פרוטוקול זה מאפשר מחקר in vivo של אינטראקציות מוקדמות בין תאים סרטניים ועצבים ואת המחקר של מסלולים מולקולריים של פלישה עצבית בסרטן. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם זמן הניסוי הקצר עם פוטנציאל ללמוד פלישה פרינורלית ופנוטיפים סרטן אחרים באותו ניסוי. לפני שאנחנו מנסים טכניקה זו בפעם הראשונה, אנו ממליצים להתאמן קידוח ביצים מסחריות שאינן מופרות וקצירת גנגליה שורש הגב כדי לייעל את הטכניקה שלך עבור שני ההליכים.
הדגמת ההליך תהיה מין ליו, עמיתת מחקר מהמעבדה שלי. התחילו באינקובציה של שש ביציות מופרות מסחריות ללא פתוגן לכל קבוצת ניסוי באינקובטור לחות ביצה בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס ו-54% לחות ביום הראשון שלאחר ההפריה במשך שמונה ימים עם סיבוב שעתי. ביום השמיני, לנקות את העור הגבי של חולדה המתת סנפיר עם 70% אתנול ולהשתמש מספריים כדי להסיר את עמוד השדרה.
הפרד את אזורי צוואר הרחם, בית החזה והמותני והצב את חלקי עמוד השדרה בצלחת תרבות של 10 ס"מ עם PBS כדי לשמור על דגימות הרקמה hydrated. באמצעות מספריים עדינים של העצם, פתח את עצמות החוליות של בית החזה וצוואר הרחם בהיבט הגבי והגחוני כדי להפריד את עמוד השדרה לשני חצאים רוחביים ולהמקם את חלקי הרקמה בצלחת נקייה של 10 ס"מ עם PBS טרי. באמצעות מדפים, לנתק בעדינות את חוט השדרה מעצמות החוליות כדי לדמיין את גנגלי השורש הגבי.
הצבת קצות של זוג מדפים עדין מוחזק תחת כל גנגליון, לתפוס את הרקמה ולמשוך אותו מן חלל העצם שבו הוא תקוע. מיד לאחר הקציר, מניחים כל גנגליון לתוך מדיום תרבות DMEM בתוספת 2%פניצילין סטרפטומיצין או Pen-Strep ו 10% סרום שור עוברי או FBS כדי לסייע במניעת זיהום חיידקי של רקמות העצבים. כאשר כל הגרביונים נקצרו, להעביר את הרקמות לתוך צלחת תרבות חדשה המכילה בינוני תרבות DMEM טרי בתוספת 2% Pen-Strep בתוספת 10% FBS ו 1.2 מיקרוגרם למיליליטר של צבע פלואורסצנטי אדום עבור אינקובציה של שעה אחת באינקובטור תרבות התא.
כדי להכין את הביצים עבור השתל גנגליון שורש הגבי, לעמעם את האור ארון זרימה למינאר והחזקת הביצה עם שם האוויר המתרחשים באופן טבעי לכיוון מקור האור, transilluminate כל ביצה כדי לבדוק את הכדאיות אפרוח שלב עוברי. זהה את ההחזקה של העובר המתפתח לממברנה הכוריואלנטואית ככלי נע כהה המחובר לממברנה של הביצה ולהשתמש בעיפרון כדי לסמן את הקובץ המצורף כדי למנוע התערבויות באזור זה. צייר אזור של 1.5 ס"מ באזור עם כלי דם טובים לפחות שני סנטימטרים מהקובץ המצורף לעובר כדי לשמש כאזור חלון הפעלה ולצייר ריבוע של 0.5 ס"מ באזור פחות וסקולרי בערך סנטימטר אחד מחלון ההפעלה.
לאחר מכן סמן את מרכז אזור חיל האוויר. לאחר מכן, השתמש בכלי סיבובי ומקדחה תחריט עם קצת קוטר שלושה מילימטר כדי לקדוח בזהירות את קליפת הביצה בתוך הריבוע המסומן. השתמש מטליות קהה כדי להסיר את קליפת הביצה מבלי להסיר את קרום קליפת הביצה החיצוני הלבן ממש מתחת לקליפה.
השתמש במקדחה כדי לבצע בזהירות ניקוב מקדחה נקודתית בצלב המסומן באזור חיל האוויר כדי לאפשר זרימת אוויר לתוך הביצה מבלי לשבור או לפגוע בקליפה ולהוסיף 30 מיקרוליטרים של HBSS לפתיחה המרובעת מעל קרום קליפת הביצה החיצונית ללא פגע. באמצעות מחט 30 מד, לעשות ניקוב נקודתי בממברנה החיצונית בתוך השטח המרובע. לאחר מכן, החזק את הביצה עד למקור האור כדי לדמיין את שאק האוויר ולהחיל לחץ על נורת גומי טפטפת.
מניחים את נורת הטפטפת מעל ניקוב קטן בתוך שם האוויר ולשחרר את הלחץ על הנורה עד הפרדה של קרום חיצוני קרום chorioallantoic בתוך אזור חלון ההפעלה הוא ציין חוזר על צעד זה עד הפרדה מוחלטת של הממברנות מושגת. כאשר כל הביצים שונו באותו אופן, לקדוח את חלון ההפעלה המעגלי בביצה אחת דואג לא לקרוע את קרום קליפת הביצה החיצוני ולהשתמש בצד הדביק של פיסת סרט דבק כדי להסיר את כל החלקיקים רופף מן הקליפה. באמצעות מדחיסות קהות, להסיר את קליפת הביצה מהאזור שנקדח ואחריו קרום קליפת הביצה החיצוני דואג לא להציג חלקיקי פגז קטנים בתוך הביצה כדי למזער את הזיהום.
כאשר קליפת הביצה והממברנה החיצונית הוסרו כפי שהוכח, מכסים את הביצים עם קרום שעווה פרפין וממקמים את הביצים בחזרה לתוך אינקובטור הביצה ללא סיבוב עד גרפליה שורש הגב מוכנים להשתלה. להשתלת גנגליון שורש הגבי על הממברנה הכוריואלנטואית, השתמש במטלפים סטריליים עדיפים כדי לתפוס בזהירות גנגליון אחד בצלחת התרבות ולשטוף בעדינות את הרקמה במיכל של HBSS טרי. מניחים את הגנגליון על קרום chorioallantoic של ביצה אחת נזהר לא לנקב את הממברנה ולכסות את כל פתחי הביצה עם תחבושות סרט שקוף סטרילי.
כאשר כל הביצים מושתלות, מחזירים אותן לחותם הביצים במשך יומיים ללא סיבוב. בסוף הדגירה, מעבירים את הביצים לארון הזרימה למינארית ולהשתמש במספריים ומדפים כדי לפתוח את רוטב הסרט השקוף. לאחר מכן, להוסיף 0.5 למיליון תאים סרטניים שכותרתו פלואורסצנטית בחמישה microliters של HBSS על קרום chorioallantoic של כל ביצה על שני מילימטרים מכל גנגליון שורש הגב שמירה על מרחק אחיד בין הגנגליה לבין התאים.
לאחר מכן מכסים את הביצים עם רוטב סרט חדש ולהחזיר את הביצים אינקובטור ביצה במשך שבעה ימים ללא סיבוב. בסוף הדגירה, מניחים את הביצים על ספסל המעבדה העליון. השתמש מזרק כדי לניקוב ההלבשה הסרט של כל ביצה ולהחיל על 300 microliters של 4% paraformaldehyde מעל כל קרום chorioallantoic כדי להקשיח מעט את הרקמה כדי להקל על תהליך הקציר.
באמצעות מספריים, להסיר את החצי העליון של קליפת הביצה עם קרום chorioallantoic מחובר. להקטין את גודל הקליפה כשלושה סנטימטרים קוטר שמירה על החלק של קרום chorioallantoic שבו גנגליון שורש הגב ותאי הגידול הושתלו בתוך מרכז שבר הקליפה. לאחר מכן תפסו את הממברנה הכוריואלנטואית במטליות דקות וניתוק הרקמה מקליפת הביצה להעברה ל הבאר אחת של צלחת בת שש בארות המכילה שני מיליליטר של 4% פרפורמלדהיד לכל גנגליון שורש הגבי וצד תא הגידול למעלה.
השילוב של גנגליה שורש הגב לתוך קרום chorioallantoic חשוב כמו קרום chorioallantoic מספק תזונה רקמת גנגליון שורש הגב במהלך הניסוי. באופן מיקרוסקופי, גנגליון השורש הגבי נצפה בתוך רקמת החיבור של הממברנה הכוריואלנטואית וכלי הדם נראים לעתים קרובות בתוך רקמת גנגליון השורש הגבית המצביעה על כך שאספקת הדם של הממברנה הכוריואלנטואית מטפחת את הרקמה המושתלת. גידולים מושתלים מזוהים גם על קרום chorioallantoic על ידי המטוקסילין וכתמי אאוסין.
תלוי כמה פלישה קיימת, גידולים עשויים להציג עם לא לאיים גידול רבים פולשים רקמת החיבור. בניסוי מייצג זה, הדמיה עם ניתוח פלואורסצנטי מיזוג גילה פלישה מוגברת של גנגליון השורש הגבי בממברנות chorioallantoic מושתל עם תאים סרטניים מעל להביע את קולטן גלנין 2 לעומת שליטה בגידולים. זה שימושי וחסכוני במודל vivo של פלישה פרינורלית ניתן לשכפל אפילו על ידי מעבדות עם משאבים מוגבלים.
