This research was supported in part by a National Research Service Award (T32GM07616) from the National Institute of General Medical Sciences.

1. התקנה ניסיונית והכנת דוגמאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק microtoroids באמצעות יתוגרפיה, תחריט, ונמס הליך כפי שתואר לעיל 6. לפברק microtoroids על גבי פרוסות סיליקון (שבב) שיש לי קוטר גדול של 80-100 מיקרומטר, וקוטר קטן של 2 מיקרומטר בדרך כלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להירגע בערך מטר של סיבים במצב יחיד אופטיים (125 חיפוי מיקרומטר, 4.3 מיקרומטר קוטר שדה במצב) מסליל הסיבים שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצע החלק התיר של הסיבים האופטיים, להפשיט קטע קטן (2.5 סנטימטרים) של ציפוי הפולימר סביב הסיב האופטי באמצעות חשפניות תיל. הערה: זה הוא החלק מהסיבים האופטיים שישמשו לevanescently זוג אור לתוך microtoroid. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את הסיבים הפשיטו עם אלכוהול isopropanol ומוך חופשי למחוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיק חלק זה של הסיבים במקום באמצעות בעל סיבים עשוי מהדק מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסיבים הפשיטו דקים ל~ 500 ננומטר ידי meltinז ומושך באמצעות לפיד מימן ושני מנועי צעד נעים בכיוונים מנוגדים על 60 מיקרומטר / min. מקם את הסיבים האופטיים בתוך החלק העליון של הלהבה, שאמורה להיות ~ 10 מ&quot;מ גבוה. פסק למשוך הסיבים כאשר השידור דרך הסיבים מפסיק משתנה, אשר יכול להיות במעקב או חזותי (על ידי צפייה באור שמפוזר רוחבי ממצמוץ הסיבים לסירוגין) או על ידי חיבור הסיבים לphotodiode אשר מצורף לאוסצילוסקופ . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליב קצה אחד של הסיבים האופטיים ולהכניס אותו לתוך מתאם סיבים חשוף. הנח הקצה הזה של הסיבים לקלט של photoreceiver. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמה סיבי הקצה השני של סליל הסיבים לליזר באמצעות מצמד סיבים אופטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שבב microtoroid על גבי בעל מדגם (פלדת אל-חלד, 37.8 מ&quot;מ x 6.4 מ&quot;מ x 3.2 מ&quot;מ) או באמצעות אפוקסי או סרט דו צדדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר בעל מדגם על גבי שלב מיצוב שכולל של ננו-הבלטה 3-ציר (nשלב anocube) (ראה רשימת ציוד) על גבי מיקרומטר 3-ציר. לבצע את כל הניסויים על שולחן אופטי מבודד פניאומטית כדי למזער תנודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמדה גסה שבב המדגם באמצעות מיקרומטר 3-הציר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר מקביל שבב המכיל microtoroid לסיבים האופטיים באמצעות ננו-positioner. הערה: יישר את microtoroid במרחק של אורך גל אחד של אור הקלט (~ 633 ננומטר). להדמיה של תהליך זה משתמש בשתי עמודות הדמיה (צינור עם עדשה ומצלמה אובייקטיביות, לראות את רשימת ציוד) ממוקם בחלק העליון ובצד של השבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעל את הקיטוב של אור הלייזר המכוון דרך הסיבים האופטיים באמצעות בקר קיטוב ב- קו (ראה רשימת ציוד) עם ידית כדי להתאים את הקיטוב. הערה: קיטוב אופטימלי מושגת כאשר לטבול הנמדד בהעברת הסיב האופטי מופיע הצר. שים לב לטבול זה על אוסצילוסקופ (ראה שלב 2.2 לפרטים נוספים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לִבנוֹתמדגם קאמרי ידי epoxying coverslip זכוכית על הבמה המדגם באמצעות שקופיות מיקרוסקופ הזכוכית כspacer. הערה: מארז פרספקס מכסה את כל ההתקנה עשוי להיות שימושי עבור מזעור זרמי אוויר. פתח קטן יש להשאיר כדי לאפשר פתרון להישאב בבאמצעות צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרמית לאזן השעיות חלקיק או תמיסות מימיות מולקולה בודדת ל≥ 1 שעה באמבט מים RT (~ 500 מיליליטר). הערה: דוגמאות מדוללות לריכוז הרצוי בצינורות microcentrifuge באמצעות המאגרים הקשורים צוינו מהיצרן, למשל, PBS או HEPES. אם אין אירועים מחייבים מזוהים, להגדיל את ריכוז מלח למאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקיקי מערבולת המכילים פתרונות קצרים (1 מיליליטר) ל~ 2 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק פתרונות חלקיקים המכילים לתוך תא המדגם של 1 מיליליטר / דקה באמצעות משאבת מזרק 1 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המדגם קאמרי מילא, לכבות את משאבת המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן 30 שניות לפני שנתוני הקלטה כדי למזעראת ההשפעות של תנודות מכאניות הנובעות מזרימת נוזל שיכול להשפיע על המדידה. </li></ol> נעילת 2. תדר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-זוג toroid לסיבים האופטיים על ידי הזזת בעל המדגם עם nanopositioner, כי הצימוד יופרע בשל ההזרקה של נוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את גל התהודה של microtoroid ידי סריקת לייזר קלט מבוקר מחשב באמצעות מגוון רחב של אורכי גל. לבצע שלב זה על ידי שליחת אות מתח צורת גל משולשת לאלמנט פיזואלקטריים בתוך בקר הלייזר המסדיר את אורך הגל של הלייזר. לבצע ניסויים באמצעות אור הנראה (635 ננומטר ± 2.5 ננומטר) כפי שיש קליטה נמוכה של אור במים באורך גל זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את העברת האור דרך הסיבים האופטיים על ידי חיבור הפלט של הסיבים האופטיים לphotoreceiver אוטומטי מאוזנת. חבר את הפלט של photoreceiver לאוסצילוסקופ באמצעות כבל BNC. שים לב on אוסצילוסקופ כי באורך גל התהודה של microtoroid, שידור דרך הסיב האופטי טיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את הפלט של photoreceiver לכניסה הראשית של תדירות נעילת בקר משוב (ראה רשימת ציוד) באמצעות כבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את בקר משוב תדירות נעילה במצב נעילה אוטומטית באמצעות שיא העליון של נעילה עם תדר רעד של 2 קילוהרץ והמשרעת של תנודה אורך גל של 19 FM. באופן אמפירי להגדיר את ההגדרות יחסיות-נפרד נגזרות בחלון התוכנה באמצעות כללי כוונון זיגלר-ניקולס 14. הערה: ערכים אלה צריכים להיות מוגדרים רק פעם אחת בתחילת כל הניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Auto-לנעול את אורך הגל של הלייזר לגל התהודה של microtoroid. לבצע שלב זה לאחר מילוי המדגם קאמרי. הערה: אם שינוי אורך הגל גדול מדי, אז בקר המשוב יאבד מנעול ולעבור באופן אוטומטי למצב סריקה כדי לאתר את מיקום אורך גל תהודה. OC זהכלאיים לגל עובר גדולים יותר מכ אחד linewidth (לפחות 600 FM עבור כל המערכות נחקרו כאן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקליט את הפלט של בקר המשוב על 20 קילוהרץ באמצעות כרטיס רכישת נתונים 24 סיביות. לייצא את הנתונים כקובץ טקסט באמצעות תוכנת רכישת נתונים. </li></ol> 3. עיבוד נתונים וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התמרת פורייה נתונים בMATLAB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נמוך לעבור את הנתונים באמצעות מסנן &quot;לבנים-קיר&quot; עם הפסקת בkHz 1 כדי להסיר את תדר הרעד שהוטל של 2 קילוהרץ (ראה נוסף קוד קובץ 1 צילום המסך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המחשוב ברמה גבוהה לסנן את הנתונים באמצעות גודל חלון של 16 הרץ. הערה: זה נעשה כדי להסיר מקורות ידועים של רעש, במקרה זה, רעש 60 הרץ קו אלקטרוני וההרמוניות שלה, כמו גם 100 הרץ (מגיע מהנהג הלייזר) וההרמוניות שלה (ראה נוסף קוד קובץ 1 צילום המסך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורייה הפוך להמיר את הנתונים חזרה לתחום הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנן חציון נתונים באמצעות חלוןגודל של 1,001 דגימות (ראה נוסף קוד קובץ צילום המסך 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר שינויי צעד באורך גל התהודה באמצעות אלגוריתם הצעד-מציאת של et al Kerssemakers. 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור היסטוגרמות של משרעת של כל צעד מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב גודל חלקיקים באמצעות משוואה. (1) (ראה דיון). </li></ol>

<ol>
	<li>Lu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+nanoparticle+detection+using+optical+microcavities.">High sensitivity nanoparticle detection using optical microcavities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 5976-5979 (2011).</li><li>Su, J., Goldberg, A. F. G., Stoltz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+detection+of+single+nanoparticles+and+biological+molecules+using+microtoroid+optical+resonators.">Label-free detection of single nanoparticles and biological molecules using microtoroid optical resonators.</a> Light: Science and Applications. , (2016).</li><li>Knight, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single molecule biology. , (2009).</li><li>Jonsson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+biospecific+interaction+analysis+using+surface+plasmon+resonance+and+a+sensor+chip+technology.">Real-time biospecific interaction analysis using surface plasmon resonance and a sensor chip technology.</a> BioTechniques. 11, 620-627 (1991).</li><li>Vollmer, F., Arnold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whispering-gallery-mode+biosensing:+label-free+detection+down+to+single+molecules.">Whispering-gallery-mode biosensing: label-free detection down to single molecules.</a> Nat. Methods. 5, 591-596 (2008).</li><li>Armani, D. K., Kippenberg, T. J., Spillane, S. M., Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-Q+toroid+microcavity+on+a+chip.">Ultra-high-Q toroid microcavity on a chip.</a> Nature. 421, 925-928 (2003).</li><li>Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+microcavities.">Optical microcavities.</a> Nature. 424, 839-846 (2003).</li><li>Arnold, S., Khoshsima, M., Teraoka, I., Holler, S., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shift+of+whispering-gallery+modes+in+microspheres+by+protein+adsorption.">Shift of whispering-gallery modes in microspheres by protein adsorption.</a> Opt. Lett. 28, 272-274 (2003).</li><li>Vollmer, F., Arnold, S., Keng, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+virus+detection+from+the+reactive+shift+of+a+whispering-gallery+mode.">Single virus detection from the reactive shift of a whispering-gallery mode.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 20701-20704 (2008).</li><li>He, L., Ozdemir, S. K., Zhu, J., Kim, W., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+single+viruses+and+nanoparticles+using+whispering+gallery+microlasers.">Detecting single viruses and nanoparticles using whispering gallery microlasers.</a> Nat Nano. 6, 428-432 (2011).</li><li>Dantham, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+detection+of+single+protein+using+a+nanoplasmonic-photonic+hybrid+microcavity.">Label-free detection of single protein using a nanoplasmonic-photonic hybrid microcavity.</a> Nano Lett. 13, 3347-3351 (2013).</li><li>Baaske, M. D., Foreman, M. R., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+nucleic+acid+interactions+monitored+on+a+label-free+microcavity+biosensor+platform.">Single-molecule nucleic acid interactions monitored on a label-free microcavity biosensor platform.</a> Nat Nanotechnol. 9, 933-939 (2014).</li><li>Su, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Single+Exosome+Detection+Using+Frequency-Locked+Microtoroid+Optical+Resonators.">Label-Free Single Exosome Detection Using Frequency-Locked Microtoroid Optical Resonators.</a> ACS Photonics. (9), 1241-1245 (2015).</li><li>&#197;str&#246;m, K. J., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Feedback systems : an introduction for scientists and engineers. , (2008).</li><li>Kerssemakers, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+dynamics+of+microtubules+at+molecular+resolution.">Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution.</a> Nature. 442, 709-712 (2006).</li><li>Su, T. -. T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Label-free detection of single biological molecules using microtoroid optical resonators. , (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

כחלקיקים נקשר, גל התהודה (λ) של עליות toroid. אם חלקיק מסיר את חבלים מעל, גל התהודה יורד בהתאמה (אירוע צעד למטה). קוטר החלקיקים (ד) ניתן לקבוע באמצעות היסטוגרמות של משרעת של כל שלב אורך גל. הגובה של כל שלב אורך גל משתנה בהתאם לשינויים בגודל של החלקיקים הכבולים ובשל ?...

ניסויי זיהוי מולקולה בודדים הם שימושיים להפחתת כמות אנליטי המשמשת בחיישנים, לגילוי מוקדם של מחלה, ולבדיקת התכונות הבסיסיות של מולקולות 3. ניסויים כאלה בדרך כלל מבוצעים באמצעות תוויות, לעומת זאת, תוויות לא תמיד ניתן להשיג לחלבון מסוים, להגדיל את העלות, יכול להפריע האירועים הנחקרים, ויכולות להיות לא נוח, במיוחד בזמן אמת באתר ניסויים או נקודה-של- אבחון טיפול. תקן הזהב הנוכחי לbiosensing ללא תווית הוא תהודת plasmon פני השטח 4, עם זאת יש לי מערכות תהודת plasmon פני השטח המסחרית בדרך כלל גבול תחתון אופייני לזיהוי על סדר ננומטר. לאחרונה, תהודה אופטית צמחה כטכנולוגיה מבטיחה לbiodetection מולקולה בודדת ללא תווית 5. בהתבסס על הטווח הארוך (NS) תהודה עבודה אופטית כליאה של 6,7 אור. האור הוא evanescentlyבשילוב למכשירים אלה בדרך כלל באמצעות סיב אופטי. כאשר אורך הגל של האור עובר הסיבים תואם את אורך גל התהודה של המהוד, להדליק יעילות זוגות למהוד. אור שילוב זה לגמרי פנימי משקף בתוך החלל של מהוד יצירת שדה חלוף בקרבת ההיקף של המהוד. כחלקיקים להיכנס לתחום ולאגד חלוף למהוד, גל התהודה של שינויי המהוד באופן יחסי להיקף החלקיקים 8. במונחים של יכולת איתור, תהודה microsphere שקודם לכן שימשה לזיהוי שפעת יחידה חלקיקי נגיף (100 ננומטר) 9,10. לאחרונה, תהודה אופטית microsphere plasmonically משופר כבר משמשת לאיתור סרום שור יחיד אלבומין מולקולות 11 וoligonucleotides 8-Mer 12, לעומת זאת גישה זו מגבילה את האזור ללכוד חלקיקי 0.3 מיקרומטר 2 לדהסְגָן. חיישנים גדולים יותר באזור ללכוד הם אידיאליים למקסם את הסיכוי לגילוי חלקיקים. טכנולוגיות נוכחית מבוסס פתרון ללא תווית biosensing עם אזורי לכידה (&gt; 100 מיקרומטר 2) גדולים היו מוגבלות לגילוי חלקיקי פוליסטירן ≥ 25 ננומטר. פיתחנו מערכת ללא תווית biosensing המבוססת על טכנולוגית מהוד אופטית הידוע בתדר נעילה אופטי לוחש חלוף מהוד (פרח) 13 (איור 1), כי הוא מסוגל זיהוי של מולקולות בודדות בפתרון הזמן נפתרה. פרח משתמש החיים פוטון הארוכים של תהודה אופטית microtoroid בשילוב עם בקרת תדר נעילת משוב, זיהוי מאוזן, וסינון חישובית לאיתור חלקיקים קטנים עד מולקולות חלבון בודדות. השימוש בנעילת תדר מאפשרת המערכת תמיד לעקוב אחר תהודת ההסטה של ​​microtoroid כחלקיקים לאגד, ללא הצורך לטאטא או לסרוק את אורך גל הלייזר עלטווחים גדולים. העקרונות של פרח יכולים לשמש כדי לשפר את יכולות זיהוי של טכניקות אחרות, כוללים שיפור plasmonic. בדברים שלהלן, ההליכים לביצוע פרח מתוארים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="396">
	<tbody>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl63" height="20" style="height:15.0pt;width:99pt" width="132">Tunable diode laser</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Newport</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">TLB-6300</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl63" height="20" style="height:15.0pt;width:99pt" width="132">Laser controller</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Newport</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">TLB-6300-LN</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">Frequency locking feedback controller</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Toptica Photonics</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Digilock 110</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">Auto-balanced photoreceiver</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Newport</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Model 2007</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">In-line polarization controller</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">General Photonics</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">PLC-003-S-90</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">24-bit data acquisition card</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">National Instruments</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">NI-PCI-4461</td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl63" height="60" style="height:45.0pt;width:99pt" width="132">Recombinant human interleukin-2</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Pierce Biotechnology</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">R201520</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">20 nm polystyrene beads</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Thermo Scientific</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">3020A</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">NanoCube XYZ Piezo Stage</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Physik Instrumente</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">P-611.3</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl63" height="20" style="height:15.0pt;width:99pt" width="132">Optical table</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Newport</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">VH3660W-OPT</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">Objective lens for imaging column</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Navitar Machine Vision</td>
			<td class="xl64">1-60228</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">Imaging column (adaptor tube)</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Navitar Machine Vision</td>
			<td class="xl65">1-60228</td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl63" height="60" style="height:45.0pt;width:99pt" width="132">High-Res CCD camera for imaging column</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Edmund Industrial Optics</td>
			<td class="xl64">NT39244</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free single molecule detection using microtoroid optical resonators

יש גילוי ריכוזים קטנים של מולקולות עד לגבול המולקולה הבודד השפעה על תחומים כגון גילוי מוקדם של מחלה, ומחקרים בסיסיים בהתנהגות של מולקולות. שיטות לזיהוי מולקולה בודדות נפוצות לנצל תוויות כגון תגי ניאון או נקודות קוונטיות, לעומת זאת, תוויות לא תמיד זמינות, להגדיל את העלות ומורכבות, ויכולות להפריע האירועים נחקר. תהודה אופטית צמחה כאמצעי מבטיח לזהות מולקולות בודדות ללא השימוש בתוויות. נכון לעכשיו החלקיקים הקטנים ביותר שזוהו על ידי מערכת שאינה plasmonically משופרת חשופה אופטית מהוד בפתרון הוא תחום פוליסטירן 25 ננומטר 1. פיתחנו טכניקה המכונית תדר נעילה אופטי לוחש חלוף מהוד (פרח) שיכול לעלות ממגבלה זו ולהשיג זיהוי מולקולה בודד ללא תווית בתמיסה מימית 2. כעוצמת אות מאזניים עם חלקיקי נפח, העבודה שלנו מייצגת improveme 100x&gt;NT ביחס האות לרעש (SNR) על המצב הנוכחי של האמנות. כאן הנהלים מאחורי הפרחים מוצגים במאמץ להגדיל את השימוש שלה בתחום.

חלקיקים מחייבים אירועים נראים בבירור כשינויי צעד כמו באורך גל התהודה של microtoroid לאורך הזמן (איור 2 א). הגבהים של צעדים אלה מוצגים כהיסטוגרמה באיור 2. איורים 2-4 להראות עקבות נציג המחייב של exosomes (nanovesicles), חרוזים סיליקה 5 ננומטר, ואינטרלויקין -2 מול...

Watch this Scientific Journal Video about Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators at JoVE.com

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

ללא תווית מולקולה בודדת איתור באמצעות תהודה אופטית Microtoroid

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

label-free-single-molecule-detection-using-microtoroid-optical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.1K Views.  California Institute of Technology. We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented. 

Video: Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

Cre-P לקס גישה רקומבינציה לצורך זיהוי של Fusion Cell In vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

ללא קשר, לייבל ללא ניטור של תאים תאי מטריקס באמצעות ספקטרוסקופיית ראמאן

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

זיהוי אופטי של<em&gt; א coli</em&gt; חיידקים על ידי Biosensors הסיליקון Mesoporous

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma membrane1. To regulate neuronal excitability, the biophysical properties of ion channels are modified by signaling proteins and molecules, which often bind to the channels themselves to form a heteromeric channel complex2,3. Traditional assays examining the interaction between channels and regulatory proteins require exogenous labels that can potentially alter the protein&#39;s behavior and decrease the physiological relevance of the target, while providing little information on the time course of interactions in living cells. Optical biosensors, such as the X-BODY Biosciences BIND Scanner system, use a novel label-free technology, resonance wavelength grating (RWG) optical biosensors, to detect changes in resonant reflected light near the biosensor. This assay allows the detection of the relative change in mass within the bottom portion of living cells adherent to the biosensor surface resulting from ligand induced changes in cell adhesion and spreading, toxicity, proliferation, and changes in protein-protein interactions near the plasma membrane. RWG optical biosensors have been used to detect changes in mass near the plasma membrane of cells following activation of G protein-coupled receptors (GPCRs), receptor tyrosine kinases, and other cell surface receptors. Ligand-induced changes in ion channel-protein interactions can also be studied using this assay. In this paper, we will describe the experimental procedure used to detect the modulation of Slack-B sodium-activated potassium (KNa) channels by GPCRs.

Optical biosensor techniques can detect changes in mass near the plasma membrane in living cells and allow one to follow cellular responses in both individual cells and populations of cells. This protocol will describe detection of the modulation of potassium channels by G-protein coupled receptors in intact cells using this approach.

שימוש בBiosensors האופטי ללא תווית לזיהוי מודולציה של תעלות אשלגן על ידי קולטנים מצמידים G-חלבון

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulation של יחיד RNA מולקולות על ידי מלקחיים אופטיים

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Biochip אלקטרוכימי מבוסס Microfluidic לניתוח הכלאה DNA ללא תווית

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

טכניקה ללא תווית להדמית החלל-הזמן של פרשות תא בודדת

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי במישורים נתמך bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

ססגוניות קרינת איתור עבור מיקרופלואידיקה אגל באמצעות סיבים אופטיים

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...