המחברים להכיר את השירותים הטכניים המסופקים על ידי המתקן ציטולוגיה מולקולרית, המתקן בעלי חיים במרכז הסרטן סלואן קטרינג אנדרטת. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים CA157686 (וונג אר) ו- P30 CA008748 (ממוריאל סלואן קטרינג לסרטן מרכז תמיכה גרנט).

כל הנהלים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה-ממוריאל סלואן קטרינג Cancer Center.
1. הכנה של תאים סרטניים
<ol><li>קציר תאים Panc02-H7 תת confluent עם 0.25% טריפסין למשך 5 דקות ב 37 º C. איסוף התאים שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל. הערה: התאים גדלים T-225 את הבקבוק, המכיל כ 12 x 106 תאים לכל הבקבוק ב 80% confluency ו 4 מ"ל טריפסין / הבקבוק משמש.</li>
	<li>Centrifuge התאים ב x 900 גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. לשטוף התאים על ידי resuspending התא הצניפה ב 1 מ"ל ל- PBS (על-ידי pipetting למעלה ולמטה פעמיים), ולהעביר ההשעיה צינור microcentrifuge 1.5 mL על קרח.</li>
	<li>Centrifuge התאים שוב ב x 900 גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולמחוק את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר. לשמור את התאים pelleted על הקרח עד זריקה.</li>
</ol>2. הכנה של עכברים, ניתוח
הערה: בן שבוע 8, זכר ונקבה C57BL/6J עכברים משמשים במחקר זה. התנאים ניתוח בעקבות החוקים IACUC של מוסדנו. כלי הנגינה סטריליים, משטח העבודה כירורגי הוא מחוטא, החיה הוא מחוטא, המנתח חובש כפפות סטריליות.
<ol><li>ביום שלפני הניתוח, עזים ומתנגד העכבר באמצעות 2% איזופלוריין ולאחר מכן להסיר את הפרווה לאורכו של עצם הירך בצד הגבי עם תער דק או סוכן להסרת שיער כימית.</li>
	<li>ביום של הניתוח, עזים ומתנגד העכברים באמצעות 2% isofluorane ב חדר אינדוקציה. לאשר האסתטיזציה על ידי גירוי קמצוץ הבוהן ואת חוסר תגובה.</li>
	<li>הוטרינר משחה למרוח את העיניים למניעת יובש תחת הרדמה.</li>
	<li>הנח את העכבר anesthetized על הצד הבטני, ולאבטח בעדינות כל איבר עם קלטת היפואלרגניים כדי ליצור מתח מתון האיבר כדי להיות מוזרק. הרדמה נשמר באמצעות איזופלוריין מועברת באמצעות מכשיר אידוי דיוק עם האף חרוט.</li>
	<li>נקה ההזרקה עם Betadine, ואז שוב עם אלכוהול 70%. חזור על תהליך זה פעמיים נוספות. ודא כי אין ופזור נשאר על המגרש כירורגי.</li>
	<li>עושים חתך 1 ס מ עם מספריים קטנות בערך 2 מ מ מתחת, במקביל עצם הירך. משכי את העור עם מלקחיים רוחבית לחשוף את השרירים שמתחת.</li>
	<li>בעצב נוסע עמוק שרירי העכוז, הדו-ראשי. להפריד בין אלה השרירים שני לאורך מטוס fascial עם מספריים קטנים ולחשוף בעצב מתחת. חינם העצב מן השרירים המקיפים באמצעות עמום.</li>
	<li>שואבים μL 3 של תאים סרטניים (כ-50,000 תאים) בגדר לתוך מזרק 10 μL. הערה: לחלופין, צייר μL 3 ל- PBS כפקד.</li>
	<li>המקום מרית מתכת קטן מתחת העצב בנקודת ההזרקה לקבלת תמיכה. תחת הדמיה עם מיקרוסקופ ויבתר, הכנס את המחט לתוך העצב נגד בסיס מתכת, להשאיר את המחט להוות מקבילה העצב ככל האפשר על ההכנסה. יש להיזהר לא לנקב דרך החלק האחורי של העצב. מזער את הטיפול של עצב ככל האפשר לאורך כל התהליך הזה.</li>
	<li>לאט לאט להחדיר לתוך העצב מעל 5 s. היווצרות של נורת באזור ההזרקה מציין זריקה טובה. אז להשאיר את המחט במקום 3 s לפני הסרת את המחט בעדינות. להשאיר את המחט במקום 3 s ממזער זרם אחורי של התאים מתוך העצב. הערה: ניתן לבצע הזרקה לכיוון העצב או חוט השדרה. חשוב להישאר עקבי בתוך קבוצה של ניסויים. אם התאים לשפוך בחוץ, החיה לא ייכללו בגליון הניתוח של הניסוי. עם ניסיון, אירועים אלה הם נדירים מאוד.</li>
	<li>להחזיר את האומץ למיקום המקורי. מכסים את העצב עם השרירים שמעליה. מתייחסים העכברים עם שיכוך כאבים הנכון ולאחר מכן סגור את העור עם התפרים ניילון 5-0.</li>
	<li>הנח את העכבר לבד בתוך כלוב נקי להשגחה במהלך ההתאוששות, עד הוא מתעורר לחלוטין מן ההרדמה. הערה: זה לוקח 5-15 דקות לבעל החיים להכרה מלאה. החיה ללא השגחה עד זה שהכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות. החיה לא יוחזר אל החברה של בעלי חיים אחרים עד החלים לחלוטין. לאחר מכן, להעריך התאוששות לפחות פעם אחת בכל 24 שעות במשך 72 h.</li>
</ol>3. חילוץ בעצב
<ol><li>ביום מנותחות #7, המתת חסד העכברים עם CO2. הנח את העכבר בצד הגחוני, לייצב את הגפיים דיסטלי באמצעות סיכות.</li>
	<li>מסירים את העור בצד הגבי של האיבר מוזרק ואת פלג הגוף העליון.</li>
	<li>באמצעות עמום, לחשוף בעצב עמוק בשריר.</li>
	<li>הקורסים העצב בין הכסל של עצם העצה. כדי לקבל גישה אל העצב על האזור חוט השדרה, הפרד בין שתי העצמות. להוסיף קודם ומספריים סגור בתחום הצר שבו ממוקם בעצב ולאחר מכן פתח את המספריים תוך החזקת העכבר. עדין, לשמור על היושרה של בעצב בזמן.</li>
	<li>בזהירות לנתח בעצב רחוק עד הסוף של עצם הירך, הציר הקרוב בחוט השדרה.</li>
	<li>הערה: פלש מרוטים. שביר מאוד ונוטה שבירת תחת מתח או טיפול כוחני.</li>
	<li>הקציר האומץ על ידי חיתוך הראשונה סופו דיסטלי. בזהירות להרים את העצב החריד את זה מרקמות סמוכים. חותכים את העצב בסוף צינתור, קרוב ככל האפשר אל היציאה שלה מן השדרה.</li>
	<li>שיא ואז דוחה אורך הפלישה באמצעות של caliper ורניה. שערוך מאקרוסקופית הזה הוא רק מעיד.</li>
</ol>4. עצבים כימות ועיבוד
<ol><li>להטביע את העצב גזור ב אוקטובר מתחם. לעשות כדי למקם את העצבים longitudinally שטוח לחלוטין על החלק התחתון של העובש ככל האפשר.</li>
	<li>מצביעים על קלטת הצד הפרוקסימלית ו דיסטלי של העצב על ידי סימון האות P ו- d</li>
	<li>המקום העצבים המוטבע על גבי קרח יבש, אם הם לא נמצאים למחלקה מיד. לדוגמה יכול להישמר ב-80 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.</li>
	<li>דוגמאות מקטע באמצעות מיקרוטום Cryostat ב 5 μm עובי ומקום מקטעים בשקופיות זכוכית. במידת האפשר, להתאים מקטעים עצב 2 עבור כל שקופית. מצביעים על הצד הפרוקסימלית של העצב.</li>
	<li>כתם השקופיות באמצעות H & E צביעת12.</li>
	<li>סריקה דיגיטלית סעיפים מוכתמים עצב עם סורק שקופיות המספק נתונים דיגיטליים ברזולוציה גבוהה.</li>
	<li>באמצעות תוכנת הדמיה, לכמת את האורך של הפלישה על ידי לחיצה על לחצן מרחק מדידה, אזור של הפלישה, או אחרים הרצוי פרמטרים. לשימוש הערכה טובה של אורך הפלישה, מקטעים מרובים (2-4) של אותו עצב.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liebig, C., Ayala, G., Wilks, J. A., Berger, D. H., Albo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perineural+invasion+in+cancer.">Perineural invasion in cancer.</a> Cancer. 115 (15), 3379-3391 (2009).</li><li>Bapat, A. A., Hostetter, G., Von Hoff, D. D., Han, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perineural+invasion+and+associated+pain+in+pancreatic+cancer.">Perineural invasion and associated pain in pancreatic cancer.</a> Nat Rev Cancer. 11 (10), 695-707 (2011).</li><li>Deborde, S., Wong, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Schwann+cells+facilitate+cancer+progression+in+nerves.">How Schwann cells facilitate cancer progression in nerves.</a> Cell Mol Life Sci. 341 (177-186), 1236361-1236416 (2017).</li><li>Abiatari, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+transcriptome+signature+of+perineural+invasion+in+pancreatic+carcinoma.">Consensus transcriptome signature of perineural invasion in pancreatic carcinoma.</a> Mol Cancer Ther. 8 (6), 1494-1504 (2009).</li><li>Ayala, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+dorsal+root+ganglia+and+human+prostate+cell+line+interaction:+redefining+perineural+invasion+in+prostate+cancer.">In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer.</a> Prostate. 49 (3), 213-223 (2001).</li><li>Gil, Z., Cavel, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+regulation+of+pancreatic+cancer+cell+invasion+by+peripheral+nerves.">Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves.</a> J Natl Cancer Inst. 102 (2), 107-118 (2010).</li><li>Deborde, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+induce+cancer+cell+dispersion+and+invasion.">Schwann cells induce cancer cell dispersion and invasion.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1538-1554 (2016).</li><li>Pour, P. M., Egami, H., Takiyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+growth+and+metastases+of+induced+pancreatic+cancer+in+relation+to+the+prognosis+and+its+clinical+implications.">Patterns of growth and metastases of induced pancreatic cancer in relation to the prognosis and its clinical implications.</a> Gastroenterology. 100 (2), 529-536 (1991).</li><li>Eibl, G., Reber, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+xenograft+nude+mouse+model+for+perineural+invasion+and+recurrence+in+pancreatic+cancer.">A xenograft nude mouse model for perineural invasion and recurrence in pancreatic cancer.</a> Pancreas. 31 (3), 258-262 (2005).</li><li>Stopczynski, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroplastic+changes+occur+early+in+the+development+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Neuroplastic changes occur early in the development of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cancer Res. 74 (6), 1718-1727 (2014).</li><li>Gil, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve-sparing+therapy+with+oncolytic+herpes+virus+for+cancers+with+neural+invasion.">Nerve-sparing therapy with oncolytic herpes virus for cancers with neural invasion.</a> Clin Cancer Res. 13 (21), 6479-6485 (2007).</li><li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections.">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (6), 655-658 (2014).</li><li>Cremer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+N-CAM+gene+in+mice+results+in+size+reduction+of+the+olfactory+bulb+and+deficits+in+spatial+learning.">Inactivation of the N-CAM gene in mice results in size reduction of the olfactory bulb and deficits in spatial learning.</a> Nature. 367 (6462), 455-459 (1994).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+(CCL2-CCR2)+signaling+axis+mediates+perineural+invasion.">The chemokine (CCL2-CCR2) signaling axis mediates perineural invasion.</a> Mol Cancer Res. 13 (2), 380-390 (2015).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFR&#945;1+released+by+nerves+enhances+cancer+cell+perineural+invasion+through+GDNF-RET+signaling.">GFR&#945;1 released by nerves enhances cancer cell perineural invasion through GDNF-RET signaling.</a> P Natl Acad Sci USA. , 02944 (2014).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

ב פרוטוקול זה נתאר ויוו מאתר מודל של הפלישה perineural המאפשר כימות של הפלישה בעצב על-ידי תאי סרטן הלבלב. מודל זה מאפשר חקר המנגנונים המולקולריים של עצב הפלישה. ניסויים מוצלחים בעזרת טכניקה זו דורשים גישה זהירה שלושה שלבים קריטיים בתהליך: 1) הזרקה של תאים סרטניים (שלבים 2.7, 2.8), 2) החילוץ של עצב...

העצבים בצורת microenvironment של גידול ספציפי מעורר סרטן הצמיחה והעברה1,2,3. הפלישה Perineural (PNI) הוא התהליך דרך איזה סרטן תאים לפלוש העצבים בולטים. זה עשוי להיחשב מסלול מיוחד של גרורות מאז הפלישה סרטן משתרע מן האתרים ממוצא לאורך העצבים. PNI נמצא בכמה סוגי סרטן כולל, הלבלב, הערמונית, ראש & צוואר, הרוק, צוואר הרחם, סרטן המעי הגס עם שכיחות 22% ועד 100%1,2. PNI מזוהה עם הכאב, מופיע עם פרוגנוזה גרועה הישרדות המחירים1,2.
פיתוח מודלים הפלישה perineural חיוני התירי את המנגנונים תאית ומולקולרית של תהליך זה, לבחון את המועמד סוכני טיפולית להפחתת PNI. שיטות במבחנה של הלומדים האינטראקציות בין סרטן ועצבים כוללות את תרבות משותפת של תאים סרטניים עם עצב explants4, עם השורש העזוב ganglions5,6,7, או עם תאים ספציפיים מן העצב microenvironment כגון שוואן תאים7. In vivo גישות, עם זאת, רלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית, כוללים את השימוש מודלים העכבר סרטן שבו סרטן הנגרם או מושתלים, יש את היתרון של הנהלת חשבונות עבור microenvironment כל העצבים. Orthotopic מודלים של סרטן הלבלב או הערמונית, PNI כבר דווח על8,9,10 , ניתן להקליט את שכיחות PNI, אך בגלל גודלו הקטן של העצבים באיברים האלה, קשה לראות העצב כולו ולכן כדי לכמת את מידת PNI. המודל שנתאר כאן הוא מודל ויוו של PNI שבה סרטן תאים מוזרקים לתוך בעצב של עכברים באמצעות הליך כירורגי פשוט11. ההשתלה הטרוטופי פולש בתוך העצב לכיוון חוט השדרה. האורך של הפלישה עצב מהאתר של הזרקת בחוט השדרה יכול למדוד, כמו גם אמצעי האחסון של הסרטן בתוך העצב. חשוב, ניתן גם לאסוף העצב פלש עבור מגוון של מבחני ובהם ניתוח מיקרוסקופי, ומולקולרית. ניתן לבחון את מגוון של תאים סרטניים, העכברים מארח גנטית שונה או מטופלים עם תרכובות מסוימות עשוי לשמש גם כן. Assay חזק זה מאפשר את התאים הסרטניים microenvironment מארח את כדי להיות שונה עבור החקירה המנגנונים PNI.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:973px;" width="973">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:340px;">Mouse</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;">Number and age variable depending on experimental needs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS)</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>Steps 1.1, 1.2, 1.3.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C-S</td>
			<td>Step 1.2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electric razor</td>
			<td>WAHL</td>
			<td>9962</td>
			<td>Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane, 250 mL</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936060</td>
			<td>Step 2.2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hypoallergenic surgical tape</td>
			<td>3M Blenderm</td>
			<td>70200419342</td>
			<td>Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Betadine Swapsticks</td>
			<td>PDI</td>
			<td>SKU 41350</td>
			<td>Step 2.4</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Webcol Alcohol Preps</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>5110</td>
			<td>Step 2.4</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile surgical tools (scissors and forceps)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">10 &#956;L Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80308</td>
			<td>Steps 2.7, 2.8</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Steel Micro spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S50823</td>
			<td>Step 2.7</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 2.7</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bupivacine, 1 g</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-NA139-0001</td>
			<td>Step 2.9. Reconstitute to 0.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">5-0 Nylon suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>698H</td>
			<td>Step 2.9</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tissue-Tek Cryomold Molds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-916</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vivo murine sciatic nerve model of perineural invasion

תאים סרטניים לפלוש העצבים באמצעות תהליך הנקרא perineural הפלישה (PNI), שבה סרטן התאים להתרבות ולהעביר ב microenvironment העצב. סוג זה של הפלישה מוצגת על ידי מגוון רחב של סוגי סרטן, והוא לעיתים קרובות מאוד נמצא סרטן הלבלב. הגודל המיקרוסקופי של סיבי עצב בתוך הלבלב העכבר הופך את המחקר של PNI קשה במודלים מאתר orthotopic. כאן נתאר מודל הטרוטופי ויוו של PNI, איפה אנחנו מזריקים syngeneic סרטן הלבלב תא קו Panc02-H7 לתוך בעצב מאתר... במודל זה, בירך את העצבים של עכברים ומורדמת חשוף, מוזרק עם תאים סרטניים. תאים סרטניים לפלוש ב העצבים הציר הקרוב לכיוון חוט השדרה מנקודת הזריקה. העצבים ממוגלה פלשו ואז חילוץ, מעובד עם OCT עבור חלוקתה קפוא. H & E ו- immunofluorescence מכתים סעיפים אלה מאפשרים כימות של שני מידת הפלישה ושינויים בביטוי חלבונים. מודל זה ניתן ליישם מגוון רחב של מחקרים על PNI בהתחשב צדדיות שלה. שימוש בעכברים עם שינויים גנטיים שונים ו/או סוגים שונים של תאים סרטניים מאפשר חקירה של מנגנונים תאית ומולקולרית PNI ועבור סוגי סרטן שונים. יתר על כן, ההשפעות של סוכני טיפולית על הפלישה עצב ניתן יהיה ללמוד על-ידי החלת טיפול אלו עכברים.

שיטה זו מתארת השתלה כירורגית של תאי סרטן הלבלב לתוך בעצב מאתר כדי ליצור מודל ויוו הפלישה עצב לכימות. איור 1 מדגימה את המיקום האנטומי של בעצב, באתר של הזרקה. איור 2 מציג את העצבים בירך שני של עכבר ערום. ניתן להשוות בעצב PBS מוזרק (משמאל) בעצ...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion at JoVE.com

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

מודל מאתר בעצב In Vivo של הפלישה Perineural

אנו מתארים ויוו מאתר מודל של הפלישה perineural באמצעות הזרקת תאי סרטן הלבלב syngeneic לתוך בעצב. המודל מאפשר כימות היקף הפלישה עצב ותומך החקירה של המנגנונים תאית ומולקולרית של פלישה perineural.

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve ...

an-in-vivo-murine-sciatic-nerve-model-of-perineural-invasion

Research

JoVE Journal

Cancer Research

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

11.9K Views.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. אנו מתארים ויוו מאתר מודל של הפלישה perineural באמצעות הזרקת תאי סרטן הלבלב syngeneic לתוך בעצב. המודל מאפשר כימות היקף הפלישה עצב ותומך החקירה של המנגנונים תאית ומולקולרית של פלישה perineural.

Video: An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased understanding of the molecular events that give rise to glioblastomas, this cancer still remains highly refractory to conventional treatment. Surgical resection of high grade brain tumors is rarely complete due to the highly infiltrative nature of glioblastoma cells. Therapeutic approaches which attenuate glioblastoma cell invasion therefore is an attractive option. Our laboratory and others have shown that tumor associated macrophages and microglia (resident brain macrophages) strongly stimulate glioblastoma invasion. The protocol described in this paper is used to model glioblastoma-macrophage/microglia interaction using in vitro culture assays. This approach can greatly facilitate the development and/or discovery of drugs that disrupt the communication with the macrophages that enables this malignant behavior. We have established two robust coculture invasion assays where microglia/macrophages stimulate glioma cell invasion by 5 - 10 fold. Glioblastoma cells labelled with a fluorescent marker or constitutively expressing a fluorescent protein are plated without and with macrophages/microglia on matrix-coated polycarbonate chamber inserts or embedded in a three dimensional matrix. Cell invasion is assessed by using fluorescent microscopy to image and count only invasive cells on the underside of the filter. Using these assays, several pharmacological inhibitors (JNJ-28312141, PLX3397, Gefitinib, and Semapimod), have been identified which block macrophage/microglia stimulated glioblastoma invasion.

Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.

מבחני Coculture ללמוד מקרופאג Microglia גירוי של גליובלסטומה הפלישה

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm3. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.

In vivo מודל השפעת בדיקה של היפוקסיה על גרורות של גידולים

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, radiation, and chemotherapy, locoregional recurrences and distant metastases occur at higher rates, and overall survival is decreased by 40% compared to HNSCC without PNI. In vitro studies of the pathways involved in HNSCC PNI have historically been challenging given the lack of a consistent, reproducible assay. Described here is the adaptation of the dorsal root ganglion (DRG) assay for the examination of PNI in HNSCC. In this model, DRG are harvested from the spinal column of a sacrificed nude mouse and placed within a semisolid matrix. Over the subsequent days, neurites are generated and grow in a radial pattern from the cell bodies of the DRG. HNSCC cell lines are then placed peripherally around the matrix and invade preferentially along the neurites toward the DRG. This method allows for rapid evaluation of multiple treatment conditions, with very high assay success rates and reproducibility.

Perineural invasion (PNI) is a common feature of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), conferring lower survival rates. Its mechanisms are poorly understood. Utilizing neurites generated from murine dorsal root ganglia confined to a semisolid matrix, the pathways involved in the PNI of HNSCC cell lines can be investigated.

מודל הפלישה Perineural ב קרצינומה תא ראש וצוואר קשקש

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. Here we describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. With appropriate shielding, the irradiation targets the lower abdominal/pelvic region of the mouse, sparing the brain, in an effort to model radiation treatment received by individuals with pelvic cancers. We deliver an irradiation dose that is sufficient to induce fatigue-like behavior in mice, measured by voluntary wheel-running activity (VWRA), without causing obvious morbidity. Since wheel running is a normal, voluntary behavior in mice, its use should have little confounding effect on other behavioral tests or biological measures. Hence, wheel running can be used as a feasible outcome measure in understanding the behavioral and biological correlates of fatigue. CRF is a complex condition with frequent comorbidities, and likely has causes related both to cancer and its various treatments. The methods described in this paper are useful for investigating radiation-induced changes that contribute to the development of CRF and, more generally, to explore the biological networks that can explain the development and persistence of a peripherally-triggered but centrally-driven behavior like fatigue.

We describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. The selected non-lethal irradiation dose leads to a week-long reduction in voluntary wheel-running activity.

במודל עכבר של עייפות הנגרם על ידי הקרנה ההיקפית

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

נעים כלפי מעלה: פשוט וגמיש במבחנה הפלישה תלת מימדי Assay פרוטוקול

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic probes to provide quantitative information on the chemical tumor microenvironment (TME), including pO2, pH, redox status, concentrations of interstitial inorganic phosphate (Pi), and intracellular glutathione (GSH). In particular, an application of a recently developed soluble multifunctional trityl probe provides unsurpassed opportunity for in vivo concurrent measurements of pH, pO2 and Pi in Extracellular space (HOPE probe). The measurements of three parameters using a single probe allow for their correlation analyses independent of probe distribution and time of the measurements.

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Low-field (L-band, 1.2 GHz) electron paramagnetic resonance using soluble nitroxyl and trityl probes is demonstrated for assessment of physiologically important parameters in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.

אין ויוו הערכת EPR pH, pO2, מצב חמצון-חיזור, ואת ריכוזים של פוספט גלוטתיון ב Microenvironment הגידול

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly its immune-components, is vital to the prognosis and prediction of treatment outcomes, especially those of immunotherapy. TME immune-components are composed of different subsets of tumor-infiltrating immune cells assessable by multi-color FACS. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is among the deadliest malignances lacking good treatment options, thus an urgent and unmet medical need. One important reason for its non-responsiveness to various therapies (chemo-, targeted, I/O) has been its abundant TME, consisting of fibroblasts and leukocytes that protect tumor cells from these therapies. Orthotopically implanted PDAC is believed to more accurately recapture the TME of human pancreatic cancers than conventional subcutaneous (SC) models.
Homograft tumors (KPC) are transplants of mouse spontaneous PDAC originating from genetically engineered KPC-mice (KrasG12D/+/P53-/-/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). The primary tumor tissue is cut into small fragments (~2 mm3) and transplanted subcutaneously (SC) to the syngeneic recipients (C57BL/6, 7&#8211;9 weeks old). The homografts were then surgically orthotopically transplanted onto the pancreas of new C57BL/6 mice, along with SC-implantation, which reached tumor volumes of 300&#8211;1,000 mm3 by 17 days. Only tumors of 400&#8211;600 mm3 were harvested per approved autopsy procedure and cleaned to remove the adjacent non-tumor tissues. They were dissociated per protocol using a tissue dissociator into single-cell suspensions, followed by staining with designated panels of fluorescently-labeled antibodies for various markers of different immune cells (lymphoid, myeloid and NK, DCs). The stained samples were analyzed using multi-color FACS to determine numbers of immune cells of different lineages, as well as their relative percentage within tumors. The immune profiles of orthotopic tumors were then compared to those of SC tumors. The preliminary data demonstrated significantly elevated infiltrating TILs/TAMs in tumors over the pancreas, and higher B-cell infiltration into orthotopic rather than SC tumors.

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

The experimental procedure on the immunophenotyping of murine orthotopic PDAC homografts aims at profiling the tumor immuno-microenvironment. Tumors are orthotopically implanted via surgery. Tumors of 200&#8211;600 mm3 in size were harvested and dissociated to prepare single-cell suspensions, followed by multi-immune marker FACS analysis using different fluorescently-labeled antibodies.

Immunophenotyping של Orthotopic מאותו מין (Syngeneic) של KPC העיקרי מאתר אדנוקרצינומה Ductal הלבלב על ידי Cytometry זרימה

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great significance. Migration assays provide basic insight of cell movement at a 2D level, whereas invasion assays are more physiologically relevant, mimicking in vivo cancer cell dislodgment from the original site and invading through the extracellular matrix. The current protocol provides a single workflow for migration and invasion assays. Together with the integrated automated microscopic camera for real-time HD images and built-in analysis module, it gives researchers a time-efficient, simple and reproducible experimental option. This protocol also includes substitutions for the consumables and alternative analysis methods for users to choose from.

The current protocol describes an integrated method investigating cancer cell migration and invasion on a single platform in real-time, providing an easily reproducible and time-efficient option to study cell mobility and morphology.

זרימת עבודה פשוטה הגירה/הפלישה באמצעות Imager אוטומטיות של תאים חיים

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells

Endometrial cancer is the most common gynecologic malignancy in North America and the incidence is rising worldwide. Treatment consists of surgery with or without adjuvant therapy depending on lymph node involvement as determined by lymphadenectomy. Lymphadenectomy is a morbid procedure, which has not been shown to have a therapeutic benefit in many patients, and thus a new method to diagnose lymph node metastases is required. To test novel imaging agents, a reliable model of endometrial cancer with retroperitoneal lymph node metastases is needed. The VX2 endometrial cancer model has been described frequently in the literature; however, significant variation exists with respect to the method of model establishment. Furthermore, no studies have reported on the use of cultured VX2 cells to create this model as only cells propagated in vivo have been previously used. Herein, we present a standardized surgical method and post-operative monitoring method for the establishment of the VX2 endometrial cancer model and report on the first use of cultured VX2 cells to create this model.

This protocol presents a standardized method to grow VX2 cells in culture and to create an orthotopic VX2 model of endometrial cancer with retroperitoneal lymph node metastases in rabbits. Orthotopic endometrial cancer models are important for the pre-clinical study of novel imaging modalities for the diagnosis of lymph node metastases.

מודל הסרטן רירית הרחם אורתוטופית עם לימפדנופתיה הצפק מתוצרת ב Vivo מופץ ומתורבת VX2 תאים

Endometrial cancer is the most common gynecologic malignancy in North America and the incidence is rising worldwide. Treatment consists of surgery with or ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented with increasing depth, the incidence rate of cutaneous melanoma has shown a rapid and continuous increase during recent decades. In order to find effective preventative methods, it is important to understand the early steps of melanoma initiation in the skin. Previous data has demonstrated that follicular melanocyte stem cells (MCSCs) in the adult skin tissues can act as melanoma cells of origin when expressing oncogenic mutations and genetic alterations. Tumorigenesis arising from melanoma-prone MCSCs can be induced when MCSCs transition from a quiescent to active state. This transition in melanoma-prone MCSCs can be promoted by the modulation of either hair follicle stem cells&#39; activity state or through extrinsic environmental factors such as ultraviolet-B (UV-B). These factors can be artificially manipulated in the laboratory by chemical depilation, which causes transition of hair follicle stem cells and MCSCs from a quiescent to active state, and by UV-B exposure using a benchtop light. These methods provide successful spatial and temporal control of cutaneous melanoma initiation in the murine dorsal skin. Therefore, these in vivo model systems will be valuable to define the early steps of cutaneous melanoma initiation and could be used to test potential methods for tumor prevention.

The following procedure describes a method for spatial and temporal control of melanocytic tumor initiation in murine dorsal skin, using a genetically engineered mouse model. This protocol describes macroscopic as well as microscopic cutaneous melanoma initiation.

שליטה מרחבית וטמפורלית של מלנומה מורין ייזום מוטציה תאי גזע מלנוציט

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...