אנו רוצים להודות ד&quot;ר סקוט הנדרסון לעזרה עם מיקרוסקופיה confocal. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות 1RO1CA127501 כדי WAB, כמו גם מימון הפרויקט טייס ממרכז הסרטן מאסי ואת בית הספר לרפואה (VCU) כדי מיקרוסקופית WAB בוצע ב-VCU Dept. לנוירוביולוגיה &amp; אנטומיה מיקרוסקופית מתקן, נתמך, בין היתר, במימון מרכז NIHNINDS הליבה מענק 5P30NS047463.

פרוטוקול מורכב משלושה שלבים עיקריים. השיבוט הראשון, הצעד של הגן העניין שלך לתוך ביטוי יונקים וקטור אמינו סופני לגירסאות monomeric של CFP ו / או YFP יהיה רק ​​דנו בקצרה. השלבים השני והשלישי; transfection של דנ&quot;א לתוך וקטור EA.hy926 לתאי אנדותל, הדמיה confocal עם סריג, המפורטות יותר לעומק בהמשך. 1. בנייה של קולטנים CFP ו YFP chimeric רצפטורים של עניין צריך להיות משובטים אמינו סופני כדי monomeric גרסאות משופרות של CFP ו YFP. קביעת סריג היא אמפירית תלויה באופן קריטי על אורך של והמקשר בין הטרנסממברני פורש האזור תחילת fluorophore 1. לכן, באורכים שונים של והמקשר חייב להיחקר עבור כל זוג קולטן חדש תחת חקירה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Into the pcDNA3.1 hygro R או ניאו וקטור המכיל C-R או monomeric YFP (זה וקטור ניתן לקבל במעבדה שלנו), שיבוט קולטן העניין שלך לתוך האתרים NheI / EcoRI. * הערה, אם יש צורך, NheI תואם אנזימים אחרים, כולל SpeI ו XbaI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרה התגובה קשירת שלך לתוך קו התא המתאים recA endA1 המוסמכת (אנו משתמשים באופן שגרתי Mach1). מושבות מסך נוכחות של הכנס ואחריו רצפי DNA כדי לוודא היעדר מוטציות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם קבלת קונפורמציה של שיבוט מולקולרי מוצלח, להכין transfection כיתה DNA וקטור במים מעוקרים או TE באמצעות Qiagen, או דומה, ערכות ה-DNA. הערכת הריכוז טוהר באמצעות ספקטרוסקופית UV. התשואות אופיינית של ה-DNA צריך להיות בטווח של 100-200 מיקרוגרם, שהוא מדולל באופן שגרתי למלאי עבודה של 1 מיקרוגרם / μL. </li></ol> 2. Transfection של 926 תאים EA.hy <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול EA.hy 926 תאים 4, גדל להשלים-DMEM (DMEM 10% בסרום שור עוברית + Pen. / דלקת.) לתוך MatTek coverslip (מס &#39;0) 35 מ&quot;מ עם מנות בינוני 2 מ&quot;ל. אתה יכול להשיג שמרני ~ 15 מנות (~ 90% ומחוברות למחרת) מתוך קערה ומחוברות 15 ס&quot;מ. הכינו צלחת אחת להעריך הביטוי של הקולטן בנפרד, כמו גם מנה אחת לכל זוג הקולטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר התאים כדי לדגור לילה באווירה 5% CO 2 ב 37 ° C. למחרת, תרבויות יש ~ ומחוברות 70-90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום transfection, להכין את מתחמי nucleolipid ידי ערבוב 2 מיקרוגרם של ה-DNA וקטור chimeric קולטן (2 μL) עם 8 μL של Fugene6 ב 200 μL של OptiMEM מראש התחמם. עבור זוגות קולטן, transfect עם 1 מיקרוגרם של קולטן זה, עבור סכום כולל של מיקרוגרם 2 (ראה גם דיון בהמשך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופת הדגירה, להכין את התאים transfection. לשאוב את התקשורת טרי לשטוף כל צלחת בעדינות בקצרה עם PBS חמים לפני תוספת של 2 מ&quot;ל מראש חימם להשלים-DMEM ללא אנטיביוטיקה (DMEM + FBS). חשוב למנוע את נוכחותו של פניצילין וסטרפטומיצין, כפי שהם הרבה יותר רעיל לתאים במהלך הטיפול עם Fugene6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הירידה מורכב חכם תאים דגירה של 20-24 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס אווירה של 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, לשאוב היטב את התקשורת בין התאים פיפטה טרי שלם, DMEM עם אנטיביוטיקה. בעקבות transfection, כדאיות התא צריך להישאר גבוהה יחסית, כלומר לא מעט תאים צף יש לשים לב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התבטאות גנים היא מקסימאלית בדרך כלל לאחר 48-60 שעות נוספות שלאחר transfection. עם זאת, הדמיה אפשרית בדרך כלל קצר כמו 24 שעות. כמובן הזמן ניסויים על ביטוי גנים אופטימלי יש לבצע. </li></ol> 3. הדמיה confocal ו סריג ניתוח חיים הדמיה תא מבוצע על מיקרוסקופ TCS-SP2 לייקה confocal לייזר AOBS סריקה מצויד דיודה כחולה (405 ננומטר), ארגון (458, 476, 488, 514 ננומטר). HeNe ירוק (543 ננומטר), כתום HeNe (594 ננומטר), ו HeNe אדום (633 ננומטר) לייזרים, PI HCX Apo 63x/1.3 na-גליצרין טבילה העדשה אובייקטיבי, XY ממונע הבמה (Märzhäuser), וכן לשלוט לסביבה ( טמפרטורה, לחות, ו-CO 2) שלב החממה (Pecon). שולטת ניסויית הן קריטיות כדי לחסל fluorophore צולבות לדבר בין ערוצי פליטה כמו גם להעריך בעיות הביטוי הלא ספציפית multimerization fluorophore. ככזה, transfections fluorophore יחיד מנוצלים עבור הקמת כל מושב התמונה. שלילי סריג שולטת (באמצעות קולטנים noninteracting ידוע) יהיה צורך לבצע, על מנת לקבוע את הרקע סריג כי מתרחשת עקב הבעת פני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע crosstalk בין ערוצי הפליטה CFP ו YFP, במקום לשלוט ביטוי CFP לתוך החממה הבמה. בעזרת אור לבן, להתאים את Z-צלחת להתמקדאל התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת הגדרות SP חלון לגילוי פליטה של ​​CFP על 465-505 ננומטר ו YFP על 525-600 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד ניטור שני ערוצי הפליטה, להלהיב את CFP ב 458 ננומטר. שימוש AOTF, להגדיר את כוח לייזר לחסל לדמם ניכר של מעל CFP לתוך התעלה פליטת YFP. שמור הגדרה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו את אותה שליטה על YFP crosstalk (באמצעות השלט ביטוי YFP) בערוץ CFP ידי התאמת כוח עירור ב 514 ננומטר עבור תאים להביע YFP בלבד. שמור הגדרה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים המקום הבא שיתוף להביע CFP ו YFP לתוך החממה הבמה. באמצעות קביעת רצף של התוכנה לייקה confocal, לאתר תאים להביע רמות דומות של CFP ו YFP עם לוקליזציה קרום תקין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש acceptor תוכנה לייקה צילום הלבנת התוכנית, קבע את הגדרות התורם acceptor כדי CFP הציל וההגדרות YFP, בצורה מכובדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקרבות אל התא, להדגיש את ההחזר על ההשקעה (אזור של אינטרס) שבו צילום הרס YFP היא מתרחשת על קרום התא ולהתחיל את התוכנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הרס תמונה של acceptor, להתאים את AOTF עד 100% ב 514 ננומטר ולאפשר לייזר הלבנת להימשך עד 70% מכלל הפליטה YFP כבר תיגמר. כדי להאיץ את הלבנה, ROIs נבחרים בדרך כלל הציר סריקה של הלייזר (ציר ה-X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך צילום הלבנה, לנטר את התנועה הסלולר לדחות מדידות שהושג עם התנועה ניכר מטוס-XY, כמו מדידות אלו ניתן לדווח שקר סריג יעילות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות טרום ופוסט אקונומיקה נרשמות גם עבור התורם (CFP) ו acceptor (YFP) ו סריג יעילות מחושב: סריג EFF = (D-D הודעה מראש) / D הודעה לכל פוסט D&gt; ד מראש כאשר D מראש ו-D הוא לפרסם את עוצמת התורם לפני ואחרי photobleaching בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנת JMP (SAS) משמש כדי לקבוע את מידת ההשתנות ניסיוני. </li></ol> 4. נציג תוצאות יעילות transfection הם בדרך כלל בין 30% עד 40. למרות ממצאים קודמים על ידי אחרים, לא ראינו כי transfection וביטוי של וקטור אחד טובות של האחר. אכן, לעתים קרובות אנו רואים ביטוי הבלעדית של fluorophore one הכימרה או אחר. אופיינית סריג יעילות להשתנות בין מערכות הקולטן. עבור מערכת הקולטן עניבה, הערכים האופייניים הם 20-28% עבור תאים אפיתל 19-23% בתאי האנדותל. עבור פקדים שלילית, יעילות טיפוסית להלן 2-3%. מידת ההשתנות יקטן במידה ניכרת עם ניסיון. <img src="/files/ftp_upload/2149/2149fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. תמונות נציג transfected EA.hy 926 תאים. תמונה) DIC monolayer של 926 תא EA.hy. ב) תמונה פלואורסצנטי של תאים מוצג (A). ג) כיסוי של (א) ו - (ב) הוכחת יעילות ~ transfection 20-30%. <img src="/files/ftp_upload/2149/2149fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. Acceptor נציג צילום הלבנת ניתוח של סריג המתרחשים בין CFP ו YFP בתא EA.hy926. הפליטה CFP ערוץ (לוחות עליון) YFP פליטת ערוץ (למטה שני פאנלים) נוטרו בנפרד לפני ו acceptor הודעה photobleaching. ניסויים photobleaching הוגבלו, ועל סריג ערכים מחושבים מן, האזור בתוך הקופסה הירוקה. סריג יעילות מוצג מגוון מוחלט מ גבוה (אדום 1.0) לנמוך (סגול 0.0) על כיסוי מוגדל של CFP / YFP הממוזגת תמונה לצורך התמצאות בלבד.

<ol>
	<li>Kim, M., Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+transmembrane+signaling+by+cytoplasmic+domain+separation+in+integrins.">Bidirectional transmembrane signaling by cytoplasmic domain separation in integrins.</a> Science. 301, 1720-1725 (2003).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipidmodified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipidmodified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296, 913-916 (2002).</li><li>Seegar, T. C. M., Eller, B., Tzvetkova-Robev, D., Kolev, M., Henderson, S. C., Nikolov, D. B., Barton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tie1-Tie2+interactions+mediate+functional+differences+between+angiopoietin+ligands.">Tie1-Tie2 interactions mediate functional differences between angiopoietin ligands.</a> Molecular Cell. 37 (5), 643-655 (2010).</li><li>Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permanent+cell+line+expressing+human+factor+VIII-related+antigen+established+by+hybridization.">Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (12), 3734-3737 (1983).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

ישנם מספר צעדים אשר הם קריטיים להצלחה. הבולט ביניהם הוא קרוב משפחה של רמות ביטוי בין שני קולטנים chimeric. כדי לעקוף בעיה זו, ניתן להפוך את שורות תאים יציבות להביע הן חלבונים של עניין, או לזהות יחס אופטימלי של ה-DNA וקטור לאפשר ביטוי שווה. כמו כן, בשל transfection לא אחידה על פני צלחת, רמות החלבון יהיה לעתים רחוקות להיות שווה בין תאים. לכן, יש לשים לב כדי להבחין בין &quot;גבוה&quot; expressors מ &#39;נמוך&#39;. אלה כי רמות &quot;ממוצעים&quot; התצוגה של החלבון בדרך כלל תשואה אמין לשחזור סריג יעילות. שיטה אחת במעבדה שלנו קידמה כדי להקל על בעיה זו הוא השימוש adeno ו-lenti וירוסים ביטוי גנים &quot;אפילו&quot;. יתר על כן, שיטה חלופית כדי צילום הלבנת acceptor לקביעת סריג יעילות היא פליטה רגיש. אמנם, למרות הפוטנציאל של פליטת רגיש כדי לפקח על תאים בודדים בזמן אמת, מצאנו צילום הלבנת acceptor להיות רגישים יותר ואמין יותר. לבסוף, בעזרת סריג לפקח על אינטראקציות חלבון יכול להיות מאתגר, דורש בחירה זהירה של אורכי מקשר עבור קולטני קרום כבול. יתר על כן, תוספת של C / YFP לעתים קרובות מאוד משפיע על רמות ביטוי חלבון ותוצאות צבירה ב reticulum endoplasmic ומכשירים golgi. עם זאת, עבור אינטראקציות חולף או לא יציב, סריג הוא מתודולוגיה האידיאלי לנצל.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11960-069</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin- Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15070-063</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>N/A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Opti-MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11058-021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FUGENE 6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11814443001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslip Dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corp.</td>
<td>P35G014C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pcDNA3.1(+)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>V790&#x2010;20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mach 1 Competent Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C862003</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

imaging protein-protein interactions in vivo

חלבונים אינטראקציות הם סימן ההיכר של כל תהליכים תאיים חיוניים. עם זאת, רבים של אינטראקציות אלה חולף, או חלש אנרגטית, מניעת הזיהוי שלהם באמצעות ניתוח בשיטות ביוכימיות מסורתיים כגון immunoprecipitation שיתוף. בהקשר זה, את החלבונים פלורסנט encodable גנטית (GFP, RFP, וכו &#39;) שלהם קשורה חופפים ספקטרום הקרינה חוללו מהפכה ביכולת שלנו לפקח על אינטראקציות חלשות in vivo באמצעות תהודה פורסטר העברת אנרגיה (סריג) 1-3. כאן, אנו בפירוט השימוש שלנו assay סריג מבוסס הקרבה לניטור קולטן קולטן אינטראקציות על פני תא האנדותל.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Protein-protein Interactions in vivo at JoVE.com

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

פרוטוקול זה מתאר כיצד חלבונים תמונה אינטראקציות באמצעות assay סריג מבוססי הקרבה.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

imaging-protein-protein-interactions-in-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

21.2K Views.  Virginia Commonwealth University. פרוטוקול זה מתאר כיצד חלבונים תמונה אינטראקציות באמצעות assay סריג מבוססי הקרבה.

Video: Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

Split-יוביקוויטין ממברנה שמרים בהתבסס שני היברידי (מיתוס) מערכת: כלי רב עוצמה עבור זיהוי חלבונים אינטראקציות

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

In-vivo גילוי של חלבונים אינטראקציות על מיקרו-בדוגמת משטחים

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by providing improved methodology for the identification of inhibitors for such binding sites and which represent the majority of potential drug targets. The main goal of this paper is to provide a methodological overview of the use and application of the REPLACE strategy which involves computational and synthetic chemistry approaches. REPLACE is exemplified through its application to the development of non-ATP competitive cyclin dependent kinases (CDK) inhibitors as anti-tumor therapeutics. CDKs are frequently deregulated in cancer and hence are considered as important targets for drug development. Inhibition of CDK2/cyclin A in S phase has been reported to promote selective apoptosis of cancer cells in a p53 independent manner through the E2F1 pathway. Targeting the protein-protein interaction at the cyclin binding groove (CBG) is an approach which will allow the specific inhibition of cell cycle over transcriptional CDKs. The CBG is recognized by a consensus sequence derived from CDK substrates and tumor suppressor proteins termed the cyclin binding motif (CBM). The CBM has previously been optimized to an octapeptide from p21Waf (HAKRRIF) and then further truncated to a pentapeptide retaining sufficient activity (RRLIF). Peptides in general are not cell permeable, are metabolically unstable and therefore the REPLACE (REplacement with Partial Ligand Alternatives through Computational Enrichment) strategy has been applied in order to generate more drug-like inhibitors. The strategy begins with the design of Fragment ligated inhibitory peptides (FLIPs) that selectively inhibit cell cycle CDK/cyclin complexes. FLIPs were generated by iteratively replacing residues of HAKRRLIF/RRLIF with fragment like small molecules (capping groups), starting from the N-terminus (Ncaps), followed by replacement on the C-terminus. These compounds are starting points for the generation of non-ATP competitive CDK inhibitors as anti-tumor therapeutics.

We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

פיתוח של מעכבי חלבונים אינטראקציות דרך להחליף: בקשה לעיצוב ומעכבי CDK התחרותי הפיתוח ללא ATP

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

הכרומטין immunoprecipitation Assay עבור זיהוי של אינטראקציות החלבון-דנ&quot;א ארבידופסיס<em&gt; In vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. The majority of cellular activities require physical interactions between proteins. To analyze and map these interactions, various experimental techniques as well as bioinformatics tools were developed. Autophagy is a cellular recycling mechanism that allows the cells to cope with different stressors, including nutrient deprivation, chemicals, and hypoxia. In order to better understand autophagy-related signaling events and to discover novel factors that regulate protein complexes in autophagy, we performed protein-protein interaction screens. Validation of these screening results requires the use of immunofluorescence and immunoprecipitation techniques. In this system, specific autophagy-related protein-protein interactions that we discovered were tested in Neuro2A (N2A) and HEK293T cell lines. Details of the technical procedures used are explained in this visualized experiment paper.

Presented here are two antibody-based protein-protein interaction research techniques: immunofluorescence and immunoprecipitation. These techniques are suitable for studying physical interactions between proteins for the discovery of novel components of cellular signaling pathways and for understanding protein dynamics.

חקר אינטראקציות חלבון במחקר Autophagy

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות ללמוד אינטראקציות חלבון-חלבון וקינטיקה ב DNA נגעים מתקדמות

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...