המחברים מבקשים להודות לזמן קצר-Cheol הונג (MD, Ph.D., פרופסור חבר במחלקה למיילדות וגניקולוגיה, אוניברסיטת קוריאה ספר לרפואה) למתן רקמת שליה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות (R1211902) מקרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF), הרפובליקה של קוריאה.

הצהרת אתיקה: מחקר השליה האנושי נערך מכאן ולהבא, באישור דירקטוריון הסקירה המוסדית למחקר אנושי של אוניברסיטת קוריאה (AN09085-001). כל הניסויים בוצעו במתקן חדר נקי נבט-חינם במרכז הרפואי של אוניברסיטת קוריאה. העיצוב ונהלים באמצעות hPSCs הניסוי אושרו על ידי מועצת המנהלים המוסדית הסקירה של המרכז הרפואי של אוניברסיטת קוריאה (AN12277-003). 1. הכנה של מכשירים, תרבות מדיה, ומנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל מנות תרבות מעיל עם ג&#39;לטין 0.1%. מלוח החיטוי שנאגרו פוספט (PBS) ומלקחיים. לעקר מספריים כירורגיות, צינורות microcentrifuge, וגזה ב 121 מעלות צלזיוס מתחת psi £ 15 ליותר מ -15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.25% חומצה מוכנה מראש חימם אמין טריפסין-אתילן טטרה-אצטית (טריפסין-EDTA) ותקשורת מראש חימם תרבות המסוננת (DMEM) המכיל 20% בסרום שור עוברי (FBS), 100 U / פניצילין מיליליטר, 100 ג &#39;/ מיליליטר streptomycבלפני תחילת הליכים. </li></ol> 2. בידוד תא משלית האדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג רקמת שליה, לאחר לידה בניתוח קיסרית, מהנשים בהריון בריאה עוברת הפלה רגילה או טיפולית ב7-32 שבועות של הריון לאחר קבלת כתב הסכמה מדעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לי מומחה יילוד צלחות כוריוני אנושי שליה בניתוח נפרדת (HPCs) מהשליה; דגירה אלה ב0.25% טריפסין- EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ולאחר מכן לשטוף עם 5 מיליליטר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד villi כוריוני מHPCs באמצעות מספריים; ברר villi ולשטוף אותם שלוש פעמים עם 1ml PBS. לאחר מיותר, למקם את villi כוריוני לתוך צינור microfuge באמצעות קצה פיפטה; לשטוף את הדגימות עם 500 μl PBS על ידי pipetting למעלה ולמטה, וצנטריפוגה צינורות עבור 120 XG במשך 3 דקות. לשטוף רקמות פעמיים עם 500 μl של מדיום התרבות המחומם מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאים במדיום על צלחות מצופים ג&#39;לטין על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 </&gt;, ותחת 95% לחות משנה. טרום מעיל כל הצלחות עם ג&#39;לטין 0.1% עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. מושבות של תאים כמו פיברובלסטים-יהוו וצמיחה חסיד כ 5-7 ימים לאחר תחילת תרבות באותו המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליף הבינוני כל 2-3 ימים עד למעבר השלישי. במהלך התרבות, הסרת פסולת תא צף במדיום התרבות; fibroblasts השליה גדל יצרף לצלחת. תרבות התאים כמו פיברובלסטים הנגזרים מHPC עד מעבר -10 ולאחר מכן לקצור אותם לתרבויות hESC לאחר טיפול trypsinization וmitomycin-C (10 מיקרוגרם / מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הקפאת HPCs כדגימות מניות, להשתמש תגובת שרשרת השעתוק-פולימראז הפוך (RT-PCR) כדי לאשר שHPCs אינם מזוהמים עם פתוגנים שנפוצים להדביק את השליה, כולל mycoplasma (fermentans מ &#39;, hyorhinis מ&#39;, מ &#39;ארגינין, M . Orale, salivarium מ &#39;, מ&#39; hominis, pulmonis מ &#39;, arthritidis מ&#39;, neurolyticum מ &#39;, מ&#39; hyopneumoniae,ומ &#39; capricolum) ומיני חיידקים, urealyticum Ureaplasma, על ידי שימוש בערכה לגילוי mycoplasma. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר ההוראות של היצרן לבצע RT-PCR, להשתמש בכל צבעי יסוד ותערובות המסופקים בערכה. השתמש בsupernatants של התאים שכבר טיפחו במשך 36 ימים לגילוי mycoplasma. הוסף 3 μl של דגימות אלה לתערובות PCR ולבצע את הליך 1 st PCR במשך 35 מחזורים, כל אחת בהיקף של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ו -72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להוסיף 0.5 μl של מוצר st PCR 1 לתערובת PCR ולבצע את הליך 2 nd PCR במשך 30 מחזורי שימוש באותם תנאים כמו קודם. נתח את המוצרים מוגברים על ידי 1% ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose; להחיל 10 μl של כל אחד ממוצרי ה- PCR -1 ו -2 nd לג&#39;לי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם HPCs נמצא להיות מזוהם עם פתוגנים, לחסל אלהבאמצעות שילוב של אנטיביוטיקה (BM-Cyclin), הבא להוראות היצרן. להוסיף מדיום חדש המכיל 10 מיקרוגרם / מיליליטר של BM-Cyclin 1 במשך 3 ימים, ולאחר מכן לטפל בתאים עם 5 מיקרוגרם / BM-Cyclin מיליליטר 2 לעוד 4 ימים. חזור על מחזור זה פעמיים ולאחר מכן לבדוק זיהום mycoplasma שוב. </li></ol> 3. תאים נגזר שלית קציר אדם אוויר בינוני (hPCCM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר נטרול זיהום, טיפול בתאים המצורפים (מפגש 85-90%; (1.5 × 10 7 תאים / בקבוק) עם mitomycin-C (10 מיקרוגרם / מיליליטר) עבור 2 שעות ו -30 דקות, ושטף את התאים שלוש פעמים עם 10 מיליליטר PBS. דגירה התאים עם מדיום מראש התחמם ללא mitomycin-צלזיוס למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לאחר הטיפול, דגירה תאים ב 10 מיליליטר בינוני (DMEM-F12 בתוספת 20% החלפת סרום נוק-אאוט [KOSR], 0.1 מ&quot;מ β-mercaptoethanol, NEAA 1%, ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין). לאחר 24 שעות של דגירה, CM קציר בצינור חרוטי 15 מ&quot;ל ולסנן את CM באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף עוד 10 מיליליטר של מדיום ודגירה חדשים. לאסוף את כל supernatants מהתרבויות בכל יום במשך שבוע 1 ולהקפיא את המדיום שנקטפו ב -80 ° C. הימנע להקפיא להפשיר מחזורים חוזרים ונשנים. </li></ol> 4. תאי התרבות של גזע עובריים אנושית (hESCs) ואינדוקציה של תאי גזע pluripotent (iPSCs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג שורות תאי גזע עובריות אנושיות, תאי H1 וH9 (רשומים במרשם NIH hESC תחת השם WA01 וWA09, בהתאמה) ומושרה pluripotent בתאי גזע iPSC-1: iPS (עורלה) -1 וiPSC-2 (IISH1i- BM) מWiCell מכון המחקר (מדיסון, ויסקונסין, ארה&quot;ב). צריכים להיות מופשרים תאים בתרבית הבא הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוצת הביקורת, תאי תרבות במנות מצופות מטריקס הקרום במרתף במדיום תרבות בשימוש נרחב בסרום ללא-מזין חופשי ומוגדרת על 37 מעלות צלזיוס וב 5% CO 2. בתחילה, זרע 80-100 גושים של hPSCs אנימנות 35 מ&quot;מ n. לגדל תאים בכלים האלה עד תאי מעבר מפגש ואופן שיגרתי 70-80% לאחת 5-6 ימים, תוך שימוש בשיטות מכאניות או אנזימטי (Dispase) culturing-משנה. לשטוף את התאים פעמיים עם מדיום וצלחת אותם ביחס של 1: 4. החלף את המדיום עם מדיום חדש כל יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוצות ניסוי, תאי התרבות בhPCCM על מנות מראש מצופים עם 0.1% ג&#39;לטין ולבצע passaging השגרתי אחת ל5 ימים, או מכאני או אנזימים. תאי פלייט ביחסים בטווח של 1: 6-1: 10. hPSCs לצרף את הג&#39;לטין בתוך 2 ימים לאחר העברה. החלף את המדיום עם מדיום חדש מדי יום. </li></ol> 5. אפיון של תאי גזע pluripotent האדם הערה: אפיון hPSCs באמצעות מספר שיטות, כגון צביעת אלקליין phosphatase, immunocytochemistry, בזמן אמת PCR (qRT-PCR), ומערבי סופג. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לimmunofluorescencהצביעה, hPSCs תרבות הדואר ולתקן את התאים בתאי שקופית 8-היטב עם 4% (w / v) paraformaldehyde במשך 10 דקות; לאחר מכן, permeabilized את התאים עם 0.1% (V / V) טריטון-X100 במשך 15 דקות, ולחסום את התאים עבור שעה 1 עם 3% (V / V) בסרום סוס הרגיל בPBS המכילים 0.1% (V / V) Tween- 20. לשטוף PBS פעמיים במשך 5 דקות בין כל צעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם הנוגדן הראשוני (אוקטובר-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, דילול של 1: 1,000) O / N ב 4 ° C ועם הנוגדנים משני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההתקנה, דגירה תאים עם 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) במשך 5 דקות בחושך. לשטוף את תאי קפדנות שלוש פעמים לכל 5 דקות ויבשות תאים לחלוטין, בחושך. לשמר תאים בינוני הרכבה הקרינה ולבחון אותם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> qRT-PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד RNA המוחלט מהתאים באמצעות ערכת RNeasy מיני פי המפרט של היצרן ולכמת את RNA חילוץ באמצעות ננו גלילת ספקטרופוטומטר. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז cDNA על ידי הוספת 2 מיקרוגרם של RNA הכולל לאוליגו המכיל 20-μl תערובת תגובת פריימרים (DT) והכתב עילי השני הפוכים transcriptase; בצע את ההוראות של היצרן בהליך זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את cDNA מסונתז עם מערכת iQ Bio-Rad iCycler, באמצעות iQ SYBR ירוק qPCR מיקס מאסטר ורצפי פריימר המתואר במכתב לוח S1. לנרמל את ערכי סף מחזור של גנים של עניין לאלה של דהידרוגנז glyceraldehyde-3-פוספט (GAPDH). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> phosphatase אלקליין מכתים (AP) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי פעילות AP באמצעות סלולארי ES אפיון ערכה, על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 5, לשאוב התקשורת ולתקן את hPSCs עם paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS עבור 12 דקות. אל overfix; תיקון תאים ליותר מ 2 דקות יגרום איון של phosphatase אלקליין. לשאוב מקבע ולשטוף עם 1x לשטוף מאגר. אללאפשר בארות לייבוש בין צעדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף פתרון מכתים מספיק כדי לכסות את כל טוב (1 מיליליטר לכל גם צלחת 35 מ&quot;מ). דגירה צלחות בחושך ב RT במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לשטוף כלים עם 1x לשטוף מאגר. תאי כיסוי עם 1x PBS כדי למנוע התייבשות ולבחון ותמונת התאים המוכתמים באמצעות מיקרוסקופ אולימפוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבי כתם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח כתם מערבי כפי שתוארו לעיל ב9. בקצרה, לקבוע ריכוזי חלבון בlysates תא. לפתור כמויות שווה של חלבון על ג&#39;ל אלקטרופורזה סולפט polyacrylamide ג&#39;ל dodecyl נתרן (SDS-עמוד) ולהעביר את החלבונים על הממברנה פלואוריד polyvinylidene (PVDF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום את הכתם ולחקור אותו O / N עם נוגדנים עיקריים שונים ב 4 ° C; לאחר מכן דגירה הכתם עם נוגדנים משני HRP-מצומדות עבור שעה 1. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים במשך 10 דקות בכל פעם בין incubations. לזהות אותות באמצעות מגיב ECL. </li&gt; </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על טנדם קצר ניתוח (STR) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> hPSCs נקצרו מהשליטה וקבוצות ניסוי באותו הקטע. הדנ&quot;א הגנומי הופק באמצעות ערכת DNA מיקרו, על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את הדנ&quot;א הגנומי במשך 16 לוקוסים גנטיים שונים באמצעות ערכת AmpF / STR PCR הגברה, על פי המפרט של היצרן ואלקטרופורזה נימים בוצע באמצעות מנתח גנטי. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).</li><li>Amit, M. C., Shakiri, V., Margulets, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Itskovitz-Eldor+Feeder+layer+and+serum-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Itskovitz-Eldor Feeder layer and serum-free culture of human embryonic stem cells.</a> Biol Reprod. 70 (3), 837-845 (2004).</li><li>Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+pluripotent+stem+cells+using+completely+defined+conditions+on+a+recombinant+E-cadherin+substratum.">Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum.</a> BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).</li><li>Jin, S., Yao, H., Weber, J. L., Melkoumian, Z. K., Ye, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic,+xeno-free+peptide+surface+for+expansion+and+directed+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A synthetic, xeno-free peptide surface for expansion and directed differentiation of human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 7 (11), e50880 (2012).</li><li>Xu, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+FGF+and+suppression+of+BMP+signaling+sustain+undifferentiated+proliferation+of+human+ES+cells.">Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells.</a> Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).</li><li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+supports+undifferentiated+human+embryonic+stem+cell+growth+without+conditioned+medium.">Basic fibroblast growth factor supports undifferentiated human embryonic stem cell growth without conditioned medium.</a> Stem Cells. 23 (3), 315-323 (2005).</li><li>Levenstein, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+support+of+human+embryonic+stem+cell+self-renewal.">Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal.</a> Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).</li><li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+feeder+cells+can+support+the+undifferentiated+growth+of+human+and+mouse+embryonic+stem+cells+using+their+own+basic+fibroblast+growth+factors.">Human feeder cells can support the undifferentiated growth of human and mouse embryonic stem cells using their own basic fibroblast growth factors.</a> Stem Cells Dev. 20 (11), 1901-1910 (2011).</li><li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+of+human+placenta+as+a+source+of+the+universal+feeder+in+human+and+mouse+pluripotent+stem+cell+culture.">The efficacy of human placenta as a source of the universal feeder in human and mouse pluripotent stem cell culture.</a> Cell Reprogram. 12 (3), 315-328 (2010).</li><li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Undifferentiated+propagation+of+the+human+embryonic+stem+cell+lines,+H1+and+HSF6,+on+human+placenta-derived+feeder+cells+without+basic+fibroblast+growth+factor+supplementation.">Undifferentiated propagation of the human embryonic stem cell lines, H1 and HSF6, on human placenta-derived feeder cells without basic fibroblast growth factor supplementation.</a> Stem Cells Dev. 19 (11), 1713-1722 (2010).</li><li>Seok, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+placenta-derived+feeders+support+prolonged+undifferentiated+propagation+of+a+human+embryonic+stem+cell+line,+SNUhES3:+comparison+with+human+bone+marrow-derived+feeders.">Human placenta-derived feeders support prolonged undifferentiated propagation of a human embryonic stem cell line, SNUhES3: comparison with human bone marrow-derived feeders.</a> Stem Cells Dev. 16 (3), 421-428 (2007).</li><li>Levenstein, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+support+of+human+embryonic+stem+cell+self-renewal.">Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal.</a> Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).</li><li>Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+FGF+and+suppression+of+BMP+signaling+sustain+undifferentiated+proliferation+of+human+ES+cells.">Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells.</a> Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).</li><li>Mahmood, A., Harkness, L., Schrøder, H. D., Abdallah, B. M., Kassem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+differentiation+of+stem+cells+mesenchymal+progenitors+by+inhibition+of+TGF-beta/activin/nodal+using+SB-431542.">Enhanced differentiation of stem cells mesenchymal progenitors by inhibition of TGF-beta/activin/nodal using SB-431542.</a> J Bone Miner Res. 25 (6), 1216-1233 (2010).</li></ol>

המחברים מציינים אין ניגודי אינטרסים.

מודל זה פותח כדי להפיץ בהצלחה hPSCs, תוך שמירה על המאפיינים שלהם, בתנאי תרבות חופשי מזין אנושי ללא התוספת של גורמי גדילת רקומביננטי אקסוגניים כגון bFGF או אינסולין, המאפשר המניפולציה של hPSCs במייקרו-סביבה אנושית. תוספי bFGF אקסוגני הוא נפוצים והיישום של substrata כגון Matrigel או lamini...

The goal of this protocol is the propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) including human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (iPSCs) in fully humanized ex vivo feeder-free conditions without requiring additional exogenous supplementation and synthetic substrates. To date, the development of ex vivo hPSC culture models, that enable the introduction of culture products to the clinic, has been a major concern in stem cell research. Specifically, two critical problems need to be addressed. First, a humanized ex vivo culture system for the propagation of hPSCs that obviates the risk of contamination by animal cell products is needed. Second, a feeder-free culture model is needed to facilitate easy and economic mass production of hPSCs. For therapeutic applications of hPSCs, it is necessary to identify the factors that regulate their self-renewal and differentiation.
Since Xu et al. initially reported the feasibility of using conditioned media (CM) derived from mouse embryonic fibroblasts (MEF) to grow hESCs on Matrigel1, many studies have examined optimal ex vivo propagation methods for hPSCs2-4. However, an ideal humanized ex vivo feeder-free hPSC propagation system has not been developed because current methods require additional exogenous substrates including bFGF and insulin, well-known hPSC-sustaining factors, in culture media5-7. Moreover, synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures.
The rationale behind the development and use of this protocol is based on our previous studies showing that human placenta chorion cells excellently support the propagation of hPSCs without bFGF supplementation8-11. This protocol has a number of advantages including its simplicity with respect to handling and its cost-effectiveness, and it is a near-perfect humanized culture that enables hPSC propagation without exogenous synthetic substrates. The application of human placenta-derived CM (hPCCM) for hPSCs involves 3 steps. First, chorion cells are isolated from the human placenta and cultured. Second, hPCCM is produced from cultured cells. Third, hPSCs are cultured using hPCCM and their characteristics are confirmed. 
This protocol will facilitate clinical applications of hPSCs and studies of the mechanisms of hPSC proliferation and attachment. In this paper, the protocol for the successful propagation of hPSCs in hPCCM on a gelatin-coated dish is presented.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mitomycin-C</td>
			<td>Sigma-Aldrich Corporation</td>
			<td>M4287</td>
			<td>10ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma detection kit</td>
			<td>TaKaRa Bio Inc.</td>
			<td>#6601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td>#05850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS02100</td>
			<td>1mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Corporation</td>
			<td>G2500</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BM-Cyclin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>799 050</td>
			<td>10ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy mini kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano Drop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ SYBR Green qPCR Master Mix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>#170-8882AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES Cell Characterization kit</td>
			<td>Chemicon International, Inc.,</td>
			<td>SCR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power cDNA Synthesis Kit&#160;</td>
			<td>iNtRON Biotechnology</td>
			<td>25011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp&#174; DNA Micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>56304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmpF/STR&#174; Identifiler&#174; PCR Amplification kit</td>
			<td>Applied Biosystems Inc.</td>
			<td>4322288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems&#174; 3130xl Genetic Analyzer&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel culture model for human pluripotent stem cell propagation on gelatin in placenta-conditioned media

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of interest. Nevertheless, an ideal humanized ex vivo feeder-free propagation method for hPSCs has not been developed; currently, additional exogenous substrates including basic fibroblast growth factor (bFGF), a master hPSC-sustaining factor, is added to all of culture media and synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures. Recently, our group developed a simple and efficient protocol for the propagation of hPSCs using only conditioned media derived from the human placenta on a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or synthetic substrata specific to hPSCs. This protocol has not been reported previously and might enable researchers to propagate hPSCs efficiently in humanized culture conditions. Additionally, this model obviates hPSC contamination risks by animal products such as viruses or unknown proteins. Furthermore, this system facilitates easy mass production of hPSCs using the gelatin coating, which is simple to handle, dramatically decreases the overall costs of ex vivo hPSC maintenance.

אחד יתרונות של שיטת הפצת hPSC הזה הוא שהוא משתמש ברכיבים מופרשים מהתאים אנושיים. צעד ciritical ביותר בפרוטוקול הוא הבידוד והתרבות של תאי שמקורם בשליית אדם. זה דורש נתיחה ומדויקת מחלק מדויק של villi צלחת HPC. איור 1 מציג את הליך בידוד תא הנגזר שליה אנושית. תהליך זה הוא פש?...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media at JoVE.com

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

This protocol provides a simple and efficient way to propagate human pluripotent stem cells (hPSCs) using only conditioned media derived from the human placenta in a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or hPSC-specific synthetic substrata.

תרבות דגם חדשני לpluripotent אדם תאי גזע רביה בטין במדיה מזגן שליה

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

a-novel-culture-model-for-human-pluripotent-stem-cell-propagation-on

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.8K Views.  Graduate School of Medicine, Korea University. This protocol provides a simple and efficient way to propagate human pluripotent stem cells (hPSCs) using only conditioned media derived from the human placenta in a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or hPSC-specific synthetic substrata.

Video: A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Encapsulation אלגינט של תאי גזע pluripotent שימוש נחיר Co-הצירית

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

Culturing האדם pluripotent ואת עצבי תאי גזע מערכת תרבית תאים סגורות למחקר בסיסי פרה

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

מזין ללא גזירת &quot;מלנוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנוש

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

ייצור בקנה מידה גדולה של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם באמצעות פרוטוקול בידול מולקולה קטן המבוססת לשחזור ביותר

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, many protocols for differentiating hiPSCs into neurons have been developed. However, these protocols are often slow with high variability, low reproducibility, and low efficiency. In addition, the neurons obtained with these protocols are often immature and lack adequate functional activity both at the single-cell and network levels unless the neurons are cultured for several months. Partially due to these limitations, the functional properties of hiPSC-derived neuronal networks are still not well characterized. Here, we adapt a recently published protocol that describes production of human neurons from hiPSCs by forced expression of the transcription factor neurogenin-212. This protocol is rapid (yielding mature neurons within 3 weeks) and efficient, with nearly 100% conversion efficiency of transduced cells (&#62;95% of DAPI-positive cells are MAP2 positive). Furthermore, the protocol yields a homogeneous population of excitatory neurons that would allow the investigation of cell-type specific contributions to neurological disorders. We modified the original protocol by generating stably transduced hiPSC cells, giving us explicit control over the total number of neurons. These cells are then used to generate hiPSC-derived neuronal networks on micro-electrode arrays. In this way, the spontaneous electrophysiological activity of hiPSC-derived neuronal networks can be measured and characterized, while retaining interexperimental consistency in terms of cell density. The presented protocol is broadly applicable, especially for mechanistic and pharmacological studies on human neuronal networks.

We modify and implement a previously published protocol describing the rapid, reproducible, and efficient differentiation of human&#160;induced&#160;Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) into excitatory cortical neurons12. Specifically, our modification allows for control of neuronal cell density and use on micro-electrode arrays to measure electrophysiological properties at the network level.

בידול העצבי המהיר של גזע תאים המושרה pluripotent למדידת פעילות רשת על מערכי מייקרו-אלקטרודה

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

רומן חדש פאט שומן טכניקת השתלת לדמיין את כלי השיט הדור של כלי הדם בתאי גזע אנדותל

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

שימוש האדם המושרה תאים דמויי Hepatocyte נגזר תאי גזע Pluripotent לגילוי סמים

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset cardiovascular disease due to marked elevation of LDL cholesterol (LDL-C) in blood. Statins are the first line of lipid-lowering drugs for treating FH and other types of hypercholesterolemia, but new approaches are emerging, in particular PCSK9 antibodies, which are now being tested in clinical trials. To explore novel therapeutic approaches for FH, either new drugs or new formulations, we need appropriate in vivo models. However, differences in the lipid metabolic profiles compared to humans are a key problem of the available animal models of FH. To address this issue, we have generated a human liver chimeric mouse model using FH induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived hepatocytes (iHeps). We used Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG) mice to avoid immune rejection of transplanted human cells and to assess the effect of LDLR-deficient iHeps in an LDLR null background. Transplanted FH iHeps could repopulate 5-10% of the LRG mouse liver based on human albumin staining. Moreover, the engrafted iHeps responded to lipid-lowering drugs and recapitulated clinical observations of increased efficacy of PCSK9 antibodies compared to statins. Our human liver chimeric model could thus be useful for preclinical testing of new therapies to FH. Using the same protocol, similar human liver chimeric mice for other FH genetic variants, or mutations corresponding to other inherited liver diseases, may also be generated.

Here, we present a protocol to generate a human liver chimeric mouse model of familial hypercholesterolemia using human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. This is a valuable model for testing new therapies for hypercholesterolemia.

מודל אנושי העכבר Chimeric הכבד היפרכולסטרולמיה משפחתית באמצעות Hepatocytes נגזר תאי גזע Pluripotent המושרה

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.