העבודה הציגה נתמכה בחלקים על ידי מימון מן המכון הקנדי לבריאות מחקר / X השביר הקרן למחקר של תוכנית שותפות קנדה ל- RD, את ג&#39;רום לז קרן ל- RD, צנטרום Interdisziplinäres für klinische Forschung מאוניברסיטת ארלנגן-נירנברג RD ו מן דויטשה Forschungsgemeinschaft כדי RD ו RE. המחברים מבקשים להודות אינגריד Zenger לקבלת סיוע טכני עם תחזוקה תרבית תאים כמו גם פרופ &#39;מ ווגנר להכנת וקטור pCMV5-FLAG זמין. המחברים עוד רוצים במיוחד להודות נדיה שרדר על התמיכה המועילה ירי הווידאו.

1. פתרונות מניות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend אבקת המוטיב הפעיל lyophilized ב סטרילי H 2 O לריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / μl. הקש בזהירות לערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן aliquots קטן (למשל, 12 μl כל, 2 μl נדרשים לכל תגובה) ולאחסן אותם ב -20 ° C. </li></ol> 2. הכנת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתאי יונקים זרע כגון HEK293 תאים או נוירונים העיקרי על צלחת 24 היטב 500 μl מדיום הגידול כולל אנטיביוטיקה. הערה: בעת שימוש נוירונים, זרע התאים בצפיפות נמוכה ולהשתמש רק בשתי השורות באמצע 24 את הצלחת היטב. כל טוב תצטרך ובכך גרסה מקבילה ריק נמל המדיום במהלך הדגירה (שלב 4.2). בעת טיפול נוירונים, תמיד לוודא כי התאים אינם נשמרים מחוץ בחממה במשך יותר מכמה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות התאים בתנאים מתאימים (humidified, 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס) עד התאים הם אפליקציה. 50%ומחוברות. הערה: בעת שימוש נוירונים, תרבות התאים עד לשלב ההתפתחותי הרצוי הוא הגיע ולשנות אפליקציה. 25-50% של המדיום פעמיים בשבוע. בינוני: בינוני Neurobasal (המכיל 1x B27, 5 מ&quot;מ L- גלוטמין ו 1x פניצילין סטרפטומיצין, להשוות עם נ&quot;צ 16). </li></ol> 3. גיבוש קומפלקס מרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל תגובה, לדלל 0.1-2 מיקרוגרם של POI או הנוגדן המקביל כמו גם חלבון בקרה, או נוגדן שליטה, בהתאמה, ב 50 μl של PBS. הערה: הטכניקה פועלת גם עם מתחמי macromolecular המורכב נוגדנים מראש הנכנס יסודי ותיכון (cp &#39;נציג תוצאות&#39;, איור 1.). מערבבים ספין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימה, לדלל פתרון מניות 2 μl המרכבה ב 50 μl של PBS באמצעות צינורות נפרדים כדי למנוע אסוציאציה עצמית של המרכבה. מערבבים ספין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את POI מדולל או נוגדן (שלב 3.1) כדי דילול המרכבה ידי pipetטינג. מערבבים ספין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (מתחמי המרכבה-POI יהוו). </li></ol> 4. Transfection של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את מתחמי המרכבה (שלב 3.4) ב 100 μl מחומם מראש מדיום הגידול (37 ° C, ללא תוספים). הסר בינוני לשטוף את התאים פעם באמצעות מחומם מראש 1x PBS. הערה: בעת שימוש נוירונים, לא כדאי לזרוק את המדיום, זה יהיה לעשות בה שימוש חוזר. שמור את זה על 37 מעלות צלזיוס. לרחצה, השתמש PBS המכיל 0.5 מ&quot;מ MgCl 2 ו CaCl 2. הצעה: לשמור המדיום בבארות ריקות בעוד דוגרי הצלחת (שלב 4.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל הפתרון מורכב המרכבה (שלב 4.1) אל התאים לטלטל את התאים בעדינות כדי להבטיח חלוקה שווה של הפתרון. לגדל את התאים בתנאים סטנדרטיים (שלב 2.2) במשך שעה 1. להוסיף סרום לריכוז סופי של 10%. בעת שימוש נוירונים, להוסיף את המדיום בשלב 4.1. לגדל את התאים במשך 1 עד 2 שעות יותר. הערה:זמן דגירה אופטימלי תלוי בגודל ומאפיינים של המטען ועשוי צריך להיות מותאם באופן אמפירי. ההצעות הבאות עשויות לשמש כקו מנחה: לקבלת פפטידים, hr 1 הוא בדרך כלל מספיק עבור חלבונים 1-2 שעות מומלצות עבור נוגדנים 2 hr, ועבור transfection של נוירונים עם נוגדנים 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תהליך לניתוח כרגיל. שים לב: הטכניקה היא תואמת ניסויים תוך שימוש בפרוטוקולי קיבעון וכן הדמיה לחיות. </li></ol> הדמיה 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר, לקחת Z- ערימות של תאים ו / או תאים תאים של עניין באמצעות כ 0.25-0.5 מיקרומטר המרחק. מרחק השכבה המדויק תלוי בגודל של המבנה להיות משוחזרים ועליו להיקבע בנפרד. </li></ol> 6. שחזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלבים הבאים, השתמש התחתון Esc כדי לעבור בין בחירה וניווט, CNTR כדי לבחור מספר אובייקטים על ידי לחיצה on אותם משמרת מפתח לחתוך אובייקטים (CP. צעד 6.10). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הקובץ-LSM ב Imaris. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות התאמת תצוגה לכל ערוץ, בניגוד לתמונה עד המבנים המבריקים להגיע רוויה. יש לציין כי התאמה זו לא תשפיע על בניית השטח, היא משמשת רק כדי לסייע למנהל הניסוי thresholding התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש על סמל הוספת משטחים חדשים. אשף יפתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר: מגזר רק אזור של עניין. המשך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את השוליים של תיבת הבחירה כדי להתאים מושא ההתעניינות שלך. נא לזכור שהתמונה יש 3 ממדים וכי הבחירה צריכה להיות מותאמת על מטוס z גם כן. אם הצורה המלבנית של תיבת הבחירה לא צריכה להתאים את מושא העניין כהלכה, כבה את האובייקט ו / או להגדיל את התיבה עד שכל המבנים הדרושים מוטבעים. אובייקטים לא רצויים ניתן להסיר בהמשך (CP. צעד 6.10). לְהִתְקַדֵם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את ch המתאיםannel. רמת הפירוט של שטח פנים או קוטר כדור צריך להיות מוגדר כדי להתאים את המבנים משוחזרים. בהתאם למאפייני האות, או אינטנסיביות מוחלטת או ניגודיות מקומיות יכולה לשמש. באופן כללי, ניגודיות מקומי עובד טוב יותר עבור אותות מפוזרים. בכל מקרה, את ההגדרות צריכות להיות מותאמות בנפרד עבור כל אות או מבנה של עניין, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש באפשרות קביעת ערכי הסף, לשחזר את המבנה של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלם את השחזור על ידי לחיצה על החלק התחתון החץ הירוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את האובייקט עוד יותר על ידי שימוש באפשרות העיפרון כדי לחתוך ולהסיר משטחים כנדרש. אפשר רק לחתוך בכיוון צפון-דרום, ולכן, הטו את התמונה על מנת לחתוך את האובייקט הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג מדידות של נפח, שטח ועוצמות לכל משטח ידי סטטיסטיקות בחירה, סטטיסטיקות מפורטות, וערכים ממוצעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (שלב אופציונלי) כדי להתבונן הסטטיסטיקה בצבעים (CP. 2E איור </sטרונג&gt; ו- F), בחרו את כרטיסיית הצבע של פני השטח המקבילים ולסמן &#39;סטטיסטיקה מקודדת&#39; במקום &#39;המאגר&#39;. מספר אפשרויות יוצג. </li></ol>

<ol>
	<li>Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T., Abbas, A. K., Galli, S. J., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 7, 219-245 (2012).</li><li>Jiang, T. F., Chen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunction+of+two+lysosome+degradation+pathways+of+alpha-synuclein+in+Parkinson's+disease:+potential+therapeutic+targets?.">Dysfunction of two lysosome degradation pathways of alpha-synuclein in Parkinson's disease: potential therapeutic targets?.</a> Neurosci Bull. 28, 649-657 (2012).</li><li>Howlett, D. R., Richardson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathology+of+APP+transgenic+mice:+a+model+of+Alzheimer's+disease+or+simply+overexpression+of+APP?.">The pathology of APP transgenic mice: a model of Alzheimer's disease or simply overexpression of APP?.</a> Histol Histopathol. 24, 83-100 (2009).</li><li>Carlson, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Modification+of+the+Phenotypes+Produced+by+Amyloid+Precursor+Protein+Overexpression+in+Transgenic+Mice.">Genetic Modification of the Phenotypes Produced by Amyloid Precursor Protein Overexpression in Transgenic Mice.</a> Human molecular genetics. 6, 1951-1959 (1997).</li><li>Jiao, X. F., Wang, Z., Kiledjian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+mRNA-secapping+regulator+implicated+in+X-linked+mental+retardation.">Identification of an mRNA-secapping regulator implicated in X-linked mental retardation.</a> Mol. Cell. 24, 713-722 (2006).</li><li>Fukami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+member+of+a+gene+family+on+Xp22.3,+VCX-A,+is+deleted+in+patients+with+X-linked+nonspecific+mental+retardation.">A member of a gene family on Xp22.3, VCX-A, is deleted in patients with X-linked nonspecific mental retardation.</a> Am. J. Med. Genet. 67, 563-573 (2000).</li><li>Van Esch, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+VCX-A+due+to+NAHR+plays+a+major+role+in+the+occurrence+of+mental+retardation+in+patients+with+X-linked+ichthyosis.">Deletion of VCX-A due to NAHR plays a major role in the occurrence of mental retardation in patients with X-linked ichthyosis.</a> Human molecular genetics. 14, 1795-1803 (2005).</li><li>Sebat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+association+of+de+novo+copy+number+mutations+with+autism.">Strong association of de novo copy number mutations with autism.</a> Science. 316, 445-449 (2007).</li><li>Tartaglia, G. G., Pechmann, S., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+on+the+edge:+a+link+between+gene+expression+levels+and+aggregation+rates+of+human+proteins.">Life on the edge: a link between gene expression levels and aggregation rates of human proteins.</a> Trends Biochem Sci. 32, 204-206 (2007).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (2011).</li><li>Uchino, K., Ochiya, T., Takeshita, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+therapeutics+and+applications+of+microRNAs+in+cancer+treatment.">RNAi therapeutics and applications of microRNAs in cancer treatment.</a> Jpn J Clin Oncol. 43, 596-607 (2013).</li><li>Li, T., Wu, M., Zhu, Y. Y., Chen, J., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+RNA+interference-based+therapeutics+and+application+of+multi-target+small+interfering+RNAs.">Development of RNA interference-based therapeutics and application of multi-target small interfering RNAs.</a> Nucleic Acid Ther. 24, 302-312 (2014).</li><li>DeVincenzo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise,+pitfalls+and+progress+of+RNA-interference-based+antiviral+therapy+for+respiratory+viruses.">The promise, pitfalls and progress of RNA-interference-based antiviral therapy for respiratory viruses.</a> Antivir Ther. 17, 213-225 (2012).</li><li>Fellmann, C., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+RNA+interference+rules+for+silencing.">Stable RNA interference rules for silencing.</a> Nat Cell Biol. 16, 10-18 (2014).</li><li>Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide+carrier+for+the+delivery+of+biologically+active+proteins+into+mammalian+cells.">A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 19, 1173-1176 (2001).</li><li>Derlig, K., Gie&#223;l, A., Brandst&#228;tter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Characterisation+of+Simiate,+a+Novel+Protein+Linked+to+the+Fragile+X+Syndrome.">Identification and Characterisation of Simiate, a Novel Protein Linked to the Fragile X Syndrome.</a> PLoS One. 8, e83007 (2013).</li><li>Derlig, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simiate+is+an+Actin+binding+protein+involved+in+filopodia+dynamics+and+arborisation+of+neurons.">Simiate is an Actin binding protein involved in filopodia dynamics and arborisation of neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, (2014).</li><li>Loudet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-covalent+delivery+of+proteins+into+mammalian+cells.">Non-covalent delivery of proteins into mammalian cells.</a> Org Biomol Chem. 6, 4516-4522 (2008).</li><li>Nagel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+microspheres+as+protein+transduction+reagents.">Polymeric microspheres as protein transduction reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 13, 1543-1551 (2014).</li><li>Selim, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-osteoactivin+antibody+inhibits+osteoblast+differentiation+and+function+in+vitro.">Anti-osteoactivin antibody inhibits osteoblast differentiation and function in vitro.</a> Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 13, 265-275 (2003).</li><li>Jain, A., Brady-Kalnay, S. M., Bellamkonda, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Rho+GTPase+activity+alleviates+chondroitin+sulfate+proteoglycan-dependent+inhibition+of+neurite+extension.">Modulation of Rho GTPase activity alleviates chondroitin sulfate proteoglycan-dependent inhibition of neurite extension.</a> J Neurosci Res. 77, 299-307 (2004).</li><li>Watanabe, S., Wakasugi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+function+of+human+neuroglobin+is+correlated+with+its+guanine+nucleotide+dissociation+inhibitor+activity.">Neuroprotective function of human neuroglobin is correlated with its guanine nucleotide dissociation inhibitor activity.</a> Biochem Biophys Res Commun. 369, 695-700 (2008).</li><li>Eguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+nuclear+localization+signal+for+nuclear+transport+of+DNA-encapsulating+particles.">Optimization of nuclear localization signal for nuclear transport of DNA-encapsulating particles.</a> J Control Release. 104, 507-519 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד את המשמעות של רמות ביטוי חלבון בשליטת תפקודים תאיים באופן מונע מינון. הפרוטוקול המתואר מאפשר מניפולציה מכוילת של ביטוי חלבון סוגי תאים יונקים שונים, כוללים נוירונים בהיפוקמפוס, ומכאן להקל מחקרים מפורטים של תפקוד חלבון ברמה התאית. למרות התערבות RNA מייצגת אסטרטגיה ידועה למטה להסדיר אתרים מעניינים, יש בה החסרונות שלה (CP. 14). לא רק זיהוי של רצף מסוים מאוד ויעיל יכול להיות יקר זמן רב, אלא גם biogenesis תמליל בתוך התא עלול לגרום לתוצאות לא צפויות מאז ההצטברות של מבני RNA רעילים, עומס יתר של מכונות יצוא הגרעיניות כמו גם רווי של מערכות עיבוד אנדוגני RNAi עלולות לגרום השפעות חוץ-יעד או יעיל. כמו כן, כמויות גדולות של וקטורי RNAi אקסוגניים עלולות לגרום unsתופעות pecific, וגם להפריע הומאוסטזיס תא. נוגדנים, מצד השני, לא דורשים עיבוד נוסף ע&quot;י מנגנונים אנדוגניים ברגע שהם נכנסו לתא, ייכנסו לתוקף באופן מיידי, ובכך לתמוך לא רק ניסויים חוסכים זמן, אבל גם חקירות של תהליכים תאיים מיידיים. למרות שהם עשויים להיות השפעות מחוץ יעד נוקבים, גם המספר הגדל והולך של מאופיין היטב מאוד ספציפי נוגדנים הזמינים עושה חלופה זו שווה מחשבה. מאז הלידה של מתחמי macromolecular לתאים מייצג מכשול מרכזי, טכניקות transfection שונים פותחו במהלך השנים האחרונות, כולל פפטידים R8 ו azoR8 18 וכן הדילוגים בתיווך microsphere 19. בעוד R8 ו azoR8 צוינו להתנהג בדומה המרכבה 18, נמצאו microspheres לדרוש 24 שעות לספיגה 19, שהינה ארוכה בהרבה מ המרכבה בתיווךקטעי טאי טענו עלולים לגרום לקשיים כאשר לומדים תגובות הסלולר תלויות מהר מנה. למרבה הפלא, טכניקת המרכבה התבררה לחול על תרבויות בהיפוקמפוס עיקריות, אשר רגישות מאוד טיפולים קשים transfect. עד כה, ספקי מרכבה שמשו לנתח תפקוד חלבון בתרבויות אוסטאובלסטים עיקריות 20 וכן שורת תאי נוירובלסטומה-גליומה NG108-15 21, שורש הגבה חומוס תרבויות גרעיני 21, או בתאי PC12 22, אשר מקורם העצבי ציצה, אך לא דווח על כל יישום בתרביות תאים שמקורם במערכת העצבים המרכזי זמינה עדיין. מאז ריאגנטים transfection מסורתיים כגון Lipofectamine אינם יעילים בתאים אלה ויראלי transfections מסובך, מרכבה עשויה לייצג חלופה מעניינת. יש לציין, המרכבה עצמה נצפתה למקם לגרעין 15, כנראהבשל PKKKRKV אות לוקליזציה הגרעין שלה (CP. 23). עולים בקנה אחד עם התצפיות הללו, מצאנו כי transfection בתיווך המרכבה של מקרומולקולות rbαSimiate-gtαrbAlexa568 הביא תיוג ברור של תאים גרעיניים כגון כתמים גרעיניים. ואכן, נוגדנים בקרה כגון gtαgpAlexa568 אותרו גם בגרעין של שניהם, HEK293 ותאי בהיפוקמפוס העיקרי. מאז נוגדנים, בפרט מכלולים, הם הרבה יותר מדי גדולים כדי לצאת הגרעין ידי דיפוזיה ומאז Simiate עצמו אינו מכיל אות לוקליזציה גרעינית ידועה, אלא נכנס הגרעין באמצעות דיפוזיה, סביר להניח כי אות המרכבה מעורבת לוקליזציה גרעינית של נוגדנים. לחלופין, תחבורת מכלולי חלבון גדולים יכולה להיות גם אפשרית, אם כי זה לא יסביר את נוכחותו של gtαgpAlexa568 בגרעין של נוירונים בהיפוקמפוס התרבותיים של חולדות, שכן אין יעד נוגדן זה בתאים אלה. יתר על כן, סיNCE המרכבה נמצאה לא להפריע לוקליזציה הטבעית של פפטידים וחלבונים דלגו 15, תצפיות אלה מראים כי נוגדנים מתנהגים באופן שונה. ואכן, כאשר shuttling מתחמי נוגדנים כגון המרכבה-rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (איור 1) או המרכבה-gtαgpAlexa568 (איור 5) על פני קרום התא, הם מופיעים באשכולות, אשר רק לפזר, כאשר חלבונים היעד המתאים כגון Simiate אנדוגני או FLAG-Simiate נוכחים (רק באיור 1). באמצעות מרכבת מתחמי נוגדן אוסטאובלסטים, סלים ומכללות ציינו את אותו האפקט 20. בהתחשב בכך המרכבה הודגמה שלא להפריע הלוקליזציה של פפטידים וחלבונים 15, תצפיות אלו מצביעות על כך המרכבה התאספה נוגדנים לפרק רק אם קיים מנגנון מולקולרי כגון אינטראקצית נוגדן-יעד, אשר מתגבר על היתר הידרופוביפעולות בין מרכבת מטען הנוגדן שלה, ולכן מעודד פירוק. בגלל נוגדנים כבדים יותר פפטידים או ביותר חלבונים אחרים ויש להם, בשל צורתם, משטח גדול, הם עשויים לשייך עם מספרים גבוהים יותר של מולקולות מרכבה / או אינטראקציה יותר קשוח עם פפטידים מרכבה, אשר ובכך יקדמו יותר מרכבה מונחה התנהגות של נוגדנים. חוסר מנגנון פירוק ולכן יביא מראה אשכולות וכן לוקליזציה גרעינית של מטען הנוגדנים (איור 5). יחדיו, הנתונים מראים כי המרכבה מתאימה במיוחד גם כדי לענות על תפקודם של חלבונים המתגוררים בגרעין שזה ישים במגוון סוגי תאים היונקים כולל נוירונים בהיפוקמפוס עיקריים.

פיקוח הדוק של ביטוי החלבון חיוני בכל אורגניזם חי לפקד פיתוח משלה, כמו גם להגיב לאותות סביבתיים. לפיכך, מספר רב של מנגנונים הומצא במהלך האבולוציה כדי לווסת את רמת הביטוי בדיוק של כל חלבון המקודד על ידי היישום. 20,000 גנים קיימים בכל תא אוקריוטים בכל זמן נתון של החיים שלה. המתרחשים בשלבים שונים של ייצור חלבונים, מנגנוני ויסות נעים מניהול מבנה הכרומטין, שעתוק RNA טיפול לכיוון שינויי חלבון posttranslational, תחבורה ושפלה. לכן זה לא מפתיע כי תקלות מנגנונים מולקולריים שבבסיס ורמות ביטוי חלבון שינה נקשרו עם מחלות שונות כגון סרטן או מוגבל שכלי. ואכן, הסתכלות על המורכבות הבלתי המסולקות של התפתחות עצבית ואת תפקוד מוח יונק, Sensitivity של מערכות מתוחכמות אלו שינויים בביטוי חלבון מתבטא בגירעונות אינטלקטואלי כמה ידועים כולל אלצהיימר ומחלת פרקינסון (AD ו- PD) וכן הפרעות הספקטרום האוטיסטי (ASD) כמו תסמונת ה- X השביר (FXS). המחלה האחרונה מתאפיינת misexpression נרחב של מגוון של חלבונים, אשר בשל האובדן של חלבון מווסת תרגום יחיד, FMRP (חלבון ה- X שביר נפש הפיגור) 1-4. יתר על כן, rearrangements כרומוזומליות המשפיע על התשלום משתנה x חלבון צמוד (VCXA), חלבון, מנהלת יציבות mRNA ותרגום ידי שינוי mRNA מכסת 5, נקשר לאחרונה עם גירעונות רוחניים, ואילו מוטציות נקודתיות לא מזוהות בחולים בעלי מוגבלויות קוגניטיביות נכון לעכשיו 6, 7, הדבר המצביע על כך הליקויים הנפשיים ציינו מקורן ביטוי VCXA שינה וביטוי dysregulated של prote היעד שלהins. בקנה אחד עם ממצאים אלה, כך עולים ממחקר החוקר האם דה נובו וריאציות מספר עותק של גנים הקשורים ASD נקבע כי כפילויות ומחיקות גן ברומן הן גורמות סיכון משמעותי עבור 8 ASD, ובכך תומכות ברעיון כי רמות ביטוי חלבון גבוהות או פחתה עלולות לגרום גירעונות רוחניים. למרבה הפלא, המחקרים האחרונים ספקו עוד ראיות כי רמת הביטוי של חלבון נתון מותאמת בדיוק כדי למנוע הצבירה שלה וכתוצאה מכך כמויות חלבון גבוהות עם כמעט ללא שולי בטיחות 9. לפיכך הוצע כי גם במרווחים קטנים הם מספיק כדי לגרום מחלות כמו אלצהיימר PD 9. למרות המגוון של מנגנונים מולקולריים תורמים לשליטת חלבון ביטוי מרמז תכנית תקנה מורכבת לאור ממצאים אלה, כך עולים ממחקר חוקר את רמת הביטוי של למעלה מ -5,000 גנים יונקים 10 הוכיח כיהטבע העדיף תכנית חסכנית יותר: השפע של החלבונים הוצג להיות מוסדרת בעיקר ברמה של תרגום 10, ובכך הממחיש שהנהלת זמינות RNA המשמשת בעיקר מכוונני ביטוי חלבון. לימוד המנה של חלבונים בעלי עניין (POI) לכן זה לא חשוב רק על ההבנה של הפונקציות אנדוגני של חלבון, אלא גם כדי החקירה של מחלות רבות בפיתוח שיטות ריפוי. לפיכך, בעשורים האחרונים ראו התקדמות מספר אסטרטגיות באמצעות התערבות RNA לתמרן מינון POI. למרות התערבות RNA נעשה שימוש נרחב כדי ללמוד לתפקד חלבון ואף מוחל בניסויים קליניים לטיפול במחלות סרטן או עינית וכן להמשיך טיפולים אנטי בחולים 11-13, קשיים עלולים להתעורר אשר עלול להפוך את האסטרטגיה בלתי אפשרי. לדוגמא, רצף הזרע, אשר מניע את המציאה על ידי הומולוגיה הוא comparaקצר ble, ומכאן קידום השפעות חוץ-היעד. מאז רצפים יעילים ביותר הם נדירים צריכים להימצא בין אלף אפשרויות (הנסקרת ב 14), זיהוי הרצף הנכון יכולים להיות זמן רב ויקר, אך תוצאות עדיין עשויות להיות מאכזבות. אסטרטגיה חלופית היא למקד את נקודת העניין ישירות על ידי נוגדנים. כאן, אנו ממחישים את השימוש המרכבה נושאת חלבון (מתוצרת Active Motif) כדי להפחית זמינות חלבון הסלולר, ואת העסקתם של שחזורים תלת מימדי ללמוד תפקוד החלבון הבאים עקום למטה. המוטיב הפעיל של מרכבה, עצם פפטיד 2.8 kDa, משמש פפטידים הסעות, חלבונים ונוגדנים פני ממברנות של תאי יונקים 15. מקורבי פפטיד עם אתרים מעניינים על ידי יצירת מתחמי macromolecular מצמידים הלא קוולנטית ניצול אינטראקציות הידרופוביות, שבעקבותיה מתחמי המרכבה-POI הן הפנימו לתוך התאים בתוך ind-אנדוזוםבאופן ependent. חשוב לציין, המרכבה צוינה כדי לא להשפיע על הלוקליזציה התאית של חלבונים דלגו, ולא להפעיל השפעות ציטוטוקסיות או להשפיע על הפעילות הביולוגית של מטענה 15.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chariot</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>30025</td>
			<td>store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>warm up to 37&#176;C before using</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1xB27</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td>store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25030-149</td>
			<td>store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Penicilline and Streptomycine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>expensive, but unmatched</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying protein function and the role of altered protein expression by antibody interference and three-dimensional reconstructions

ניהול קפדני של ביטוי חלבון הוא לא רק חיוני כל אורגניזם חי, אלא גם אסטרטגיה חשובה לחקור פונקציות חלבון במודלים הסלולר. לכן, מחקר שנעשה לאחרונה המציא כלים שונים למקד ביטוי חלבון בשורות תא יונקים או אפילו במודלים של בעלי חיים, כולל RNA והפרעת נוגדן. בעוד האסטרטגיה הראשונה אסף תשומת לב רבה במהלך שני העשורים האחרונים, פפטידים בתיווך טרנסלוקציה של מטעני נוגדן פני ממברנות הסלולר לתאים, השיגו עניין הרבה פחות. בפרסום זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כיצד לנצל נשאית פפטיד בשם המרכבה בתאי כליה עובריים אנושיים כמו גם נוירונים בהיפוקמפוס העיקרי לבצע ניסויים התערבות נוגדן ובהמשך להדגים את יישום שחזורים תלת מימדי בניתוח תפקוד החלבון. הממצאים שלנו מראים כי המרכבה הוא, ככל הנראה בשל אות לוקליזציה הגרעין שלה, particularly היטב מתאים למקד חלבונים המתגוררים סומה הגרעין. למרבה הפלא, כאשר פונים מרכבה לתרבויות בהיפוקמפוס עיקרית, מגיב התברר להתקבל באופן מפתיע גם על ידי נוירונים ניתקו.

בפסקאות הבאות, תוצאות למופת ממחישות מציאה תפקודית של POI (Simiate, לפרטים נוספים ראו 16, 17) באמצעות ריאגנט מרכבת הפרעת נוגדן מוצג. הממצאים מלמדים כי ביטוי פחתה של Simiate פוגע פעילות תעתיק, ו, בצורת מינון תלויה, גורם לאפופטוזיס, שהגיע לשיאה בשיעורי תמותה של מעל 99% אם כמויות נוגדנים גבוהות (&gt; 1 מיקרוגרם נוגדן) מוחלות (תגליות אלה פורסמו בעבר 16). הנה, עכשיו אנחנו מציגים את הטכניקות ופרוטוקולים מועסקים בפירוט יתר להדגים כיצד מרכבה מגיב יכולים לשמש כדי transfect נוירונים בהיפוקמפוס ניתקו בתרבויות עיקריות. על מנת לבדוק האם פפטידים מרכבה לאפשר עבור דילוגים יעילים של נוגדנים, בפרט, אם נוגדנים אלה להישאר תפקודיים במהלך ההליך, הבענו FLAG-Simiate למשך 24 שעות בתאים HEK293, ובהמשך transfected התאים ניצול המרכבה מצמידים מקרומולקולות rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (איור 1). בונת FLAG-Simiate מתבטאת היטב על ידי HEK293 תאים localizes אל somata וכן הגרעינים של תאים אלה (איור 1 א). הנה, FLAG-Simiate אשכול משמעותי (איור 1B), ובכך שיקוף החלוקה המנומרת של אנדוגני Simiate בגרעין. מתחמי הנוגדן דלגו על פני הממברנה התאית מופיעים מכלולים (איור 1 א, ב חצים אדומים, אדום), אבל הנוגדנים שוחררו לזהות FLAG-Simiate במיוחד כפי שמוצג על ידי colocalization עמוק של FLAG-Simiate ואת מקרומולקולות rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (איור 1B , ב חץ צהוב, צהוב). נכון פתק, הניסוי לא רק מוכיח כי הנוגדנים להישאר תפקודיים במהלך מרכבה בתיווךמעבר קרום, אבל הם גם יכולים להיכנס לגרעין. מאז גודלם אינו כולל נוגדנים מן היציאה את הגרעין באמצעות דיפוזיה, סביר להניח כי אות הלוקליזציה הגרעינית נוכח המרכבה כשלעצמה מאפשרת את טרנסלוקציה של מקרומולקולות rbαSimiate-gtαrbAlexa568 לתוך הגרעין. ואכן, מכלולי נוגדנים הם נצפו גם באותם מקומות או, בהתאמה, את התא הגרעיני (איור 1 ב &#39;, חיצים אדומים). שימוש rbαSimiate-מרכבת קומפלקסים כדי לרוקן Simiate אנדוגני תפקודי בתאי HEK293 (איור 2), מצאנו כי הצלחנו למקד עד 80% מהאתרים מחייבים rbαSimiate, באמצעות 2.0 מיקרוגרם של נוגדנים 16. מעניין לציין כי בעוד shuttling נוגדנים gtαrbAlexa568 לבד לתוך HEK 293 תאים לא הייתה השפעה ברורה על הופעת כתמים גרעיני (איור 2 א-ג), אובדן Simiate פונקציונלי radiused כתמים גרעיני (איור 2 ד-F &lt;/ strong&gt;, cp. 16) כפי שמודגם על ידי שחזורים תלת מימדי (תרשים 2B, C לעומת E, F), באופן תלוי מינון, אפופטוזיס (איור 3, cp. 16). בהתחשב בכך תאים עצביים רגישים מאוד להשפעות רעילות, יש לנו גם ליישם את הטכניקה בתרבויות בהיפוקמפוס עיקרית (איור 4). שימוש assay TUNEL ו MAP2 מכתימים לנתח תא שלמות, לא מצאנו השפעה על הכדאיות של נוירונים כאשר משווים תאים מדומים או מטופל מרכבת מטופלים (אפליקציה. תאים חיוביים TUNEL 20-25% לאחר 1 + 4 שעות של הטיפול, cp. 4.4 -4.6). לפיכך, בדקנו נוגדן מרכבה בתיווך shuttling בתרבויות עצביות. בעקבות תכנית היישום אותו, מכלולי נוגדן gtαgpAlexa568 נראו שונים משתרעת על 83% מכלל התאים, שם הם התרחשו somata וכן גרעינים (איור 5 א). תצפיות אלה נתמכות עוד ביה ניתוח תלת ממדי (איור 5) והדוק להרכיב מחדש את התמונה הנראית בתאי HEK293, יחד ובכך הממחישות כי טכניקת המרכבה יכולה לשמש בהצלחה transfect ניתקה נוירונים בהיפוקמפוס עיקריים גם כן. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53049/53049fig1highres.jpg" width="700" /> איור 1. FLAG-Simiate הוא זוהה על ידי נוגדנים ספציפיים Simiate דלגו לתוך HEK293 תאים באמצעות ריאגנט מרכבה. בניסויי התערבות נוגדנים, נוגדני rbSimiate-gtrbAlexa568 היו preassembled לפני ההיווצרות מורכבת מרכבה-נוגדן. א) HEK293 תאים המבטאים מתויג FLAG Simiate. מכלולי נוגדן Simiate להיכנס סומה וכן הגרעין הבא יישום, שם הם colocalize במיוחד עם FLAG-Simiate. נקודות עגולות: מכלולי המרכבה-rbSimiate-gtrbAlexa568 (חצים אדומים). ב) גדלת מתח גבוהה של האזור התאגרףב (א) הממחיש את colocalization של FLAG-Simiate ו מרכבה בתיווך אות Simiate (חיצים צהובים). שימו לב לנוכחות של מכלול נוגדן המרכבה בגרעין (חץ אדום). סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53049/53049fig2highres.jpg" width="700" /> איור 2. Simiate ספציפי נוגדנים דילג לתאים HEK293 להפריע תפקודים תאיים של אנדוגני Simiate. A, B) HEK293 תאים שטופלו המרכבה-gtrbAlexa568 (1 מיקרוגרם) לשמש מלאה. באדום, אנדוגני Simiate יוצג בצבע שווא, תוך מכלולי המרכבה-gtrbAlexa568 אינם מוצגים. כתמים גרעיני תויגו באמצעות SC35 חלבון סמן (בירוק), ואילו תאים אפופטוטיים זוהו על ידי assay TUNEL (בכחול). B) שחזור של כתמים גרעיניים מהאזור התאגרף C א) שחזור של אותו אזור ממחישות כרכי רבב ועל פני שטחיםבאופן צבע מקודד. D, E) HEK293 תאים בעקבות טיפול המרכבה-rbSimiate (0.5 מיקרוגרם). מכלולים אנדוגני Simiate וכן המרכבה-rbSimiate-gtrbAlexa568 מוצגים באדום, בעוד כתמים גרעיני תאים אפופטוטיים מוצגים על פי A ו- B. E) כתמים גרעיני משוחזר מאזור התאגרף ד F) האזור אותו מוצג אנא המתאימות ל- C. לציין את מראה radiused וצבירה של כתמים (כל השחזורים: תוכנת Imaris). בר סולם ב C, F: 2 מיקרומטר. כל ברים אחרים בקנה המידה: 10 מיקרומטר. 1) לשיקום תלת ממדים, תאים שאינם אפופטוטיים רק שמשו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53049/53049fig3highres.jpg" width="700" /> איור 3. מינון גבוה של המרכבה-rbSimiate-gtrbAlexa568 לגרום מוות של תאים מסיביים. HEK293 תאים טופלו עם 2 מיקרוגרם של המרכבה-gtrbAlexa568 או מרכבה-rbSimiate-gtrbAlexa568, בהתאמה (הן comp<html> lexes לראות בירוק מסומן בחצים כמו גם בהגדלה). תיוג TUNEL (בכחול) יושם כדי לזהות תאים אפופטוטיים. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53049/53049fig4highres.jpg" width="550" /> מרכבת איור 4. אינה רעילה נוירונים בהיפוקמפוס עיקריים. א.ב.) DIV 7 נוירונים היו או מטופלים ודגמים (בינוניים, א) או נתון הגיב מרכבה (B) כפי שמתוארים בפרוטוקול עבור נוגדן shuttling (1 + 4 שעות, cp. 4.4-4.6). בעוד SC-35, חלבון סמן כתם גרעיני, שמש לתייג את מכונות שעתוק שחבור, מכתים TUNEL יושם כדי לזהות תאים אפופטוטיים (חצים ירוקים). C) מטופל המרכבה מטופלים DIV 16/17 נוירונים. מכתים MAP2 יושם כדי להמחיש את העצים הדנדריטים. ברי סולם: 10 מיקרומטר. pload / 53,049 / 53049fig5highres.jpg &quot;width =&quot; 700 &quot;/&gt; איור 5. transfection בתיווך המרכבה תואם תרבויות העצבית. א) תא עצב בהיפוקמפוס העיקרי נציג div 5. התמונה מראה z-תחזיות של ערימות נלקח באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר (מיקרוסקופ סורק לייזר 710, Zeiss). סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. שים לב קר מתחמי המרכבה-gtgpAlexa568 (אדום) בגרעין סומה של התא. B) שחזור תלת ממדי (תוכנת Imaris) של הגרעין וכן מכלולי gtgpAlexa568 שמוצג א סומה דנדריטים של הנוירון מסומנת על ידי נקודות אפורות, אשר מזוקקות מן התיוג של אנדוגני Simiate. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. כמות נוגדן transfected: 0.25 מיקרוגרם.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions at JoVE.com

Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions

Controlling protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions in cellular models. The protocol presented shows the application of antibody interference in mammalian cells including primary hippocampal neurons and demonstrates the use of three-dimensional reconstructions in studying protein function.

תפקוד חלבון לימוד ותפקיד ביטוי חלבון לשנות על ידי הפרעת נוגדן שחזור תלת ממדי

A strict management of protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions ...

studying-protein-function-role-altered-protein-expression-antibody

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.6K Views.  University of Erlangen-Nuremberg. Controlling protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions in cellular models. The protocol presented shows the application of antibody interference in mammalian cells including primary hippocampal neurons and demonstrates the use of three-dimensional reconstructions in studying protein function.

Video: Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance. The abundance of membrane proteins in cells underlies the need for comprehensive study of the folding of this ubiquitous family of proteins. Additionally, advances in our ability to characterize diseases associated with misfolded proteins have motivated significant experimental and theoretical efforts in the field of protein folding. Rapid progress in this important field is unfortunately hindered by the inherent challenges associated with membrane proteins and the complexity of the folding mechanism. Here, we outline an experimental procedure for measuring the thermodynamic property of the Gibbs free energy of unfolding in the absence of denaturant, &Delta;G&deg;H2O, for a representative integral membrane protein from E. coli. This protocol focuses on the application of fluorescence spectroscopy to determine equilibrium populations of folded and unfolded states as a function of denaturant concentration. Experimental considerations for the preparation of synthetic lipid vesicles as well as key steps in the data analysis procedure are highlighted. This technique is versatile and may be pursued with different types of denaturant, including temperature and pH, as well as in various folding environments of lipids and micelles. The current protocol is one that can be generalized to any membrane or soluble protein that meets the set of criteria discussed below.

This video article details the experimental procedure for obtaining the Gibbs free energy of membrane protein folding by tryptophan fluorescence.

תרמודינמיקה של קיפול חלבונים ממברנה נמדד על ידי הקרינה ספקטרוסקופיה

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

אלגינט הידרוג לתרבות תלת ממדי איברים של השחלות Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

הדפסה מישוריים תלת ממדי של דיו מוליך

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

גנרטור ביטוי חלבון תפוקה גבוהה באמצעות פלטפורמת Microfluidic

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason for this is that folding takes place over a wide range of timescales, from nanoseconds to seconds or longer, depending on the protein1. Conventional stopped-flow mixers have allowed measurement of folding kinetics starting at about 1 ms. We have recently developed a microfluidic mixer that dilutes denaturant ~100-fold in ~8 &mu;s2. Unlike a stopped-flow mixer, this mixer operates in the laminar flow regime in which turbulence does not occur. The absence of turbulence allows precise numeric simulation of all flows within the mixer with excellent agreement to experiment3-4.
Laminar flow is achieved for Reynolds numbers Re &le;100. For aqueous solutions, this requires micron scale geometries. We use a hard substrate, such as silicon or fused silica, to make channels 5-10 &mu;m wide and 10 &mu;m deep (See Figure 1). The smallest dimensions, at the entrance to the mixing region, are on the order of 1 &mu;m in size. The chip is sealed with a thin glass or fused silica coverslip for optical access. Typical total linear flow rates are ~1 m/s, yielding Re~10, but the protein consumption is only ~0.5 nL/s or 1.8 &mu;L/hr. Protein concentration depends on the detection method: For tryptophan fluorescence the typical concentration is 100 &mu;M (for 1 Trp/protein) and for FRET the typical concentration is ~100 nM.
The folding process is initiated by rapid dilution of denaturant from 6 M to 0.06 M guanidine hydrochloride. The protein in high denaturant flows down a central channel and is met on either side at the mixing region by buffer without denaturant moving ~100 times faster (see Figure 2). This geometry causes rapid constriction of the protein flow into a narrow jet ~100 nm wide. Diffusion of the light denaturant molecules is very rapid, while diffusion of the heavy protein molecules is much slower, diffusing less than 1 &mu;m in 1 ms. The difference in diffusion constant of the denaturant and the protein results in rapid dilution of the denaturant from the protein stream, reducing the effective concentration of the denaturant around the protein. The protein jet flows at a constant rate down the observation channel and fluorescence of the protein during folding can be observed using a scanning confocal microscope5.

In this work we explain the fabrication and use of a microfluidic mixer capable of mixing two solutions in ~8 &mu;s. We also demonstrate the use of these mixers with spectroscopic detection using UV fluorescence and fluorescence resonance energy transfer (FRET).

מערבלים microfluidic ללימוד קיפול חלבונים

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

חקירת הפרדת הזרימה התלת מימדית הנגרמת על ידי מודל פוליפ קיפול ווקאלי

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the additional advantage of short development and production times, but expression levels can vary significantly between batches thus giving rise to regulatory concerns in the context of good manufacturing practice. We used a design of experiments (DoE) approach to determine the impact of major factors such as regulatory elements in the expression construct, plant growth and development parameters, and the incubation conditions during expression, on the variability of expression between batches. We tested plants expressing a model anti-HIV monoclonal antibody (2G12) and a fluorescent marker protein (DsRed). We discuss the rationale for selecting certain properties of the model and identify its potential limitations. The general approach can easily be transferred to other problems because the principles of the model are broadly applicable: knowledge-based parameter selection, complexity reduction by splitting the initial problem into smaller modules, software-guided setup of optimal experiment combinations and step-wise design augmentation. Therefore, the methodology is not only useful for characterizing protein expression in plants but also for the investigation of other complex systems lacking a mechanistic description. The predictive equations describing the interconnectivity between parameters can be used to establish mechanistic models for other complex systems.

We describe a design of experiments approach that can be used to determine and model the influence of transgene regulatory elements, plant growth and development parameters, and incubation conditions on the transient expression of monoclonal antibodies and reporter proteins in plants.

אפיון של מערכות מורכבות באמצעות העיצוב של גישת ניסויים: ביטוי חלבון חלוף בטבק כמקרה מבחן

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

ייצור רקמת סחוס אנושי באמצעות שלושה ממדי הזרקת דיו טכנולוגיית הדפסה

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

דור של עור בעובי מלא תלת ממדי Equivalent ואוטומטי פציעה

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.