Authors thank Mr. Kotaro Okubo for the kind assistance with SEM imaging. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science Grant-in-Aid for Basic Research (B) (20310069), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (25880021), and by research grants from the Kurata Memorial Hitachi Science and Technology Foundation and the Nippon Sheet Glass Foundation for Materials Science and Engineering.

1. הכנת Tio 2 -coated זכוכית Coverslip <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספר coverslips באמצעות חרט יהלומים. זה לא רק עוזר כדי לעקוב אחר כל coverslips אלא גם כדי להבטיח שהצד הנכון של המדגם פונה כלפי מעלה. נקה את coverslips, הראשון תחת זרם DDH 2 O, לאחר מכן על ידי טבילתם בפתרון פיראניה (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1). לאחר 10 דקות, לשטוף ביסודיות את coverslips, 8 פעמים בDDH 2 O. יבש coverslips תחת N זרימת 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר Tio 2 יעד במערכת רדיו בתדר (RF) המקרטעת. צרף את coverslips על בעל מדגם של הציוד המקרטעת באמצעות קלטת polyimide. מניחים את בעל המדגם בתא המקרטעת. לפנות את החדר עד שהלחץ מגיע 2.0 × 10 -4 אבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את גז Ar לתוך התא ולהגדיר את הלחץ בתצהיר לmTorr 4.0. תוך שמירה על התריס סגור, להגדיל בהדרגהכוח RF 70 W. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התריס וגמגום במשך 15 דקות כדי להשיג סרט בעובי של 120-150 ננומטר (איור 1: שלב). שיעור צמיחה של הסרט צריך להיות נגזר לכל מכונה. </li></ol> ציפוי משטח 2. עם סרטים ניידים דוחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hydrophilize משטח Tio 2 על ידי טיפול במדגם עם O 2 פלזמה, בעקבות הוראות הניתנות על ידי היצרן של כור הפלזמה. אנחנו מתייחסים למדגם במשך 5 דקות ב 200 W עם O 2 זרימה של 100 SCCM. לטבול את המדגם בDDH 2 O ולאשר כי פני השטח הוא סופר-הידרופילית. ייבש את המשטח ביסודיות תחת N זרימת 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 octadecyltrichlorosilane מ&quot;מ פתרון (OTS) על ידי הוספת 39.6 OTS μl 100 מיליליטר טולואן. לטבול את המדגם בפתרון לשעה 1 ב RT. לנהל את הצעד הזה בתוך 2 שקית N -filled כפפה (איור 1: שלב ב &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר מולקולות physisorbed, sonicatדואר המדגם בטולואן, אצטון, אתנול, וDDH 2 O למשך 5 דקות כל אחד, על מנת ש. יש לשטוף את המדגם ארבע פעמים בDDH הטרי 2 O ולייבש את המשטח מתחת N זרימת 2. המשטח צריך להיות הידרופובי עם זווית מגע של 100-110 °. </li></ol> דפוסים משטח 3. אקס-Situ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה בזרימה למינרית מכסה המנוע, לצייר כמה שריטות עם חרט יהלומים על פני השטח. הסימנים לעזור בשמירה על המסלול של אזורי מעובד וגם להביא מיקרוסקופים אל מוקד. לעקר את הדוד מצופה OTS 2 על ידי טבילת המדגם באתנול 70% במשך 5 דקות. לאחר מכן לשטוף את המדגם פעמיים בDDH 2 O. מעוקר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המדגם בצלחת בגודל 35 מ&quot;מ, ולהוסיף 2 מיליליטר של מדיום גידול PC12 (ראה שלב 4.2). דגירה במשך 3 שעות בחממה CO 2 (37 מעלות צלזיוס). הליך זה נועד לתת albumins הסרום לספוג על פני השטח. albumins נספח לעכב הספיחה הבאה של הגנה של מחזור שניתוספות ותאים (איור 1: שלב ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן ההמתנה, להגדיר מיקרוסקופ פלואורסצנטי ההפוך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מנורת הקשת, הכנס את קוביית מסנן UV, ולהגדיר את העדשה האובייקטיבית ל20X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את עוצמת אור ש( W סנטימטר -2) באמצעות מד UV-עוצמה, ולחשב זמן t קרינה (בשניות) למינון של ד (ב-2 סנטימטרים J) כ: t = ד / אני. לדוגמא, כדי להקרין במינון של 200 סנטימטר J -2 שימוש במקור אור של סנטימטר 600 mW -2, נדרש 333 שניות של הקרנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרומטר במה ולסגור את סרעפת השדה להגדיר את הגודל של האזור שמוקרן, למשל, 200 מיקרומטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה 3 שעות, להשלים בינוני עם 200 μl של 3.0 מיליליטר מ&quot;ג -1 קולגן מסוג IV (Col-IV; מיליליטר מיקרוגרם סופי ריכוז 300 -1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הצלחת בגודל 35 מ&quot;מ לבמה מיקרוסקופ. מצא מ &#39;השריטההארון, להתמקד מיקרוסקופ על פני השטח המדגם, ולהקרין UV-אור במינון של 200 סנטימטר J -2 (איור 1: שלב ד &#39;). האזור של קרינת UV ניתן לשנות או על ידי התאמת הפתיחה של הסרעפת השדה או על ידי החלפת סרעפת השדה עם מסכת מתכת של גיאומטריה בוררות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיום עם מדיום גידול טרי (ללא Col-IV), ומניח את המדגם בחזרה בחממה. </li></ol> תרבות 4. סלולארי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות השגרתית של תאי PC12 מתבצעת על צלחת פלסטיק מצופה קולגן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למעייל צלחת רקמות תרבות 60 מ&quot;מ עם Col-IV, להרטיב ראשון את פני השטח עם DDH 2 O ולשאוב את כל DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 300 מיקרוגרם מיליליטר -1 Col-IV על ידי דילול הפתרון המקורי (3 מ&quot;ג מיליליטר -1) 10x עם DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של 300 מיליליטר מיקרוגרם -1 Col-IV לכל צלחת 60 מ&quot;מ. תן הפתרון התפשט על פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לא יבשהוא המנה בזרימה למינרית כ 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את המשטח פעמיים עם 4 מיליליטר של פוספט שנאגרו מלוח של Dulbecco (D-PBS). כאשר לא משתמש בצלחת המצופה מייד, יש לשטוף את הצלחת פעם אחת עם 4 מיליליטר של DDH 2 O. לאחר aspirating DDH 2 O, לאחסן את המנה בחממה. נסה לא לשמור את זה מאוחסן במשך יותר משבועיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי PC12 גדלים במדיום גידול שמורכבת: הבינוני (גלוקוז הנמוך) של הנשר שונה Dulbecco פתרון + 10% בסרום שור עוברי + סוס 5% סרום + 1% פניצילין, סטרפטומיצין. דגירה התאים בחממה CO 2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2), ולהחליף מחצית בינונית בכל יום אחר. תאי מעבר לפני שהם מגיעים למפגש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את מדיום הגידול, ולהוסיף 2 מיליליטר של PBS + (D-PBS + 10 מיליליטר מ&quot;ג -1 אלבומין בסרום שור (BSA) + 10 מ&quot;מ EDTA) prewarmed עד 37 ° C. דגירה של 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס. לטפוח בעדינות את הצלחת כדי לנתק את כל לסה&quot;נLLS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים בצינור חרוטי 15 מיליליטר. יש לשטוף את הצלחת עם 3 מיליליטר של D-PBS הטרי, prewarmed עד 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור ב 150 × גרם במשך 4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant, ולהוסיף 1 מיליליטר של מדיום הגידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתרבות שגרה, לפצל את התאים 1: 3 ל -1: 5. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתאי צלחת על מדגם OTS / Tio 2-שונה UV, לספור צפיפות תאים ולהוסיף 3.0 × 10 5 תאים בצלחת 35 מ&quot;מ (איור 1: שלב E). דגירה הצלחת בחממת humidified (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) במשך 1-2 ימים. שני תאי PC12 -differentiated גורם גדילה נאיבי ועצב (NGF) יכולים לשמש לניסויי דפוסים. לבידול NGF, מיליליטר 100 ng -1 של 7S-NGF מתווסף לכמה ימי הצמיחה בינונית לפני ציפוי התאים על המדגם. נראה NGF-בידול להגדיל adhesibility של תאי PC12 והופך את הטיפול קל יותר, במיוחד בדואר הדפוסים-האתר בxperiments. </li></ol> דפוסים משטח 5. באתר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 1-2 ימים של תרבות על פני השטח לשעבר באתר שונה, לאשר כי התאים מצרפים וגדלו רק באזור המוקרן UV. הגדרת מיקרוסקופ, כמתואר בשלב 3.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את המדגם לצלחת חדשה 35 מ&quot;מ רקמת תרבות המכילה מדיום הגידול, 100 מיליליטר ng -1 NGF (במקרה של שימוש בתאים מובחנים-NGF), ו -100 מיקרוגרם מיליליטר -1 Col-IV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת על הבמה מיקרוסקופ. מצא את המיקום המתאים, ולהקרין אור UV במינון של 200 סנטימטר J -2 (איור 1: שלב F, G). האזור מתירנית החדש שנוצר הוא מסומן בכוכבית באיור 1: שלב ג &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנסות להשלים את עיבוד של מדגם יחיד בתוך 30 דקות. לאחר הקרנה, להעביר את המדגם בחזרה לתוך המדיום ללא Col-IV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להיות זהיר מאוד בעת ביצוע את המנה עם מ&quot;קתאי ltured והעברת הדגימה מצלחת לצלחת כדי למנוע ניתוק של התאים בדוגמת. </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53045/53045fig1highres.jpg" width="700" /> איור 1. איור סכמטי של התהליך הכולל. ראה טקסט לפרטים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53045/53045fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<ol>
	<li>Hughes, M. A., Brennan, P. M., Bunting, A. S., Shipston, M. J., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Patterning+on+Photolithographically+Defined+Parylene-C:+SiO2+Substrates.">Cell Patterning on Photolithographically Defined Parylene-C: SiO2 Substrates.</a> J. Vis. Exp. (85), e50929 (2014).</li><li>Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Outgrowth+of+Dissociated+Neurons+on+Patterned+Substrates.">Controlled Outgrowth of Dissociated Neurons on Patterned Substrates.</a> J. Neurosci. 8, 4098-4120 (1988).</li><li>Pensen, D., Heinz, W. F., Werbin, J. L., Hoh, J. H., Haviland, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Beam+Patterning+of+Fibronectin+Nanodots+that+Support+Focal+Adhesion+Formation.">Electron Beam Patterning of Fibronectin Nanodots that Support Focal Adhesion Formation.</a> Soft Matter. 3, 1280-1284 (2007).</li><li>Tanii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Organosilane+Monolayer+Template+to+Quantitative+Evaluation+of+Cancer+Cell+Adhesive+Ability.">Application of Organosilane Monolayer Template to Quantitative Evaluation of Cancer Cell Adhesive Ability.</a> Jpn. J. Appl. Phys. 50, 06GL01 (2011).</li><li>Yamamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Situ+Guidance+of+Individual+Neuronal+Processes+by+Wet+Femtosecond+Laser+Processing+of+Self-Assembled+Monolayers.">In-Situ Guidance of Individual Neuronal Processes by Wet Femtosecond Laser Processing of Self-Assembled Monolayers.</a> Appl. Phys. Lett. 99, 163701-1610 (2011).</li><li>Yamamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Neurite+Outgrowth+is+Required+for+Axon+Specification+by+Cultured+Hippocampal+Neurons.">Differential Neurite Outgrowth is Required for Axon Specification by Cultured Hippocampal Neurons.</a> J. Neurochem. 123, 904-910 (2012).</li><li>Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+Printing+of+Proteins+for+Cell+Biology.">Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology.</a> J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).</li><li>Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+Two-Dimensional+Patterned+Substrates+for+Protein+and+Cell+Confinement.">Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement.</a> J. Vis. Exp. (55), e3164 (2011).</li><li>Singhvi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Cell+Shape+and+Function.">Engineering Cell Shape and Function.</a> Science. 264, 696-698 (1126).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+Control+of+Cell+Life+and+Death.">Geometric Control of Cell Life and Death.</a> Science. 276, 1425-1428 (1997).</li><li>Degot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Visualization+and+Quantitative+Analysis+of+Drug+Effects+using+Micropatterned+Cells.">Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects using Micropatterned Cells.</a> J. Vis. Exp. (46), e2514 (2010).</li><li>Nakanishi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+of+a+Substrate+for+Cell+Adhesion+under+Standard+Fluorescence+Microscopes.">Photoactivation of a Substrate for Cell Adhesion under Standard Fluorescence Microscopes.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 16314-16315 (2004).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressable+Micropatterning+of+Multiple+Proteins+and+Cells+by+Microscope+Projection+Photolithography+Based+on+a+Protein+Friendly+Photoresist.">Addressable Micropatterning of Multiple Proteins and Cells by Microscope Projection Photolithography Based on a Protein Friendly Photoresist.</a> Langmuir. 26, 12112-12118 (2010).</li><li>Deka, G., Okano, K., Kao, F. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Photopatterning+of+Cells+In+Situ+by+Q-Switched+Neodymium-Doped+Yttrium+Ortho-Vanadate.">Dynamic Photopatterning of Cells In Situ by Q-Switched Neodymium-Doped Yttrium Ortho-Vanadate.</a> Laser. J. Biomed. Opt. 19, 011012 (2014).</li><li>Robertus, J., Browne, W. R., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Control+over+Cell+Adhesive+Properties+using+Molecular-Based+Surface+Engineering+Strategies.">Dynamic Control over Cell Adhesive Properties using Molecular-Based Surface Engineering Strategies.</a> Chem. Soc. Rev. 39, 354-378 (2010).</li><li>Choi, I., Yeo, W. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembled+Monolayers+with+Dynamicity+Stemming+from+(Bio)chemical+Conversions:+From+Construction+to+Application.">Self-Assembled Monolayers with Dynamicity Stemming from (Bio)chemical Conversions: From Construction to Application.</a> ChemPhysChem. 14, 55-69 (2013).</li><li>Nakanishi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switchable+Substrates+for+Analyzing+and+Engineering+Cellular+Functions.">Switchable Substrates for Analyzing and Engineering Cellular Functions.</a> Chem. Asian J. 9, 406-417 (2014).</li><li>Yamamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Modification+of+Cell-Culture+Scaffolds+by+Photocatalytic+Decomposition+of+Organosilane+Monolayers.">In Situ Modification of Cell-Culture Scaffolds by Photocatalytic Decomposition of Organosilane Monolayers.</a> Biofabrication. 6, 035021 (2014).</li><li>Sekine, K., Yamamoto, H., Kono, S., Ikeda, T., Kuroda, A., Tanii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+Modification+of+Cell+Scaffold+in+Aqueous+Solution+using+TiO2+Photocatalysis+and+Linker+Protein+L2+for+Patterning+Primary+Neurons.">Surface Modification of Cell Scaffold in Aqueous Solution using TiO2 Photocatalysis and Linker Protein L2 for Patterning Primary Neurons.</a> e-J. Surf. Sci. Nanotech. 13, 213-218 (2015).</li><li>Arima, Y., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Surface+Functional+Groups+on+Protein+Adsorption+and+Subsequent+Cell+Adhesion+using+Self-Assembled+Monolayers.">Effects of Surface Functional Groups on Protein Adsorption and Subsequent Cell Adhesion using Self-Assembled Monolayers.</a> J. Mater. Chem. 17, 4079-4087 (2007).</li><li>Fujishima, A., Zhang, X., Tryk, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TiO2+Photocatalysis+and+Related+Surface+Phenomena.">TiO2 Photocatalysis and Related Surface Phenomena.</a> Surf. Sci. Rep. 63, 515-582 (2008).</li><li>Sigal, G. B., Mrksich, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Surface+Wettability+on+the+Adsorption+of+Proteins+and+Detergents.">Effect of Surface Wettability on the Adsorption of Proteins and Detergents.</a> J. Am. Chem. Soc. 120, 3464-3473 (1998).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+and+Photo-Patternable+Superhydrophobic+Film.">A Transparent and Photo-Patternable Superhydrophobic Film.</a> Chem. Commun. 2007, 4949-4951 (1039).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+Hippocampal+Neurons.">Culturing Hippocampal Neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

בפרוטוקול הנוכחי שלנו, Tio 2 סרט נוצר על ידי המקרטעת RF-magnetron. אנו דוגלים בשיטה זו בתצהיר שכן הוא מאפשר לנו להכין reproducibly Tio 2 סרט photocatalytic עם חספוס תת-ננומטר. למרות שתהליכי גמגום בתצהיר הם מוכרים למדעני חומרים ומהנדסי אלקטרוניקה, זה לא יכול להיות די נגיש לביולוג?...

תהליכים ליתוגרפיה סמיקונדקטור ונגזרותיו - כגון 1,2 photolithography, ליתוגרפיה קרן האלקטרונים 3-6, וmicrocontact הדפסת 7-10 - הפכו להיות עכשיו כלי הוקם בביולוגיה של תא לגדול תאי חיים בעמדה וגיאומטריה מוגדרות. שיטת הדפוסים מסתמכת על השימוש במצעי microfabricated, בהיקף של מיקרו-האי של ציפוי מתירנית תא ברקע שאינו מתירנית. מצע כזה משמש כתבנית לתבנית התאים. טכנולוגיות אלה סיפקו לנו את שיטות הרומן להנדס תאים ותפקודם ברמה חד ורב-תאית, כדי לחלץ את המאפיינים הפנימיים של תאים, ולהגדיל את התפוקה של הקרנת סמים מבוססי תאים 11. התואר של חופש בדפוסי תא היה להגדיל באופן משמעותי אם הגיאומטריה דפוס תבנית אפשר לשנות באתר, כלומר, בזמן שתאים בתרבית על יםurface. השיטות המקובלות להיווצרות דפוס לא ניתן ליישם ישירות כאן, שכן הם לעבד דגימות באווירה או בואקום. טכניקות שינוי פני השטח חדשות ולכן שונות הוצעו, המבוססים, למשל, על תרכובות photoreactive 12,13 או אבלציה לייזר 5,14, רק כדי שם כמה. השיטות המוצעות נבדקו יפה על ידי אל Robertus et. 15, ולאחרונה על ידי צ&#39;וי et al. 16 ועל ידי נאקאנישי 17. כאן במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול רומן של שינוי באתר פני השטח, אשר מנצל את פירוק photocatalytic של מולקולות אורגניות על דו תחמוצת טיטניום (Tio 2) משטח 18,19. בשיטה זו, סרט Tio 2 מוכנס בין מצע הזכוכית והסרט האורגני ממשקים התאים, והסרט האורגני מתפרק באתר על ידי מקומי הקרנת אור אולטרה סגול (UV)אור לאזור של עניין (λ &lt;ננומטר 388). אנו מראים כי הפרוטוקול החדש יכול לשמש ליצירה של חלבונים תאיים micropatterns מטריצה ​​ותאי חיים הן באתרו לשעבר ובאתרו. Tio 2 הוא ביולוגית, כימי יציב, ושקוף אופטי, תכונות שהופך אותו לידידותי להציג בניסויי תא-תרבות. פרוטוקול זה מספק אלטרנטיבה חומרים מבוסס מדע לשינוי פיגומי תא-תרבות בסביבת תא-תרבות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CS-15R15</td>
			<td>15 mm, #1.5 thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond scriber</td>
			<td>Ogura Jewel Industry</td>
			<td>D-Point Pen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF sputtering system</td>
			<td>ANELVA</td>
			<td>SPC350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 sputtering target</td>
			<td>Kojundo Chemical Lab</td>
			<td>Titanium (IV) oxide, target</td>
			<td>Purity, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma reactor</td>
			<td>Yamato</td>
			<td>PR301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-octadecyltrichlorosilane 
			(OTS)</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>104817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Wako</td>
			<td>204-01866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture dish (35 mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture dish (60 mm)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type-IV collagen</td>
			<td>Nitta Gelatin</td>
			<td>Cellmatrix Type IV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td>Heat-inactivate and pass through a 0.22 mm filter before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td>Pass through a 0.22 mm filter before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (100x)</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7S nerve growth factor (NGF)</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>N-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>N001</td>
			<td>Stock solution in 0.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 nanoparticle</td>
			<td>Tayca</td>
			<td>TKD-701</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photopatterning proteins and cells in aqueous environment using tio2 photocatalysis

מזהמים אורגניים אשר נספחים על פני השטח של תחמוצת טיטניום (Tio 2) יכולים להיות מפורקים על ידי photocatalysis באור אולטרה סגול (UV). כאן אנו מתארים פרוטוקול רומן העסקת photocatalysis Tio 2 לשנות זיקת תא של משטח המצע מקומי. לצורך ניסוי זה, Tio 2 סרט דק היה על coverslip זכוכית מצופה גמגום, ופני שטח Tio 2 שונה לאחר מכן עם monolayer organosilane נגזר מoctadecyltrichlorosilane (OTS), אשר מעכב את הידבקות תא. המדגם היה שקוע במדיום תרבית תאים, והתמקד אור UV היה מוקרן לאזור מתומן. כאשר תאי PC12 שורת תאים עצביים היו מצופים על המדגם, תאים דבקו רק באזור המוקרן UV. בנוסף, אנו מראים כי שינוי פני השטח זה יכול גם להתבצע באתר, כלומר, גם כאשר תאים גדלים על המצע. שינוי נכון של פני השטח הנדרש עמ &#39;מטריקסrotein קולגן להיות נוכח במדיום בעת קרינת UV. הטכניקה המוצגת כאן יכולה להיות מועסקות פוטנציאלית בסוגי תאים מרובים דפוסים לבניית מערכות coculture או לתמרן באופן שרירותי תאים תחת התרבות.

איור 2 א מראה תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק חתך (SEM) של סרט Tio 2-הופקד גמגום. מהתצפית, עובי של הסרט נאמד בכ 150 ננומטר. בולט כאן היא השטיחות של Tio 2 סרט שהופקד. ניתוח נוסף על ידי מיקרוסקופ כוח האטומי (AFM) גילה כי חספוס שורש ממוצע רבוע (RMS) של פני השטח היה 0.2 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Photopatterning Proteins and Cells in Aqueous Environment Using TiO2 Photocatalysis at JoVE.com

Photopatterning Proteins and Cells in Aqueous Environment Using TiO2 Photocatalysis

We describe a protocol for modifying cell affinity of a scaffold surface in aqueous environment. The method takes advantage of titanium dioxide photocatalysis to decompose organic film in the photo-irradiated region. We show that it can be used to create microdomains of scaffolding proteins, both ex situ and in situ.

Photopatterning חלבונים ותאים בסביבה מימית שימוש Tio<sub&gt; 2</sub&gt; Photocatalysis

Organic contaminants adsorbed on the surface of titanium dioxide (TiO2) can be decomposed by photocatalysis under ultraviolet (UV) light. Here we describe ...

photopatterning-proteins-cells-aqueous-environment-using-tio2

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Photopatterning Proteins and Cells in Aqueous Environment Using TiO2 Photocatalysis

7.8K Views.  Tohoku University. We describe a protocol for modifying cell affinity of a scaffold surface in aqueous environment. The method takes advantage of titanium dioxide photocatalysis to decompose organic film in the photo-irradiated region. We show that it can be used to create microdomains of scaffolding proteins, both ex situ and in situ.

Video: Photopatterning Proteins and Cells in Aqueous Environment Using TiO2 Photocatalysis

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

המצאה של אלקטרוכימי-DNA Biosensors לגילוי Reagentless של חומצות, חלבונים ומולקולות קטנות גרעין

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural biology 1. In recent years, this method has achieved great success in studying structures of proteins and macromolecular complexes 2, 3. Compared with electron cryomicroscopy (cryoEM), in which frozen hydrated protein samples are embedded in a thin layer of vitreous ice 4, negative staining is a simpler sample preparation method in which protein samples are embedded in a thin layer of dried heavy metal salt to increase specimen contrast 5. The enhanced contrast of negative stain EM allows examination of relatively small biological samples. In addition to determining three-dimensional (3D) structure of purified proteins or protein complexes 6, this method can be used for much broader purposes. For example, negative stain EM can be easily used to visualize purified protein samples, obtaining information such as homogeneity/heterogeneity of the sample, formation of protein complexes or large assemblies, or simply to evaluate the quality of a protein preparation.
In this video article, we present a complete protocol for using an EM to observe negatively stained protein sample, from preparing carbon coated grids for negative stain EM to acquiring images of negatively stained sample in an electron microscope operated at 120kV accelerating voltage. These protocols have been used in our laboratory routinely and can be easily followed by novice users.

Visualizing protein samples by negative stain electron microscopy (EM) has become a popular structural analysis method. It is useful for quantitative structural analysis, such as calculating a 3D reconstruction of the molecules being studied, and also for qualitative examination of the quality of protein preparations. In this article we present detailed protocols for preparing the EM grids, staining the sample and visualizing the sample in an electron microscope. Novice users can follow these protocols easily and to utilize negative stain EM as a routine assay, in addition to other biochemical assays, for evaluating their protein samples.

לדמיין חלבונים מכלולים Macromolecular על ידי א.מ. כתמים שליליות: החל הכנה רשת הרכישה תמונה

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

Toolkit כדי לאפשר גיור פחמימן בסביבות מימיות

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, phosphorus, sulfate and trace elements that plants acquire from the soil. If we want to develop sustainable approaches to producing high crop yield, we need to better understand how the root develops, takes up a wide spectrum of nutrients, and interacts with symbiotic and pathogenic organisms. To accomplish these goals, we need to be able to explore roots in microscopic detail over time periods ranging from minutes to days.
We developed the RootChip, a polydimethylsiloxane (PDMS)- based microfluidic device, which allows us to grow and image roots from Arabidopsis seedlings while avoiding any physical stress to roots during preparation for imaging1 (Figure 1). The device contains a bifurcated channel structure featuring micromechanical valves to guide the fluid flow from solution inlets to each of the eight observation chambers2. This perfusion system allows the root microenvironment to be controlled and modified with precision and speed. The volume of the chambers is approximately 400 nl, thus requiring only minimal amounts of test solution.
Here we provide a detailed protocol for studying root biology on the RootChip using imaging-based approaches with real time resolution. Roots can be analyzed over several days using time lapse microscopy. Roots can be perfused with nutrient solutions or inhibitors, and up to eight seedlings can be analyzed in parallel. This system has the potential for a wide range of applications, including analysis of root growth in the presence or absence of chemicals, fluorescence-based analysis of gene expression, and the analysis of biosensors, e.g. FRET nanosensors3.

This article provides a protocol for cultivation of Arabidopsis seedlings in the RootChip, a microfluidic imaging platform that combines automated control of growth conditions with microscopic root monitoring and FRET-based measurement of intracellular metabolite levels.

זמן לשגות דימות פלואורסצנטי של צמיחה רוט ארבידופסיס עם מניפולציה מהירה של הסביבה רוט שימוש RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

דפוסי שיתוף תרבות נייד באמצעות מערכות מימיות שני שלבים

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

הארה תהודת אנרגיה העבר לחקר שינויי קונפורמציה בחלבונים בממברנה שבאו לידי ביטוי בתאי יונקים

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Aqueous Droplets Used as Enzymatic Microreactors and Their Electromagnetic Actuation

For the successful implementation of microfluidic reaction systems, such as PCR and electrophoresis, the movement of small liquid volumes is essential. In conventional lab-on-a-chip-platforms, solvents and samples are passed through defined microfluidic channels with complex flow control installations. The droplet actuation platform presented here is a promising alternative. With it, it is possible to move a liquid drop (microreactor) on a planar surface of a reaction platform (lab-in-a-drop). The actuation of microreactors on the hydrophobic surface of the platform is based on the use of magnetic forces acting on the outer shell of the liquid drops which is made of a thin layer of superhydrophobic magnetite particles. The hydrophobic surface of the platform is needed to avoid any contact between the liquid core and the surface to allow a smooth movement of the microreactor. On the platform, one or more microreactors with volumes of 10 &#181;L can be positioned and moved simultaneously. The platform itself consists of a 3 x 3 matrix of electrical double coils which accommodate either neodymium or iron cores. The magnetic field gradients are automatically controlled. By variation of the magnetic field gradients, the microreactors' magnetic hydrophobic shell can be manipulated automatically to move the microreactor or open the shell reversibly. Reactions of substrates and corresponding enzymes can be initiated by merging the microreactors or bringing them into contact with surface immobilized catalysts.

Lab-in-a-drop reaction systems allow the versatile implementation of complex reactions in a microfluidic scale. An automated actuation platform consisting of a 3 x 3 matrix of electromagnetic coils was developed and successfully used to merge two 10 &#181;L microreactors and thereby initiate an enzymatic reaction in the resulting liquid marbles.

טיפות מימית משמש Microreactors אנזימטיות, הופעה אלקטרומגנטית שלהם

For the successful implementation of microfluidic reaction systems, such as PCR and electrophoresis, the movement of small liquid volumes is essential. In ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

שיטה צדדית של חלבוני דפוסי תאים

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order to reproduce the remarkable mechanical properties of spider silks, they must be produced in heterologous hosts as spiders are both territorial and cannibalistic. The synthetic analogs of spider silk also tend to be insoluble in aqueous solutions. Thus, a large percentage of research in recombinant spider silks rely upon organic solvents that are detrimental to large scale production of materials. Our group&#8217;s method forces the solvation of these recombinant spider silks into water. Remarkably, when these proteins are prepared using this method of heat and pressure, a wide range of material forms can be prepared from the same solution of recombinant spider silk proteins (rSSp) including: films, fibers, sponge, hydrogel, lyogel, and adhesives. This article demonstrates the production of the solvated rSSp and material forms in a manner that is more easily understood than from written materials and methods alone.

Here, we present a protocol to produce water soluble recombinant spider silk protein solutions and the material forms that can be formed from those solutions.

היווצרות חומר של משי רקומביננטי עכביש באמצעות מימית Solvation באמצעות חום ולחץ

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order ...