> Clin Cancer Res. 9, 5127-5136 (2003).</li><li>Gil, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve-sparing+therapy+with+oncolytic+herpes+virus+for+cancers+with+neural+invasion.">Nerve-sparing therapy with oncolytic herpes virus for cancers with neural invasion.</a> Clin Cancer Res. 13, 6479-6485 (2007).</li><li>Gil, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+regulation+of+pancreatic+cancer+cell+invasion+by+peripheral+nerves.">Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves.</a> J Natl Cancer Inst. 102, 107-118 (2010).</li><li>Weizman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+mediate+gemcitabine+resistance+of+pancreatic+adenocarcinoma+by+upregulating+cytidinedeaminase.">Macrophages mediate gemcitabine resistance of pancreatic adenocarcinoma by upregulating cytidinedeaminase.</a> Oncogene. 33, 3812-3819 (2014).</li></ol>

This research was supported by the ICRF Barbara S. Goodman endowed research career development award (2011-601-BGPC) and a grant from the US-Israel Binational Science Foundation. No other financial disclosures from the authors are to be made.

מאמר זה מציג מודל במבחנה כי שחזר במייקרו-הסביבה של הסרטני בגומחה העצבית, מודל DRG. הסרטון מדגים את כל השלבים החל מהכרה ציוני דרך אנטומיים כגון DRG בתוך העכבר, החילוץ שלה, ולבסוף, culturing שלה ECM. שיתוף culturing DRG לצד עם תאים סרטניים מוצג גם. אין מודלים אחרים עבור במבחנת מחקר פלישת perineural המתוארים בספרות ביצוע מודל זה חיוני ללימוד במייקרו-הסביבה של נישת perineural במבחנה. הפרוטוקול המובא בסרטון יש שני שלבים קריטיים. ראשית, יש לנקוט זהירות בעת אחיזה עצב סמוכים לגוף DRG (שלב 2.7 בפרוטוקול). אחיזה או צובט את DRG עלול לגרום נזק מכני או איסכמי בלתי הפיך DRG ומונע ממנו גדל ומצמיח כאשר זורעים בצלחת פטרי. השלב הקריטי השני הוא ההשתלהשל התאים הסרטניים בצלחת פטרי בתוך ECM. חשוב לזרוע את התאים לאט ובזהירות, כדי למנוע ניוד תאי והתפשטותם על צלחת פטרי. מטרת ההשתלה היא למקם את התא במקום אחד, כדי להקל על מעקב תנועתם (מרחק וכיוון). מרגע היווצרותם microenvironment המודל ניתן לשנות על פי ההיפותזה שנבחנה. למשל, הוספת תרבית תאים שלישית כדי בצלחת פטרי (למשל, תאים לא סרטניים) מאפשרת לחוקר להשוות את יכולות גירת neurotropic של תאים שונים. יתר על כן, החוקר יכול להחיל תנאים שונים (כלומר, טמפרטורה, לחות, גורמים מסיסים, וכו &#39;) ולבחון את השפיע על יכולת פלישת תאים. מודל DRG מאפשר לחוקר לחקור את האינטראקציה בין תאים סרטניים ועצבים. כמו כן הוא משמש עבור ניסויים זמן לשגות שבו מורפולוגייםשינויי נישת perineural מודגמים בצורה זמנית. יתר על כן, התאים neuroinvasive יכולה להיות נתונה טיפולים שונים והשפעתם על האינטראקציה עם neurites של הגרעינים ניתן להעריך. לא כל שורת תאים מתאימה למודל DRG. הם צריכים להיות תאים סרטניים עם היכולת הפנימית לפלוש דרך עצב להשפיל ECM. יתר על כן, יש לציין כי כל סוג תא הסרטן יש מאפייני פלישה שונים ולכן זמן התאים צפויים ליצור קשר עם neurites DRG משתנה. לדוגמה, התאים KPC השתמשנו צורך כ -7 ימים לפלוש דרך ECM כלפי DRG ואילו תאים MiaPaca (תאי אדנוקרצינומה של הלבלב האנושי) צריך רק 72-96 שעות כדי ליצור קשר זה. הגבלה של מודל זה כוללת את בעיית אי תאימות האפשרית עם תאים אנושיים. בשל השימוש שהיא עושה DRG עכבר, האינטראקציה בין חלבונים אנושיים ועכבר לא יכול תמיד להיות הפגינו כאשר huתאים סרטניים אדם משמשים. בכל פעם מתכנן להשתמש במודל זה עם שני המינים השונים, ההומולוגיה של חלבון הבחן צריכה להיבדק ואם יש הומולוגיה גבוהה assay הוא אמורה להיות מתאים להערכת אינטראקציות בין חלבונים. וכן, זה צריך לזכור כי assay DRG כפי שהוצע בפרוטוקול זה מייצג את המיקרו-הסביבה העצבית כולל תאים אחרים, לא רק נוירונים (כלומר, תאי שוואן, פיברובלסטים, מקרופאגים, וכו &#39;). לפיכך, אוכלוסיות תאים ספציפיים לא ניתן לבדוק באופן ספציפי.

גידולים מוצקים להפיץ בשלוש דרכים עיקריות: פלישה ישירה, ממרח הלימפה, והתפשטות hematogenic. עם זאת, יש אמצעי הרביעי של התפשטות סרטן זה התעלם לעתים קרובות, הפצה לאורך עצבים. פלישה עצבית סרטנית (CNI) היא מסלול ידוע של התפשטות הסרטן, במיוחד סרטן של הראש והצוואר, 1 הערמונית 2, 3 ולבלב. CNI 4-8 מתרחש בלמעלה מ 80% של אנשים עם אדנוקרצינומה של לבלב, מוביל כדי גידול retroperitoneal התפשט עצבי גנגליון צליאק. יש תאים סרטניים neurotropic אלה יכולת ייחודית להעביר בכיוון אחד לאורך עצבים כלפי מערכת העצבים המרכזית (CNS). 9 ממצא זה מצביע על כך microenvironment perineural יכול להיות מנוצלת על ידי תאי סרטן, מתן הגורמים התומכים גידול ממאיר. אחד הדגמים כמה במבחנה למחקר CNI הוא הגרעינים השורש הגבי (DRG) / דגם תאים סרטניים. mod זהאל משמש לעתים קרובות כדי לחקור את האינטראקציה בין תאי paracrine stroma והסרטן עצביים. 10-18 במודל זה, עכבר או שורות תאים סרטניים אנושיות גדלות תאי מטריקס (ECM) סמכו הכנות של DRG המתורבת טרי ניתק. מאמר וידאו זה מציג את היישום של במבחנה CNI ב אדנוקרצינומה ductal הלבלב.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Operating microscope</td><td>Leica</td><td>M205</td><td></td></tr><tr><td>Time Lapse System</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Surgical blade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z309036</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3271</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dishes, glass bottom</td><td>de groot</td><td>60-627860</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cold PBS</td><td>Biological industries</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biological industries</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Rhenium</td><td>10108165</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin and streptomycin</td><td>Biological industries</td><td>01-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Biological industries</td><td>03-042-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Biological industries</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>Growth factor-depleted matrigel</td><td>Trevigen</td><td>3433-005-01</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro modeling of cancerous neural invasion: the dorsal root ganglion model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

<html> לדימות באמצעות מיקרוסקופיה וידאו, DRG ניתן לראות הנבטה neurites 5-7 ימים לאחר ההשתלה בעוד תאים סרטניים נודדות הרחק ממושבות שלהם כלפי DRG. עד היום ה -7 לאחר ההשתלה, התאים הסרטניים לבוא במגע עם neurites (איור 2). מדד ההגירה קדימה של תאי סרטן הלבלב השתמשו בפרוטוקול הוא 3-4 לקפל גבוה יותר מזה של שורות תאים אחרים (QLL2, B16F) (איור 3 א). איור 3 ב מציג X נציג ו- Y לתאם גרף, המתאר את נתיב הגירה של תא סרטני KPC במגע עם העצב; ניתוח videomicroscopy זמן לשגות הראה הבדלים בתנועה קדימה אבל לא מהיר בין תאי KPC ותאים שאינם פולש (איור 3 ג-ד). <html> איור 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52,990 / 52990fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1:. איור סכמטי של הפרוטוקול <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52990/52990fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52990/52990fig2.jpg" /> איור 2:. תא סרטני הפלישה לאורך נוירונים של DRG (א) DRG (למעלה) תאים סרטניים (למטה) ביום 0 לאחר זריעה (הגדלה 5X). (ב) DRG וסרטן תאי ביום 7 לאחר הזריעה (גדלת 5X). (ג) תאים סרטניים נודדים לאורך הנוירון DRG (חיצים). כל הברים מייצגים 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52990/52990fig2large.jpg" target="_blank">לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> בתוך-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52990/52990fig3.jpg" /> איור 3:. השורש הגבי גנגליון (DRG) נוירונים להשרות CNI (א) מדד הפלישה העצבים של תאים סרטניים MiaPaCa2, תאים KPC, QLL2, ותאי NIH3T3. (ב) לתאם גרף המתאר את נתיב הגירה של תא סרטני KPC במגע עם העצב (אדום) ותא QLL2 (סגול). קואורדינטות Y ו- X מוצגות. (N = 12-20 בכל קבוצה). (ג) ניתוח של המרחק ממקור של תאים נודדים סרטן QLL2 עם קשר אקסונלית ו- (ד) תאים סרטניים KPC (n = 20). הכיוון של גירה היה כל זמן לעבר גנגליון העצב. ערכי P ב (א) חושבו על ידי מבחן t דו-צדדי סטודנטים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52990/52990fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model at JoVE.com

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

במבחנת דוגמנות של פלישה העצבית סרטנית: מודל גנגליון השורש הגבה

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

in-vitro-modeling-cancerous-neural-invasion-dorsal-root-ganglion

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

9.0K Views.  Rambam Medical Healthcare Campus. This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

Video: In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, radiation, and chemotherapy, locoregional recurrences and distant metastases occur at higher rates, and overall survival is decreased by 40% compared to HNSCC without PNI. In vitro studies of the pathways involved in HNSCC PNI have historically been challenging given the lack of a consistent, reproducible assay. Described here is the adaptation of the dorsal root ganglion (DRG) assay for the examination of PNI in HNSCC. In this model, DRG are harvested from the spinal column of a sacrificed nude mouse and placed within a semisolid matrix. Over the subsequent days, neurites are generated and grow in a radial pattern from the cell bodies of the DRG. HNSCC cell lines are then placed peripherally around the matrix and invade preferentially along the neurites toward the DRG. This method allows for rapid evaluation of multiple treatment conditions, with very high assay success rates and reproducibility.

Perineural invasion (PNI) is a common feature of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), conferring lower survival rates. Its mechanisms are poorly understood. Utilizing neurites generated from murine dorsal root ganglia confined to a semisolid matrix, the pathways involved in the PNI of HNSCC cell lines can be investigated.

מודל הפלישה Perineural ב קרצינומה תא ראש וצוואר קשקש

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Cancer Research

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve microenvironment. This type of invasion is exhibited by a variety of cancer types, and very frequently is found in pancreatic cancer. The microscopic size of nerve fibers within mouse pancreas renders the study of PNI difficult in orthotopic murine models. Here, we describe a heterotopic in vivo model of PNI, where we inject syngeneic pancreatic cancer cell line Panc02-H7 into the murine sciatic nerve. In this model, sciatic nerves of anesthetized mice are exposed and injected with cancer cells. The cancer cells invade in the nerves proximally toward the spinal cord from the point of injection. The invaded sciatic nerves are then extracted and processed with OCT for frozen sectioning. H&amp;E and immunofluorescence staining of these sections allow quantification of both the degree of invasion and changes in protein expression. This model can be applied to a variety of studies on PNI given its versatility. Using mice with different genetic modifications and/or different types of cancer cells allows for investigation of the cellular and molecular mechanisms of PNI and for different cancer types. Furthermore, the effects of therapeutic agents on nerve invasion can be studied by applying treatment to these mice.

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

We describe an in vivo murine model of perineural invasion by injecting syngeneic pancreatic cancer cells into the sciatic nerve. The model allows for quantification of the extent of nerve invasion, and supports investigation of the cellular and molecular mechanisms of perineural invasion.

מודל מאתר בעצב In Vivo של הפלישה Perineural

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

הזרקת גנגליון שורש הגבה ו שורש הגבה Crush פגיעה כמודל להתחדשות החושית אקסון

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

The Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer

Perineural invasion is a phenotype in which cancer surrounds or invades the nerves. It is associated with poor clinical outcome for head and neck squamous cell carcinoma and other cancers. Mechanistic studies have shown that the molecular crosstalk between nerves and tumor cells occurs prior to physical interaction. There are only a few in vivo models to study perineural invasion, especially to investigate early progression, before physical nerve-tumor interactions occur. The chick chorioallantoic membrane model has been used to study cancer invasion, because the basement membrane of the chorionic epithelium mimics that of human epithelial tissue. Here we repurposed the chick chorioallantoic membrane model to investigate perineural invasion, grafting rat dorsal root ganglia and human head and neck squamous cell carcinoma cells onto the chorionic epithelium. We have demonstrated how this model can be useful to evaluate the ability of cancer cells to invade neural tissue in vivo.&#160;

The Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer

Perineural invasion is an aggressive phenotype for head and neck squamous cell carcinomas and other tumors. The chick chorioallantoic membrane model has been used for studying angiogenesis, cancer invasion, and metastasis. Here we demonstrate how this model can be utilized to assess perineural invasion in vivo.

ממברנה של צ'יק כוראלאנטוניק במודל Vivo להערכת הפלישה לתוך הראש ולסרטן הצוואר

Perineural invasion is a phenotype in which cancer surrounds or invades the nerves. It is associated with poor clinical outcome for head and neck squamous ...

Medicine

מודל מבחנה מתקדם לחקר רגישות יתר עצבית בתרביות DRG

Harvesting, Embedding, and Culturing Dorsal Root Ganglia in Multi-compartment Devices to Study Peripheral Neuronal Features

The most common peripheral neuronal feature of pain is a lowered stimulation threshold or hypersensitivity of terminal nerves from the dorsal root ganglia (DRG). One proposed cause of this hypersensitivity is associated with the interaction between immune cells in the peripheral tissue and neurons. In vitro models have provided foundational knowledge in understanding how these mechanisms result in nociceptor hypersensitivity. However, in vitro models face the challenge of translating efficacy to humans. To address this challenge, a physiologically and anatomically relevant in vitro model has been developed for the culture of intact dorsal root ganglia (DRGs) in three isolated compartments in a 48-well plate. Primary DRGs are harvested from adult Sprague Dawley rats after humane euthanasia. Excess nerve roots are trimmed, and the DRG is cut into appropriate sizes for culture. DRGs are then grown in natural hydrogels, enabling robust growth in all compartments. This multi-compartment system offers anatomically relevant isolation of the DRG cell bodies from neurites, physiologically relevant cell types, and mechanical properties to study the interactions between neural and immune cells. Thus, this culture platform provides a valuable tool for investigating treatment isolation strategies, ultimately leading to an improved screening approach for predicting pain.

מחבר זרקור: מודלים במבחנה ו- In Vivo לשיפור יעילות הטיפול בכאב כרוני

This protocol provides a technique to harvest and culture explanted dorsal root ganglion (DRG) from adult Sprague Dawley rats in a multi-compartment (MC) device.

קציר, הטבעה וטיפוח של גרעיני שורש גבי בהתקנים מרובי תאים לחקר תכונות עצביות היקפיות

The most common peripheral neuronal feature of pain is a lowered stimulation threshold or hypersensitivity of terminal nerves from the dorsal root ganglia ...

Bioengineering

Establishing a Three-dimensional Co-culture Model of Murine Dorsal Root Ganglia and Cancer Cells: An In Vitro Model to Study Perineural Cancer Cell Invasion

Source: Huyett, P. et al. <a href="https://www.jove.com/video/55043" target="_blank">A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma.</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate the procedure for developing an in vitro perineural cancer cell invasion model by co-culturing mouse dorsal root ganglion and neurotropic cancer cells. The model can be utilized to conduct cancer assays, producing rapid and reproducible results.

הקמת מודל תלת-ממדי של תרבית משותפת של גרעיני שורש מורין דורסלי ותאים סרטניים: מודל במבחנה לחקר פלישת תאי סרטן פריעצביים

Source: Huyett, P. et al. A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate the ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Head and Neck Cancer

Assays & techniques

Murine Perineural Invasion Model: Generating an In Vivo Model to Simulate Perineural Invasion in Mouse Sciatic Nerve

Source: Deborde, S. et al. <a href="https://www.jove.com/video/56857" target="_blank">An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion.</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we develop an in vivo mouse model for perineural invasion by injecting pancreatic cancer cells into the sciatic nerve. This model helps quantify the extent of invasion and study the interactions between cancer cells and nerves.

מודל הפלישה הפרי-עצבית של מורין: יצירת מודל In Vivo להדמיית פלישה פרי-עצבית בעצב הסיאטי של עכבר

Source: Deborde, S. et al. An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion. J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we develop an in vivo mouse ...

Cancers of the Nervous System

In vivo studies

Modeling Cancerous Neural Invasion In Vitro: A Method to Co-culture Dorsal Root Ganglia and Cancer Cells

Source: Na&#39;ara, S. et al. <a href="https://www.jove.com/video/52990" target="_blank">In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model.</a> J. Vis. Exp. (2016)
In this video, we demonstrate an in vitro method for co-culturing DRG and cancer cells to study neurotropism and neural invasion.

מידול פלישה עצבית סרטנית במבחנה: שיטה לתרבית משותפת של גרעיני שורש גבי ותאים סרטניים

Source: Na&#39;ara, S. et al. In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model. J. Vis. Exp. (2016)
In this video, we ...

במבחנת דוגמנות של פלישה העצבית סרטנית: מודל גנגליון השורש הגבה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מודל הפלישה Perineural ב קרצינומה תא ראש וצוואר קשקש

מודל מאתר בעצב In Vivo של הפלישה Perineural

הזרקת גנגליון שורש הגבה ו שורש הגבה Crush פגיעה כמודל להתחדשות החושית אקסון

ממברנה של צ'יק כוראלאנטוניק במודל Vivo להערכת הפלישה לתוך הראש ולסרטן הצוואר

קציר, הטבעה וטיפוח של גרעיני שורש גבי בהתקנים מרובי תאים לחקר תכונות עצביות היקפיות

קציר, הטבעה וטיפוח של גרעיני שורש גבי בהתקנים מרובי תאים לחקר תכונות עצביות היקפיות

קציר, הטבעה וטיפוח של גרעיני שורש גבי בהתקנים מרובי תאים לחקר תכונות עצביות היקפיות

הקמת מודל תלת-ממדי של תרבית משותפת של גרעיני שורש מורין דורסלי ותאים סרטניים: מודל במבחנה לחקר פלישת תאי סרטן פריעצביים

מודל הפלישה הפרי-עצבית של מורין: יצירת מודל In Vivo להדמיית פלישה פרי-עצבית בעצב הסיאטי של עכבר

מידול פלישה עצבית סרטנית במבחנה: שיטה לתרבית משותפת של גרעיני שורש גבי ותאים סרטניים