The authors are grateful to G. Barka (SunChrom GmbH, Friedrichsdorf, Germany) for his support and for providing the epoxy glue. Furthermore, the authors acknowledge Fresenius Medical Care (Bad Homburg, Germany) for supplying the Capillary Haemodiafilter FXCorDiax. Funding was obtained from Goethe University of Frankfurt.

1. PTFE-צינורות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצר PTFE-צינורות לתוך חתיכת 2.5 סנטימטר. השתמש בנייר בקנה מידה להעריך ממדים פיזיים. (ראה איור 3 א) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך סוף אחד בזווית כדי להקל על חיבור של צינורות חשמל. (ראה איור 3 א) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PTFE-צינורות לחספס על ידי שימוש בנייר הזכוכית כדי לאפשר דבקות של דבק אפוקסי. </li></ol> 2. הכנה התמזגו סיליקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצר סיליקה התמזגה לתוך חתיכת 2.25 סנטימטר. (ראה איור 3 א) </li></ol> 3. הכנסת סיליקה התמזגו לתוך PTFE-צינורות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס צינורית G 30 לסיבים החלולים PTFE לנקב אותו במרחק של 1 סנטימטר מהקצה השטוח. לכופף את PTFE-צינורות כדי לפשט את התהליך. (ראה איור 3 ב) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את סיליקה התמזגה לתוך PTFE-צינורות באמצעות הצינורית כמו הדרכה. (ראה איור 3 ג) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא בעדינות את הצינורית ולאבטח את סיליקה התמזגה. (ראה3D איור) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיליקה התמזגה אמורה להקרין 5 מ&quot;מ בסוף השטוח. (ראה איור 3E) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דבק סיליקה התמזגה במקום באתר לנקב על ידי דבק cyanoacrylate ולאפשר לו להקשיח במשך הלילה. (ראה איור 3E) </li></ol> 4. אפוקסי דבק הכנה (שני רכיבי דבק) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 חלקי מקשה צהובה ל -70 חלקים של דבק אפוקסי שחור על ידי עזרה של מחט דקה ומערבבים אותו בעדינות. זה ישירות מוכן לשימוש. </li></ol> 5. מריחת ממברנה (כל צעדים נוספים יש לבצע מתחת למיקרוסקופ ונייר בקנה מידה המשמש להערכת ממדים פיסיים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את קרום polysulfone על סיליקה התמזגה בזהירות, ואז למשוך את הקרום לPTFE-צינורות ולהתאים את הקרום 5.5 מ&quot;מ באמצעות אזמל חד. (ראה איור 3F) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר נקודה על קרום סימון עם עט דק להגדיר את אורך החליפין של 2 מ&quot;ממהקצה של הקרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרוח כמות קטנה של דבק אפוקסי כדי לכסות את הקצה של הקרום בעזרת מחט דקה. (ראה איור 3G) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את משותף בין קרום הדיאליזה וPTFE סיבים על ידי עזרה של אותה מחט דקה המשמשת בשלב 5.3) עם דבק אפוקסי. (ראה איור 3G) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מספיק דבק אפוקסי על הממברנה עד לנקודת הסימון כדי להבטיח אורך חליפין של 2 מ&quot;מ. לאפשר לו להקשיח במשך הלילה. (ראה איור 3G) לפני קביעת אורך החליפין, הקרום הוא 5.5 מ&quot;מ. לאחר החלת דבק אפוקסי על הקרום, רק 2 מ&quot;מ של הקרום זמין עבור דיפוזיה. </li></ol> 6. יישום שרוול המתכת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך מחט 25 G לחתיכות שרוול מתכת 1 סנטימטר על ידי עזרה של צבת כיפוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את שרוול מתכת 1 סנטימטר (25 G) על החלק הנותר של סיליקה התמזגה. שרוול המתכת מאוחר יותר מאפשר חיבור של צינורות היניקה עם microdiaהבדיקה תמוגה. (ראה איור 3H) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום משותף בין שרוול המתכת וPTFE-צינורות עם דבק אפוקסי שנותר. לאפשר לו להקשיח לפחות 24 שעות. (ראה איור 3i) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מריחת דבק חם סביב ההסתעפות של החללית לקיבוע וייצוב נוספים. הערה: הנפח הפנימי הכניסה של החללית היא 0.045 μl והנפח הפנימי לשקע הוא 2.5 μl. לכן, עם קצב זרימה של μl 1 / דקה, זה לוקח כ 2.5 דקות לאחר חיבור צינור הכניסה להתחיל האוסף של dialysate. עם הפרוטוקול הנוכחי, הליך ההרכבה הבדיקה מניב בדיקות microdialysis כי הם 95% אמינות. </li></ol> 7. ביצוע ניסויים שחזור חוץ גופית ב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את הבדיקה עם חתך של 30 kDa ואורך חליפין של 2 מ&quot;מ לפתרון מניות המורכב מaCSF מכיל גלוקוז 1 מ&quot;מ וחומצת חלב 1 מ&quot;מ ו, בניסוי נפרד, לCSF המכיל 100ATP ננומטר ו -100 ננומטר אצטילכולין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse הבדיקות עם aCSF. הגדר קצב זרימה לμl / דקה 1 ולבצע ניסויים בטמפרטורת חדר (22 מעלות צלזיוס). לאפשר הבדיקות לאזן עבור שעה 1 בפתרון המניות, ולאסוף הדגימות כל 30 דקות לאחר מכן ולאחסן ב -80 ° C עד מדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחישוב החזרים במבחנה, להשוות את הריכוזים של analytes בdialysates עם ריכוזי אנליטי הידועים בפתרון המניות. הגעה תוצאות באחוזים של ריכוז חומר בdialysate לעומת פתרון מניות. </li></ol>

<ol>
	<li>Feldberg, W., Malcom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+site+of+action+of+tubocurarine+when+applied+via+the+cerebral+ventricles.">Experiments on the site of action of tubocurarine when applied via the cerebral ventricles.</a> J Physiol. 149, 58-77 (1959).</li><li>Gaddum, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Push-pull+cannulae.">Push-pull cannulae.</a> J Physiol. 155 (1 P), (1961).</li><li>Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+concentrations+of+free+amino+acids+and+other+electrolytes+in+cerebrospinal+fluid,+in+vivo+dialysate+of+brain,+and+blood+plasma+of+the+dog.">The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog.</a> J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).</li><li>Delgado, J. M., Lerma, J., Mart&#237;n del R&#237;o, R., Sol&#237;s, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dialytrode+technology+and+local+profiles+of+amino+acids+in+the+awake+cat+brain.">Dialytrode technology and local profiles of amino acids in the awake cat brain.</a> J Neurochem. 42 (5), 1218-1228 (1984).</li><li>Ungerstedt, U., Pycock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+correlates+of+dopamine+neurotransmission.">Functional correlates of dopamine neurotransmission.</a> Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30 (1-3), 44-55 (1974).</li><li>Ungerstedt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdialysis--principles+and+applications+for+studies+in+animals+and+man.">Microdialysis--principles and applications for studies in animals and man.</a> J Intern Med. 230 (4), 365-373 (1991).</li><li>Bourne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebral+microdialys:+30+years+as+a+tool+for+the+neuroscientist.">Intracerebral microdialys: 30 years as a tool for the neuroscientist.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (1-2), 16-24 (2003).</li><li>Lietsche, J., Gorka, J., Hardt, S., Karas, M., Klein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-built+microdialysis+probes+with+improved+recoveries+of+ATP+and+neuropeptides.">Self-built microdialysis probes with improved recoveries of ATP and neuropeptides.</a> J Neurosci Methods. 237, 1-8 (2014).</li><li>Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+Brain+Microdialysis.">Overview of Brain Microdialysis.</a> Curr Protoc Neurosci. 7, Unit 7.1 (2009).</li><li>Neurochem, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+Microdialysis.">Brain Microdialysis.</a> J. Neurochem. 52 (6), 1667-1679 (1989).</li><li>Jolly, D., Vezina, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+microdialysis+in+the+rat:+low+cost+and+low+labor+construction+of+a+small+diameter,+removable,+concentric-style+microdialysis+probe+system.">In vivo microdialysis in the rat: low cost and low labor construction of a small diameter, removable, concentric-style microdialysis probe system.</a> J Neurosci Methods. 68 (2), 259-267 (1996).</li><li>Sumbria, R., Klein, J., Bickel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+depression+of+energy+metabolism+after+microdialysis+probe+implantation+is+distinct+from+ischemia-induced+changes+in+mouse+brain.">Acute depression of energy metabolism after microdialysis probe implantation is distinct from ischemia-induced changes in mouse brain.</a> Neurochem Res. 36, 109-116 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

איור 3 מראה הרכבה בדיקה למופת. ממדי קוטר פנימיים וחיצוניים נכונים שכדי לצפות מקרוב לצינורות (OD 1.6 מ&quot;מ; מזהה 350 מיקרומטר), סיליקה התמזגה (OD 105 מיקרומטר; מזהה 40 מיקרומטר) וקרום דיאליזה (OD 245 מיקרומטר; מזהה 210 מיקרומטר). כמו כן, חשוב לשמור על מרחב שבין הקרום וסיליקה ?...

Microdialysis היא טכניקה נפוץ במחקר מדעי מוח. במהלך 50 השנים האחרונות, טכניקת microdialysis המינימלית פולשנית שופרה ברציפות להפוך לשיטה מבוססת היטב כדי לפקח על ריכוזים מקומיים של תרכובות משקל מולקולריות קטנות במרחב החוץ תאי. כמעט בכל ביניים נוזל רקמה יכול להיחקר בבעלי חיים לנוע בחופשיות. Gaddum הציג טכניקת שכיבות למשוך ב -1960. הוא שונה מגישת et al פלדברג. בי tubocurarine היה perfused דרך צינורית המסתיימת בחדר לרוחב ואיסוף השפכים גם באמצעות צינורית 1. Gaddum פיתח את טכניקת דחיפה-המשיכה שבו צינורית המורכבת משתי מחטי פלדה קונצנטריים הושתלה באזורי המוח שונים וperfused ידי פתרון תוך הסרת בו זמנית נוירוטרנסמיטורים שוחררו מהנוירונים המקיפים את הקצה 2. למרבה הצער, Dama רקמהGE נגרמים על ידי הצינורית סביב הקצה מוגבל היישום של שיטה זו. כהתקדמות נוספת של שיטה זו, Bito ועמיתים לעבודה הציגו שיטת שקית דיאליזה שבפתרון שנאסף הופרד מהרקמה הסובבת על ידי קרום דיאליזה. הם מושתלים שק דיאליזה לרקמה התת עורית של צוואר כלב. התוכן של שקית הדיאליזה הוא ללא חלבון ויכול להיות מנותח שבועות רבים לאחר מכן ליונים וחומצות אמינו 3. הפיתוח הבא היה dialytrode, בדיקה microdialysis פרימיטיבית, אשר במקור היה שתוארה על ידי דלגאדו בשנת 1972 4. לבסוף, Ungerstedt ועמיתים שיפרו את העיצוב של חללית microdialysis כך שהוא היה קטן ועקורים פחות רקמה 5. בדיקה microdialysis קונצנטריים מתנהגת באופן דומה לנימי דם. מערכת perfused ללא הרף על ידי פתרון שמציעה את ההרכב היוני של נוזל הרקמה הסובב תוך חסר אנליטי של עניין. הקרום הדיאליזה דואר נחשף לפתרון או הרקמה החיצוני הוא חדיר למחצה. היא מאפשרת דיפוזיה פסיבית של חומרים לבדיקה לאורך מפל הריכוזים שלהם 6. החדירות תלויה במשתנים רבים כגון משקל מולקולרי, צורה, תשלום ו- pH של המתחם. כמו כן הוא מוגבל בשל תכונות חומר הקרום, נקבובית גודל של הקרום וקצב זרימת 7. איורים 1 ו -2 להראות בדיקה microdialysis קונצנטריים. נוזל זלוף נכנס דרך צינורות כניסה לתוך שרוול המתכת, המקיף את סיליקה התמזגה. בתוך שרוול המתכת, זה זרמים למטה לאורך סיליקה התמזגה ומשאיר אותו על הקצה שלה. במרחב שבין קרום הדיאליזה וpolytetrafluoroethylene (PTFE) -tubing (כגון טפלון) נוזל זלוף אז זורם כלפי מעלה. כאן, דיפוזיה של חומרים מרקמות מתרחשת המקיפה את הקרום. Dialysate עוזב את הבדיקה דרך PTFE-צינורות, אשר מחובר לשקע צינורות וניתן לאסוף. יש טכניקת microdialysis כמה יתרונות יחסי לאחרים בטכניקות vivo. הבדיקה מהווה מחסום פיזי וכתוצאה מכך dialysate אינו מכיל אנזימים או תאים. לכן, אין צורך בטיהור של eluate לפני הניתוח, ולא השפלה האנזימטית של analytes מתרחשת. השפלה חמצוני יכולה להתרחש במהלך המעבר של analytes בצינורות, אבל זה לעתים קרובות ניתן למנוע על ידי הוספת נוגדי חמצון (לדוגמא חומצה אסקורבית) לperfusate. לחלופין, נזק חמצוני לנוירו, למשל, דוכא ביעילות על ידי החלפת הצינור לשקע עם קצה לאסוף dialysate 8. Dialysate ניתן לחקור ישירות עם כמעט כל סוג של שיטה אנליטית ויכול להיות שנאסף analytes מרובה בו זמנית. מערכת זו יכולה לשמש בבעלי חיים ער, וכמעט כל האזורים במוח יכולים להיותבדק. יתר על כן, עירוי של תרופות דרך הבדיקה אפשרי (retrodialysis). עם זאת, יש גם מגבלות של טכניקת microdialysis. הרזולוציה הזמן מעט הנמוכה אינה מספקת מידע בזמן אמת בנוגע לשינויים עצביים. בגלל זה הוא טכניקה פולשנית, השתלת בדיקה גורמת טראומה ניתוחית והרדמה, אשר יכול להשפיע על ריכוזים עצביים, נדרש במהלך שלב זה 7,9,10. ריכוז המתחם בdialysate כולל רק כמות קטנה של ריכוז המתחם בפועל בנוזל החוץ תאי. לחישוב ריכוז המתחם ידוע בנוזל החוץ תאי, התאוששות היחסית במבחנה יש להיות מחושבת. קביעת ביחס אישי בהחלמת מבחנה לכל בדיקה וכל מתחם היא הכרחית לפני תחילת ניסוי in vivo. לצורך כך, הבדיקה הוא טבל תמיסה המכילהאנליטי של עניין ואילו נוזל זלוף הוא אותו הפתרון החסר אנליטי של עניין. לאחר קביעת ריכוזי מתחם בdialysate, הנתונים אלה יש התייחסו לריכוזם בנוזל המקיף. קביעות התאוששות במבחנה של כמה חומרים יכולות להיות מיושמות בו זמנית 9. קבוצות מחקר במדעי מוח רבות משתמשות בטכניקת microdialysis לחקור נוירוטרנסמיטורים ומטבוליטים במרחב החוץ תאי של אזורי מוח שונים. לפיכך, בדיקות מסחריות יש ביקוש גדול בסביבת מחקר מדעי המוח. יתרון גדול של בדיקות זמינות מסחרי הוא האמינות הפונקציונלית הגבוהה. ניסיוני ההגדרה לבדיקות מסחריות מבוססת היטב ומאומתים על נוירוטרנסמיטרים ומטבוליטים ידועים רבים. עם זאת, בעוד שציוד microdialysis זמין המסחרית הוא יקר ויש פחות גמישות ביישום 11, בההוא לעבוד הרכבה בדיקה microdialysis מוצגת בפירוט, אשר ניתן להתאים לכל יישום ויכול להיות מיוצר עבור פחות מ 10 $. בדיקה מותאמת אישית זה בדיקה microdialysis קונצנטריים נבדקה לחקירות באזורי מוח שונים 8. בהחלמת בדיקה מבחנה של חומרים עם משקל מולקולרי שונה (טווח של 100-1,600 Da) ועם מאפייני physicochemical שונים בהשוואה. התאוששות נחישות במבחנה של גלוקוז, חומצת החלב ואצטילכולין עם משקל מולקולרי פחות מ -200 דא, ATP עם משקל מולקולרי של כ -500 דה ואנגיוטנסין II נוירו, חומר P וסומטוסטטין עם משקל מולקולרי מעל 1,000 דה מבוצע.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>SunChrom GmbH, Fiedrichsdorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td>&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica ID 40 &#181;m OD 105 &#181;m</td>
			<td>Ziemer-Chromatographie, Mannheim, Germany</td>
			<td>Art. No: 6.040105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysulfone membrane (haemodialysis filter FX Cor Diax 600)</td>
			<td>Fresenius Medical Care AG &#38; Co. KGaA, Bad Homburg, Germany</td>
			<td>REF: F00001593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanacrylate glue (Pattex&#174; superglue plastic)</td>
			<td>Henkel AG&#38;Co. KGaA, D&#252;sseldorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEFLON-tubing 1.6 x 0.35 mm</td>
			<td>SunChrom&#174; GmbH, Friedberg, Germany</td>
			<td>Art. No: 969-195.219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel (Feather&#174; Surgical Blade No. 10)</td>
			<td>pfm medical ag, cologne, Germany</td>
			<td>Art. No: 07310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>MEIJI Techno&#160;</td>
			<td>EMZ-8TR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G x 11&#34; (0.3 x 25 mm) cannula&#160; Sterican&#174; Z</td>
			<td>B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td>
			<td>REF: 9324500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 11/2&#34; (0.5 x 40 mm) cannula 100 Sterican&#174;</td>
			<td>B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td>
			<td>REF: 9186166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine pen (Stabilo point 88 fine 0.4)</td>
			<td>Schwan-STABILO Schwanh&#228;u&#223;er GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>Art. No: 88/36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot glue&#160; (Glue sticks ULTRA Power x 11 mm)</td>
			<td>Steinel&#174; GmbH, Herzebrock-Clarholz, Germany</td>
			<td>Art. No: 4007841046910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sandpaper P60 230 x 280</td>
			<td>Robert Bosch GmbH, Gerlingen-Schillerh&#246;he, Germany</td>
			<td>Catalog Number: 2608605397</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

custom-made microdialysis probe design

Microdialysis היא טכניקה נפוץ במחקר מדעי מוח. לכן בדיקות מסחריות יש ביקוש גדול לעקוב אחר שינויים פיסיולוגיים, תרופתיים ופתולוגיים בנוזל השדרתי. למרבה הצער, בדיקות מסחריות יקרות לקבוצות מחקר במוסדות ציבור. בעבודה זו, הרכבה בדיקה הוא הסביר בפירוט לבנות חללית אמינה, קונצנטריים, מחוייט microdialysis פחות מ 10 $. הבדיקה microdialysis מורכבת מקרום polysulfone עם חתך מולקולרי של 30 kDa. בדיקה במבחנה החלמה של חומרים עם משקל מולקולרי שונה (בטווח של 100-1,600 Da) ומאפייני physicochemical שונים בהשוואה. הבדיקה תשואות התאוששות במבחנה של כ -20% לרמת הסוכר בתרכובות קטנות, חומצת החלב, אצטילכולין ו- ATP. החלמה במבחנה לנוירו עם משקל מולקולרי בין 1,000-1,600 סכום דה ל2-6%. וכך, בעוד w המולקולרי גבוה יותרשמונה של נוירו הורידו בערכי התאוששות מבחנה, דיאליזה של תרכובות בטווח הנמוך (עד 500 Da) של משקולות מולקולריות אין השפעה גדולה על במבחנה קצב ההתאוששות. השיטה הנוכחית מאפשרת ניצול של קרום דיאליזה עם ערך חתך אחר וחומר קרום. לכן, יש הרכבה בדיקה מותאמת אישית זה היתרון של גמישות מספיק כדי דיאליזת חומרים במגוון רחב משקל מולקולרי. הנה, אנחנו מציגים בדיקה microdialysis עם אורך חליפין של 2 מ&quot;מ, אשר ישים עבור microdialysis באזורים במוח עכבר וחולדה. עם זאת, ממדים של החללית יכולים בקלות להיות מותאמים לאורכי תמורה גדולים יותר לשימוש בבעלי חיים גדולים יותר.

הבדיקה microdialysis מחוייט קונצנטריים מורכבת מקרום polysulfone עם חתך מולקולרי של 30 kDa. ההרכבה הבדיקה מתוארת באיור 3. זה הציג התאוששות במבחנה לגלוקוז מטבוליטים אנרגיה הקטנה (180.16 Da) וחומצת החלב (112.06 Da) של 19.10 ± 1.2% ושל 21.2 ± 1.6%, בהתאמ...

Watch this Scientific Journal Video about Custom-made Microdialysis Probe Design at JoVE.com

Custom-made Microdialysis Probe Design

Microdialysis היא טכניקה נפוץ במחקר מדעי מוח. לכן בדיקות מסחריות נמצאות בdemand.In הגדול עבודה זו הרכבה בדיקה הוא הסבירה בפירוט לבנות חללית אמינה, קונצנטריים, מחוייט microdialysis פחות מ 10 $.

Microdialysis Probe עיצוב מותאם אישית

Microdialysis is a commonly used technique in neuroscience research. Therefore commercial probes are in great demand to monitor physiological, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.8K Views.  Goethe University of Frankfurt.  Microdialysis היא טכניקה נפוץ במחקר מדעי מוח. לכן בדיקות מסחריות נמצאות בdemand.In הגדול עבודה זו הרכבה בדיקה הוא הסבירה בפירוט לבנות חללית אמינה, קונצנטריים, מחוייט microdialysis פחות מ 10 $. 

Video: Custom-made Microdialysis Probe Design

Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography

Operant self-administration methods are commonly used to study the behavioral and pharmacological effects of many drugs of abuse, including ethanol. However, ethanol is typically self-administered orally, rather than intravenously like many other drugs of abuse. The pharmacokinetics of orally administered drugs are more complex than intravenously administered drugs. Because understanding the relationship between the pharmacological and behavioral effects of ethanol requires knowledge of the time course of ethanol reaching the brain during and after drinking, we use in vivo microdialysis and gas chromatography with flame ionization detection to monitor brain dialysate ethanol concentrations over time. 
Combined microdialysis-behavioral experiments involve the use of several techniques. In this article, stereotaxic surgery, behavioral training and microdialysis, which can be adapted to test a multitude of self-administration and neurochemical centered hypotheses, are included only to illustrate how they relate to the subsequent phases of sample collection and dialysate ethanol analysis. Dialysate ethanol concentration analysis via gas chromatography with flame-ionization detection, which is specific to ethanol studies, is described in detail. Data produced by these methods reveal the pattern of ethanol reaching the brain during the self-administration procedure, and when paired with neurochemical analysis of the same dialysate samples, allows conclusions to be made regarding the pharmacological and behavioral effects of ethanol.

A method to determine the time course of ethanol concentration in the brains of rats during operant ethanol self-administration is described. Gas chromatography with flame ionization detection is used to quantify ethanol in the dialysate samples, because it has the sensitivity required for the small volumes that are generated.

Microdialysis של אתנול במהלך אתנול נחישות ממשל עצמי ואתנול אופרנטית על ידי גז כרומטוגרפיה

Operant self-administration methods are commonly used to study the behavioral and pharmacological effects of many drugs of abuse, including ethanol.  ...

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance imaging. However, use of such methods in animal models requires anesthesia and hence both alters the brain state and prevents behavioral measures. An alternative method is the use of in vivo microdialysis to take continuous measurement of brain extracellular fluid concentrations of glucose, lactate, and related metabolites in awake, unrestrained animals. This technique is especially useful when combined with tasks designed to rely on specific brain regions and/or acute pharmacological manipulation; for example, hippocampal measurements during a spatial working memory task (spontaneous alternation) show a dip in extracellular glucose and rise in lactate that are suggestive of enhanced glycolysis1-3,4-5, and intrahippocampal insulin administration both improves memory and increases hippocampal glycolysis6. Substances such as insulin can be delivered to the hippocampus via the same microdialysis probe used to measure metabolites. The use of spontaneous alternation as a measure of hippocampal function is designed to avoid any confound from stressful motivators (e.g. footshock), restraint, or rewards (e.g. food), all of which can alter both task performance and metabolism; this task also provides a measure of motor activity that permits control for nonspecific effects of treatment. Combined, these methods permit direct measurement of the neurochemical and metabolic variables regulating behavior.

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Modulation of hippocampally-dependent spatial working memory by direct intrahippocampal microinjection, accompanied and followed by in vivo microdialysis for metabolites in conscious, behaving animals.

Microinjection האינסולין היפוקמפוס ו<em&gt; בחי</em&gt; Microdialysis במהלך בדיקת זיכרון המרחבי

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance ...

Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique known as electron probe microanalysis (EPMA) are described. Intramitochondrial calcium is a particular focus because of the critical role that mitochondrial calcium overload plays in neurodegenerative diseases. The method is based on the analysis of X-rays generated in an electron microscope (EM) by interaction of an electron beam with the specimen. In order to maintain the native distribution of diffusible elements in electron microscopy specimens, EPMA requires &#34;cryofixation&#34; of tissue followed by the preparation of ultrathin cryosections. Rapid freezing of cultured cells or organotypic slice cultures is carried out by plunge freezing in liquid ethane or by slam freezing against a cold metal block, respectively. Cryosections nominally 80 nm thick are cut dry with a diamond knife at ca. -160 &#176;C, mounted on carbon/pioloform-coated copper grids, and cryotransferred into a cryo-EM using a specialized cryospecimen holder. After visual survey and location mapping at &#8804;-160 &#176;C and low electron dose, frozen-hydrated cryosections are freeze-dried at -100 &#176;C for ~30 min. Organelle-level images of dried cryosections are recorded, also at low dose, by means of a slow-scan CCD camera and subcellular regions of interest selected for analysis. X-rays emitted from ROIs by a stationary, focused, high-intensity electron probe are collected by an energy-dispersive X-ray (EDX) spectrometer, processed by associated electronics, and presented as an X-ray spectrum, that is, a plot of X-ray intensity vs. energy. Additional software facilitates: 1) identification of elemental components by their &#34;characteristic&#34; peak energies and fingerprint; and 2) quantitative analysis by extraction of peak areas/background. This paper concludes with two examples that illustrate typical EPMA applications, one in which mitochondrial calcium analysis provided critical insight into mechanisms of excitotoxic injury and another that revealed the basis of ischemia resistance.

This paper describes the application of cryoanalytical electron microscopy to the quantitative measurement of total calcium content and distribution at subcellular resolution in physiologically defined biological specimens.

מדידה של סידן סה&quot;כ בנוירונים על ידי אלקטרונים רנטגן Microanalysis Probe

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where the stimulus applied depends in real-time on the response of the system. Recent applications range from the implementation of virtual reality systems for studying motor responses both in mice1 and in zebrafish2, to control of seizures following cortical stroke using optogenetics3. A key advantage of closed-loop techniques resides in the capability of probing higher dimensional properties that are not directly accessible or that depend on multiple variables, such as neuronal excitability4 and reliability, while at the same time maximizing the experimental throughput. In this contribution and in the context of cellular electrophysiology, we describe how to apply a variety of closed-loop protocols to the study of the response properties of pyramidal cortical neurons, recorded intracellularly with the patch clamp technique in acute brain slices from the somatosensory cortex of juvenile rats. As no commercially available or open source software provides all the features required for efficiently performing the experiments described here, a new software toolbox called LCG5 was developed, whose modular structure maximizes reuse of computer code and facilitates the implementation of novel experimental paradigms. Stimulation waveforms are specified using a compact meta-description and full experimental protocols are described in text-based configuration files. Additionally, LCG has a command-line interface that is suited for repetition of trials and automation of experimental protocols.

Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.

אלקטרופיזיולוגיה בזמן אמת: שימוש בפרוטוקולי לולאה סגורה לDynamics עצבי בדיקה ומעבר

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

In vivo microdialysis is a powerful technique to collect ISF from awake, freely-behaving animals based on a dialysis principle. While microdialysis is an established method that measures relatively small molecules including amino acids or neurotransmitters, it has been recently used to also assess dynamics of larger molecules in ISF using probes with high molecular weight cut off membranes. Upon using such probes, microdialysis has to be run in a push-pull mode to avoid pressure accumulated inside of the probes. This article provides step-by-step protocols including stereotaxic surgery and how to set up microdialysis lines to collect proteins from ISF. During microdialysis, drugs can be administered either systemically or by direct infusion into ISF. Reverse microdialysis is a technique to directly infuse compounds into ISF. Inclusion of drugs in the microdialysis perfusion buffer allows them to diffuse into ISF through the probes while simultaneously collecting ISF. By measuring tau protein as an example, the author shows how its levels are altered upon stimulating neuronal activity by reverse microdialysis of picrotoxin. Advantages and limitations of microdialysis are described along with the extended application by combining other in vivo methods.

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

In vivo microdialysis has enabled collection of molecules present in brain interstitial fluid (ISF) from awake, freely-behaving animals. In order to analyze relatively large molecules in ISF, the current article specifically focuses on the microdialysis protocol using probes with high molecular weight cut off membranes.

אין ויוו Microdialysis שיטת איסוף גדול חלבונים חוץ-תאית נוזל בין-תאי המוח עם משקל מולקולרי גבוה ניתוק רגשים

In vivo microdialysis is a powerful technique to collect ISF from awake, freely-behaving animals based on a dialysis principle. While microdialysis is an ...

Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats

Microdialysis is a well-established neuroscience technique that correlates the changes of neurologically active substances diffusing into the brain interstitial space with the behavior and/or with the specific outcome of a pathology (e.g., seizures for epilepsy). When studying epilepsy, the microdialysis technique is often combined with short-term or even long-term video-electroencephalography (EEG) monitoring to assess spontaneous seizure frequency, severity, progression and clustering. The combined microdialysis-EEG is based on the use of several methods and instruments. Here, we performed in vivo microdialysis and continuous video-EEG recording to monitor glutamate and aspartate outflow over time, in different phases of the natural history of epilepsy in a rat model. This combined approach allows the pairing of changes in the neurotransmitter release with specific stages of the disease development and progression. The amino acid concentration in the dialysate was determined by liquid chromatography. Here, we describe the methods and outline the principal precautionary measures one should take during in vivo microdialysis-EEG, with particular attention to the stereotaxic surgery, basal and high potassium stimulation during microdialysis, depth electrode EEG recording and high-performance liquid chromatography analysis of aspartate and glutamate in the dialysate. This approach may be adapted to test a variety of drug or disease induced changes of the physiological concentrations of aspartate and glutamate in the brain. Depending on the availability of an appropriate analytical assay, it may be further used to test different soluble molecules when employing EEG recording at the same time.

Here, we describe a method for in vivo microdialysis to analyze aspartate and glutamate release in the ventral hippocampus of epileptic and non-epileptic rats, in combination with EEG recordings. Extracellular concentrations of aspartate and glutamate may be correlated with the different phases of the disease.

Microdialysis של חומצות אמינו מעוררות במהלך ההקלטות EEG בחופשיות העברת חולדות

Microdialysis is a well-established neuroscience technique that correlates the changes of neurologically active substances diffusing into the brain ...

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The method is based on the specific binding of a radioligand to its biological target. Therefore, frozen tissue sections are incubated with radioligand solution, and the binding to the target is subsequently localized by the detection of radioactive decay, for example, by using photosensitive film or phosphor imaging plates. Resulting digital autoradiograms display remarkable spatial resolution, which enables quantification and localization of radioligand binding in distinct anatomical structures. Moreover, quantification allows for the pharmacological characterization of ligand affinity by means of dissociation constants (Kd), inhibition constants (Ki) as well as the density of binding sites (Bmax) in selected tissues. Thus, the method provides information about both target localization and ligand selectivity. Here, the technique is exemplified with autoradiographic characterization of the high-affinity &#947;-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in mammalian brain tissue, with special emphasis on methodological considerations regarding the binding assay parameters, the choice of the radioligand and the detection method.

The method of autoradiography is routinely used to study binding of radioligands to tissue sections for determination of qualitative or quantitative pharmacology.

Autoradiography כאל שיטה פשוטה ורבת -עוצמה עבור ויזואליזציה ואפיון של מטרות תרופתי

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

A Novel and Translational Rat Model of Concussion Combining Force and Rotation with In Vivo Cerebral Microdialysis

Persistent cognitive and motor symptoms are known consequences of concussions/mild traumatic brain injury (mTBIs) that can be partly attributable to altered neurotransmission. Indeed, cerebral microdialysis studies in rodents have demonstrated an excessive extracellular glutamate release in the hippocampus within the first 10 min following trauma. Microdialysis offers the clear advantage of in vivo neurotransmitter continuous sampling while not having to sacrifice the animal. In addition to the aforementioned technique, a closed head injury model that exerts rapid acceleration and deceleration of the head and torso is needed, as such a factor is not available in many other animal models. The Wayne State weight-drop model mimics this essential component of human craniocerebral trauma, allowing the induction of an impact on the head of an unrestrained rodent with a falling weight. Our novel and translational rat model combines cerebral microdialysis with the Wayne State weight-drop model to study, in lightly anesthetized and unrestrained adult rats, the acute changes in extracellular neurotransmitter levels following concussion. In this protocol, the microdialysis probe was inserted inside the hippocampus as region of interest, and was left inserted in the brain at impact. There is a high density of terminals and receptors in the hippocampus, making it a relevant region to document altered neurotransmission following concussion. When applied to adult Sprague-Dawley rats, our combined model induced increases in hippocampal extracellular glutamate concentrations within the first 10 min, consistent with the previously reported post-concussion symptomology. This combined weight-drop model provides a reliable tool for researchers to study early therapeutic responses to concussions in addition to repetitive brain injury, since this protocol induces a closed-head mild trauma.

Neurotransmitter alteration is a mechanism of neural dysfunction that occurs after concussion and contributes to the sometimes-catastrophic long-term consequences. This rat model combines microdialysis, allowing in vivo neurotransmitter quantification, with a weight-drop technique exerting rapid acceleration and deceleration of the head and torso, an important factor of human craniocerebral trauma.

מודל עכברוש הרומן והטרנסלבית של זעזוע מוח שילוב כוח וסיבוב עם Vivo מוחין מיקרודיאליזה

Persistent cognitive and motor symptoms are known consequences of concussions/mild traumatic brain injury (mTBIs) that can be partly attributable to ...

Real-Time Dynamic Collection of Hippocampal Extracellular Fluid from Conscious Rats Using a Microdialysis System

A variety of central nervous system (CNS) diseases are associated with changes in the composition of hippocampal extracellular fluid (HECF). However, difficulty in obtaining HECF in real time from conscious rats has long restricted the evaluation of CNS disease progression and the effectiveness of ethnomedicine therapy. Encouragingly, a brain microdialysis technique can be used for continuous sampling with the advantages of dynamic observation, quantitative analysis, and a small sampling size. This allows the monitoring of changes in the extracellular fluid content for compounds from traditional herbs and their metabolites in the brain of living animals. The aim of this study was thus to accurately implant a cerebrospinal fluid microdialysis probe into the hippocampal region of Sprague Dawley (SD) rats with a three-dimensional brain stereotaxic apparatus, cutting off molecular weights greater than 20 kDa. The high-quality HECF was then obtained from conscious rats using a microdialysis sampling control system with an adjustable sampling rate from 2.87 nL/min - 2.98 mL/min. In conclusion, our protocol provides an efficient, rapid, and dynamic method to obtain HECF in awake rats with the help of microdialysis technology, which provides us with unlimited possibilities to further explore the pathogenesis of CNS-related diseases and evaluate drug efficacy.

The protocol here provides a detailed real-time dynamic sampling of extracellular fluid from the hippocampus of awake rats using a microdialysis system.

איסוף דינמי בזמן אמת של נוזל חוץ-תאי בהיפוקמפוס מחולדות מודעות באמצעות מערכת מיקרודיאליזה

A variety of central nervous system (CNS) diseases are associated with changes in the composition of hippocampal extracellular fluid (HECF). However, ...

גירוי עצבי היקפי משולב ופרמטר דופק נשלט TMS

Combined Peripheral Nerve Stimulation and Controllable Pulse Parameter Transcranial Magnetic Stimulation to Probe Sensorimotor Control and Learning

Skilled motor ability depends on efficiently integrating sensory afference into the appropriate motor commands. Afferent inhibition provides a valuable tool to probe the procedural and declarative influence over sensorimotor integration during skilled motor actions. This manuscript describes the methodology and contributions of short-latency afferent inhibition (SAI) for understanding sensorimotor integration. SAI quantifies the effect of a convergent afferent volley on the corticospinal motor output evoked by transcranial magnetic stimulation (TMS). The afferent volley is triggered by the electrical stimulation of a peripheral nerve. The TMS stimulus is delivered to a location over the primary motor cortex that elicits a reliable motor-evoked response in a muscle served by that afferent nerve. The extent of inhibition in the motor-evoked response reflects the magnitude of the afferent volley converging on the motor cortex and involves central GABAergic and cholinergic contributions. The cholinergic involvement in SAI makes SAI a possible marker of declarative-procedural interactions in sensorimotor performance and learning. More recently, studies have begun manipulating the TMS current direction in SAI to tease apart the functional significance of distinct sensorimotor circuits in the primary motor cortex for skilled motor actions. The ability to control additional pulse parameters (e.g., the pulse width) with state-of-the-art controllable pulse parameter TMS (cTMS) has enhanced the selectivity of the sensorimotor circuits probed by the TMS stimulus and provided an opportunity to create more refined models of sensorimotor control and learning. Therefore, the current manuscript focuses on SAI assessment using cTMS. However, the principles outlined here also apply to SAI assessed using conventional fixed pulse width TMS stimulators and other forms of afferent inhibition, such as long-latency afferent inhibition (LAI).

מחבר זרקור: גירוי עצבי היקפי משולב ופרמטר דופק נשלט גירוי מגנטי תוך גולגולתי כדי לחקור שליטה סנסומוטורית ולמידה  

Short-latency afferent inhibition (SAI) is a transcranial magnetic stimulation protocol to probe sensorimotor integration. This article describes how SAI can be used to study the convergent sensorimotor loops in the motor cortex during sensorimotor behavior.

גירוי עצבי היקפי משולב ופרמטר דופק נשלט גירוי מגנטי תוך גולגולתי לבדיקת בקרה סנסומוטורית ולמידה

Skilled motor ability depends on efficiently integrating sensory afference into the appropriate motor commands. Afferent inhibition provides a valuable ...