The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.

הערה: פרוטוקול זה מתחיל אחרי אחד מבודד המיטוכונדריה משרירי שלד אדומים. המיטוכונדריה היו מבודדת כפי שתוארה לעיל מ~ 75-100 מ&quot;ג של שרירי שלד אדומים 13. בין 5 - 10 מיקרוגרם / μl של חלבון המיטוכונדריה יושג מסכום זה של רקמה על ידי resuspending גלולה הסופי המיטוכונדריה ב≤50 μl של חיץ בידוד למיטוכונדריה (IBM) 2 (ראה Frisard et al 13). 1. התקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן עבודה פתרונות מניות (טבלה 1) ותערובות של פתרון assay המיטוכונדריה (MAS) (טבלה 2) למבחנים הבאים. הערה: רוב ההכנה למבחנים ניתן לעשות מראש כפי שניתן לאחסן הפתרונות וMAS המניות ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מימה מחסנית assay respirometric בפתרון כיול 1 מיליליטר בלילה שלפני הניסוי בחממה אינו CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום של הניסוי, לאאיית את מניות קפוא (מצעים ומאפנני המיטוכונדריה, תערובת MAS, MAS w / o BSA, טבלת 1) והפשרה באמבט 37 ° C או חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כל פתרונות המצע (לוח 3) וזריקות (טבלה 4-5) ולהתאים את ה- pH כרצוי (pH 7.4). לאחר pH מותאם, לאחסן על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכנית המכונה מדידה רב גם צריכת חמצן לתמהיל נכון, לחכות, ופרמטרי מדד (ראה לוח 6) ורקע תווית ובארות קבוצה / מצב על-ידי הזנת תוכנת הניתוח, ואחריו את המצב &quot;רגיל&quot; ראשון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היכנס לפורום &quot;האורח&quot; ולחצו על &quot;Assay האשף&quot;. פעם אחת ב&quot; Assay האשף &quot;, לחץ על&quot; פרוטוקול &quot;לשינוי בתמהיל, לחכות, ולמדוד פרמטרים. תווית בארות הרקע תחת &quot;חזרה. תיקון &quot;כרטיסייה והקפד להדגיש&quot; האם תיקון שרקע &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנצח תוויתitions על ידי הלחיצה ראשונה על כרטיסיית &quot;קבוצות ותוויות&quot;, ואחריו בכרטיסייה &quot;קבוצת מידע&quot;. לאחר פרמטרים אלה נכנסו, לחצו על &quot;סיום&quot;, ואחריו &quot;שמירת תבנית&quot;. </li></ol></li></ol> 2. Assay הפעלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את פתרונות ההזרקה לתוך מחסנית טווח assay ולהתחיל את הכיול על ידי הזנת תוכנת הניתוח, ואחריו נכנס למצב &quot;רגיל&quot; ראשון. היכנס לפורום &quot;האורח&quot;. פתח את התבנית נשמרת בשלב 1.5 בכונן &quot;XF&quot;, תחת לשונית &quot;תבניות&quot;. ברגע פתוח, לחץ על &quot;התחל&quot; כדי להתחיל כיול. הערה: מחסנית טווח assay חייבת להיות נכנסה לתוך המכונה עם הפינה הקטומה לפינה השמאלית התחתון. זה לוקח בערך 30 דקות. דואג להזרים פתרונות ליציאות התקינים. זריקות בטבלה 4-5 מפורטות בצו של טעינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות, אבל לערבב ביסודיות mitochondריה מניות על ידי ערבוב הפתרון עם קצה פיפטה 200 μl, ואחריו בעדינות triturating המניה עם קצה פיפטה 200 μl שיש לו פתח שלה התרחב על ידי חיתוך ~ 3 מ&quot;מ מקצה לקצה עם מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע assay חומצת bicinchoninic (BCA) כדי לקבוע את ריכוז החלבון של המניה במיטוכונדריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במניות הריכוז נרכש מצעד 2.3, resuspend 10 מיקרוגרם של חלבון המיטוכונדריה / 200 μl של תמהיל מצע succinate / rotenone (לוח 3). Resuspend 14 מיקרוגרם של חלבון המיטוכונדריה / 200 μl של תערובות מצע שנותרו (זה חייב להיעשות עבור כל תערובת מצע) (לוח 3). מניחים את כל החלבון / מצע המיטוכונדריה מערבב על קרח. הערה: הכמות האופטימלית של חלבון המיטוכונדריה בכל טוב לכל assay נקבעה כפי שתוארה קודם לכן 9. נקבע כי פירובט / Malate, קרניטין palmitoyl / Malate, גלוטמט / Malateזרימת אלקטרונים מבחני ד מנצל 3.5 מיקרוגרם של חלבון המיטוכונדריה, בעוד assay succinate / rotenone מנצל 2.5 מיקרוגרם של חלבון המיטוכונדריה בכל טוב. לכן, החוקר צריך resuspend חלבון המיטוכונדריה מספיק ל -4 משכפל בשלב זה שכן או 2.5 מיקרוגרם או 3.5 מיקרוגרם לכל 50 μl נטען בכל טוב (ראה שלב 2.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את פתרונות המיטוכונדריה / מצע בעדינות, אך ביסודיות על ידי ערבוב הפתרון עם קצה פיפטה 200 μl, ואחריו בעדינות triturating המניה עם קצה פיפטה 200 μl כי יש לו ~ 3 מ&quot;מ של הסוף נותק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת תרבית תאים על קרח ובשלושה עותקים, גם של עומס 50 μl / כל אחד מתערובות המיטוכונדריה / המצע. המפתחים של assay respirometric microplate מבוסס ממליצים להשאיר מינימום של שתי (אין מיטוכונדריה) בארות ריקות, עדיף על שני צדדים על צלחת תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין צלחת תרבית תאים ב2,000 גרם במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בעוד הצלחת היא שלמצמיד, לחמם את פתרונות המצע באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הספין הוא מלא, לטעון בזהירות 450 μl של כל פתרון מצע על גבי בארות בהתאמה שלה (כלומר, לטעון את פירובט / מצע Malate לבארות שיש לי מיטוכונדריה תחילה resuspended בפתרון מצע זה). הקפד לטעון את הצלחת ב RT. הערה: יש לטעון בארות ריקות עם 500 μl של מצע. יש לטעון בארות ריקות המיועדות לזרימת האלקטרונים assay עם זרם אלקטרונים המצע (פירובט / Malate + FCCP), בעוד שניתן לטעון את הבארות ריקות assay בשילוב עם כל מצע assay צימוד. הערה: אם מבצעים את זרימת מבחני מצמידים ואלקטרונים באותה הצלחת, החוקר חייב להקצות מחדש בארות רקע למבחני ההתאמה אחרי ריצת assay היא מלאה באמצעות הפלטפורמה &quot;XF Reader&quot; דרך הכרטיסייה &quot;הכלי&quot;. ברגע שבתוך ההגדרה &quot;הכלי&quot;, לחץ על &quot;המינהל&quot;כרטיסייה, ואחריו &quot;תיקון רקע&quot;. פגע &quot;סיום מצב התקנת מכשיר&quot; כששלם. סיבה לכך הוא השילוב של ascorbate / TMPD יכול לצרוך O 2, ובכך תיקון רקע נפרד נחוץ לכל סוג assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר μl 450 של מצע מתווסף כל טוב, להציג את השכבה של המיטוכונדריה בבאר על מנת להבטיח את המיטוכונדריה מפוזרות באופן שווה בשכבה יחידה (הגדלה 20X [ראה 9 רוג&#39;רס, איור 4]). ולס שלא נראה שיש לי monolayer מופץ באופן שווה ניתן להסיר פוסט הוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הבדיקה לדבקות במיטוכונדריה, הכנס את microplate למכשיר assay respirometric ולהתחיל assay מנוהל על ידי לחיצה על &quot;אישור&quot;. הערה: הכיול מצעד 2.1 חייב להיות מלא לפני הריצה תתחיל. ברגע שהחוקר לוחץ על &quot;אישור&quot;, המכונה להוציא את צלחת השירות ששימשה לכיול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"> &lt;li&gt; הסר את צלחת השירות ולמקם את צלחת תרבית תאים המכילה את המיטוכונדריה על המגש. החריץ הכחול על צלחת תרבית התאים צריך להיות ממוקם בפינה השמאלית התחתונה של המגש. לחץ על &quot;המשך&quot; על מנת להתחיל את ריצת assay. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הריצה תושלם, להוציא את צלחת תרבית תאים ומחסנית על ידי לחיצה על &quot;הוצא&quot; על המסך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהצלחת הוא נפלט, להסיר ולסלק את צלחת תרבית תאים ומחסנית ולחץ על &quot;המשך&quot; על המסך. הריצה תישמר באופן אוטומטי כקובץ .xls בקובץ &quot;נתונים&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח קובץ זה ולשנות את התצוגה מ&quot; O2 &quot;ל&quot; OCR &quot;על ידי להכות את החץ כלפי מטה תחת&quot; Y1: &quot;סמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השינוי הבא &quot;נקודה התיכונה&quot; ל &quot;מחירים Point-to-Point&quot; תחת &quot;קצב נתונים מוצג כ:&quot; אפשרות. לחץ על &quot;אישור&quot; כדי להחיל את השינויים הללו. </li></ol&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכרטיסייה &quot;ובכן הקבוצה Mode&quot; בפינה השמאלית תחתונה של המסך כדי בארות קבוצה של תנאים דומים יחד. לבסוף, לחץ על כרטיסיית &quot;לדוגמא ממוצעת / תקן השגיאה&quot; לקראת אמצע המסך, בצד השמאל. לחלופין, בפקודות אלה יכולות להיות התקנה לפני assay מתחיל בהגדרה &quot;Assay האשף&quot;. הערה: כל מצב יהיה ממוצע ± סטיית תקן מוצג עבור כל שיעור וכל מצב. יש מדידות שיעור נלקחו למצב (מדינה 2 [צימוד] / State3u נשימה [אלקטרונים תזרים] ואחריו ארבע זריקות). השתמש בתוחלת שער המדינה 2 למדידה השנייה, לקבוע מדינה 4O בנקודת המינימום לאחר oligomycin הזרקה, השתמש בנקודת המקסימום למדינה 3 ו3U המדינה לאחר ADP והזרקת FCCP, בהתאמה, ולהשתמש בנקודת המינימום לAntimycin נשימה הנגרמת למבחני זיווגים. השתמש בנקודת המקסימום לפירובט / נשימה 3U מדינת Malate מושרה, להשתמש במינימוםנקודה לנשימה rotenone מושרה, להשתמש בנקודת המקסימום לנשימה 3U המדינה succinate מושרה, ולהשתמש בנקודת המינימום לAntimycin נשימה הנגרמת לassay אלקטרונים הזרימה. כל הניסויים בוצעו 3 פעמים והנתונים המוצגים התוצאות של מעקב נציג. </li></ol>

<ol>
	<li>Brand, M., Nicholls, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem J. 435, 297-312 (2011).</li><li>Wang, H., Hiatt, W. R., Barstow, T. J., Brass, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+muscle+mitochondrial+DNA+content,+mitochondrial+enzyme+activity+and+oxidative+capacity+in+man:+alterations+with+disease.">Relationships between muscle mitochondrial DNA content, mitochondrial enzyme activity and oxidative capacity in man: alterations with disease.</a> European Journal of Applied Physiology and Occupational Physiology. 80, 22-27 (1999).</li><li>Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome+in+aging+and+senescence.">The mitochondrial genome in aging and senescence.</a> Ageing Research Reviews. 18C, 1-15 (2014).</li><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+in+sickness+and+in+health.">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148, 1145-1159 (2012).</li><li>Dube, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+lipid+overload+on+skeletal+muscle+insulin+resistance,+metabolic+flexibility,+and+mitochondrial+performance.">Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance.</a> Endocrinology and Metabolism. 307, E1117-E1124 (2014).</li><li>Disease Control and Prevention Services. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+diabetes+statistics+report:+estimates+of+diabetes+and+its+burden+in+the+United+States.">National diabetes statistics report: estimates of diabetes and its burden in the United States.</a> , (2014).</li><li>Guarino, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+determining+oxygen+consumption+rates+of+static+cultures+from+microplate+measurements+of+pericellular+dissolved+oxygen+concentration.">Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86, 775-787 (2004).</li><li>Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+function+using+phosphorescent+oxygen-sensitive+probes.">Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes.</a> Nature Protocols. 1, 2563-2572 (2007).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6, e21746 (2011).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, C125-C136 (2007).</li><li>Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+biogenetically+competent+mitochondria+from+mammalian+tissues+and+cultured+cells.">Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells.</a> Methods (San Diego, Calif.). 26, 292-297 (2002).</li><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+fibroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).</li><li>Frisard, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+levels+of+lipopolysaccharide+modulate+mitochondrial+oxygen+consumption+in+skeletal+muscle.">Low levels of lipopolysaccharide modulate mitochondrial oxygen consumption in skeletal muscle.</a> Metabolism. 64, 416-427 (2015).</li><li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+chain+and+oxidative+phosphorylation.">The respiratory chain and oxidative phosphorylation.</a> Advances in Enzymology and Related Subjects of Biochemistry. 17, 65-134 (1956).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+pathways+and+respiratory+control.">Mitochondrial pathways and respiratory control.</a> , (2007).</li></ol>

ג&#39;ורג &#39;רוג&#39;רס הנו עובד של סוסון הים Bioscience שמייצר המכשיר שלגביו מבחני אלה פותחו.

השיטות שהוצגו במאמר זה מספקות הוראות צעד-אחר-צעד לביצוע אוסף של מבחני respirometric microplate מבוסס באמצעות המיטוכונדריה מבודדת 75-100 מ&quot;ג של שרירי שלד עכבר. ניתן לבצע מבחני אלה עם דיוק גבוה כפי שמעידים סטיית התקן ההדוקה בין בארות בשלושה עותקים. חשוב לציין, מבחני respirometric אלה מאפשרים איתור של חריגות שבו ו / או התאמות עשויות להיות מתרחשות בETC, מחזור TCA, מסלול β-חמצון, מובילי מצע, וכו &#39;במודל חיה נפוץ. חשוב להדגיש את הרציונל לשימוש בדלקים שונים ומעכבי שימוש בפרוטוקול זה. פירובט / Malate ומבחני respirometric Malate גלוטמט / נאפשר להערכת נשימה אני קומפלקס תיווך, כמו גם ההערכה של המובילים שלהם, ובמקרה של גלוטמט, deaminase 15. לחלופין, השילוב שלsuccinate / rotenone מאפשר ההערכה של שטף נשימה במיטוכונדריה באמצעות הקומפלקס השני של ETC מאז rotenone מעכב אני מורכב וsuccinate מספק אלקטרונים לקומפלקס השני באמצעות ההפחתה של פלבין dinucleotide אדנין (FADH 2) 15. מבחני אלה מספקים מידע ספציפי מצע כליעילות צימוד ונשימה מקסימלי. זרימת האלקטרונים assay הוא ייחודי בכך שהשילוב של מצעים ומעכבים מאפשר ההערכה של מתחמים מרובים במהלך שטף נשימה במיטוכונדריה 9. תערובת המצע הראשונית של פירובט / Malate + FCCP מאפשרת ההערכה של נשימה מקסימלי מונעת על ידי מורכב, תוך ההזרקה של rotenone אחרי succinate מאפשרת לנשימה המקסימלי הערכה מונעת על ידי הקומפלקס השני. ההזרקה של Antimycin, מעכב של קומפלקס III, ואחרי ההזרקה של ascorbate / TMPD לאפשר להערכת הנשימה מונעת על ידי IV מורכב מאז Ascorbate / TMPD הואתורם אלקטרונים לציטוכרום C / IV מורכב. אמנם אין מידע על יעילות צימוד מתקבל, השיטה אידיאלית לגודל מדגם קטן מאוד שמונעים הפעלת מצעים מרובים באופן עצמאי. לבסוף, השימוש בקרניטין / Malate palmitoyl מאפשר ההערכה של התיאום בין β-חמצון וETC מאז שווה ערך הפחתה מופק מהחמצון של חומצה פלמיטית (β-חמצון) מוזן לתוך ETC דרך אלקטרון העברת flavoprotein 15. יש לציין כי מבחני זרימת הצימוד ואלקטרונים יכולים לשמש גם במקביל לזיהוי שינויים בתפקוד המיטוכונדריה בשל כמה התערבות (טיפול תרופתי, מניפולציה גנטית). הדיוק הגבוה שהושג עבור מבחני אלה הוא בעיקר בשל ערבוב יסודי של המיטוכונדריה, אם זה לפני קביעת חלבון, או עם פתרונות המצע. לאורך שורות אלה, ברגע שהמיטוכונדריה הוא resuspendend בsolutio המצעNS, זה קריטי כדי לערבב את הפתרון הזה ביסודיות לפני טעינת צלחת תרבית התאים כפי שמתואר בשלב 2.2 עם קצה פיפטה פתח מורחב. כישלון לערבב מיטוכונדריה יסודיות יוביל לשינוי גדול בתוך assay. בנוסף, באמצעות קצה פיפטה פתח צר ייצור כוחות הגז תוך ערבוב מיטוכונדריה ומגדיל את הפוטנציאל לניזק לקרומי המיטוכונדריה ושחרורו של ציטוכרום C. צעד הדבקות (2.7) הוא גם שלב קריטי בפרוטוקול זה. אי לסובב את צלחת תרבית תאים הטעונה ארוכים / מספיק מהר יגרמו דבקות שלמה של המיטוכונדריה לטובה, ובכך מוביל השתנות מוגברת בין בארות ומדידות. הפרוטוקול המתואר כבר מותאם לכולל: טעינת כמות אופטימלית של חלבון המיטוכונדריה בכל טוב, באמצעות ריכוזים / שיטות הכנה הנכונות כדי להפוך פתרונות מניות ומצע, לשנות את טווח assay כדי להבטיח PLA המדינה המיטוכונדריהteaus, וערבוב מתאים של תערובות המניות והמיטוכונדריה / מצע של המיטוכונדריה. לפני מאמצי ייעול אלה, המחברים נתקלו מלכודות בטווח assay. הבא דן שיטות לפתרון בעיות / שינויים שהיו מסייע באופטימיזציה של פרוטוקול זה. עם כל כבוד לטעינה אופטימלית, מיטוכונדריה מעט מדי טעינה לא לעורר תגובה חזקה, בעת הטעינה מדי מיטוכונדריה יהיה למצות את החמצן בתוך microchamber ולהוביל למדידה לא מדויקת. רוג&#39;רס ואח &#39;9 מספק דוגמאות לקביעת סכומי טעינה אופטימליות של מיטוכונדריה לכל גם למבחני respirometric microplate מבוססים. לעתים קרובות יותר, יותר מדי מיטוכונדריה נטענת בכל טוב כפי שמעידה מדינה 2 שיעורים על 100-200 pmol / דקות / גם ושיעורים 3&gt; 1500 pmol / דקות / גם מדינה. אם על טעינה מתרחשת, לבצע ניסוי עם משתנה ריכוז של חלבון המיטוכונדריה (למשל, בין 1 -. 10 מיקרוגרם) כדי לעורר OCRs בתוך r ​​הדינמיAnge של המכונה מדידת צריכת חמצן. הכנה ושימוש בריכוזים הנכונים של מצעים ומניות היא בעל חשיבות עליונה. תמיד השתמש בטופס החומצה של מצעים / זריקות ולהתאים את ה- pH עם אשלגן הידרוקסיד או HCl; מאגרי נתרן / פתרונות אינם מומלצים. בנוסף, מצעי resuspending / המניות בDMSO או אתנול 100% יגרמו לכישלון מדידה או שגיאה. הקפד להשתמש אתנול 95% שבו ציין. זה נפוץ קרניטין palmitoyl כדי לזרז מתוך אתנול 95% לאחר הפשרת המניות הקפואות, ובכך גורם שונות גדולות. הקפד לחמם את מניית קרניטין palmitoyl ומערבולת היטב לפני השימוש. בנוסף, פירובט / תוצאת assay Malate משתנה מאוד יכולה להיות בגלל יצור מניית פירובט&gt; 2 שבועות. הקפד מחדש aliquots הקפוא של פירובט כל 2 שבועות. ריצת assay שונה כדי מדידות 2-דקות כדי להבטיח מישורי המדינה המיטוכונדריה. אם תצפית של תשישות של ADP היא רצויה, רשאי החוקרלהאריך את זמן המדידה תחת לשונית &quot;פרוטוקול&quot; תחת הפורום &quot;Assay האשף&quot;. לבסוף, השתנות גדולה מתרחשת כאשר פתרונות מניית המיטוכונדריה ומיטוכונדריה בתוספת המצע אינם הומוגני לפני מלא לטעינה. אם שונות בין הבארות היא גבוהות אחרי ריצת assay, הקפד לערבב באופן מלא את פתרון המצע לפני הניסוי הבא. לא מערבולת פתרונות מיטוכונדריה / מצע, ולא לעורר, מחית, ובעדינות triturate עם פיפטה קצה פתח מורחב. ישנן מספר מגבלות של טכניקה זו, כי הם ראויים לציון. ראשית, מספר הבארות בצלחת תרבית תאים המשמשת למבחנים אלה הוא נמוך יחסית (כלומר., 24 בארות ולפחות 2 מיועדים לבארות ריקות). אם זה רצוי לבצע את כל 5 של מבחני אלה על צלחת אחת, החוקר הוא רק מסוגל לבחון את התגובות מעכבר אחד בכל פעם. עם זאת, יש לציין כי 96 מכשירים וזמינים לhigheתפוקת r. שנית, יש את נקודות החוזק וחולשות הגלומות בהערכת תפקוד המיטוכונדריה במיטוכונדריה מבודדת בהשוואה בתאים שלמים 1. חולשות מסוימות כוללות שיש רלוונטי פחות פיסיולוגי לעומת תאים שלמים וחפצי התרמה מתהליך הבידוד. לבסוף, ההצלחה של שיטה זו היא תלויה באיכות של תהליך בידוד המיטוכונדריה. למרות שחלק ממבחנים אלה פותחו גם במערכות שונות או אומתו במודלים של בעלי חיים אחרים, השיטות שהוצגו במסמך זה הן ראשון לסנתז את כל מבחני האמורים לשימוש האופטימלי בעכבר באמצעות מכונה מדידת צריכת חמצן רב גם שרירי שלד. חשוב לציין, כל 5 של מבחני אלה יכולים להתבצע עם כמות המיטוכונדריה מבודדת מ~ 75-100 מ&quot;ג של שרירי שלד עכבר, ובכך לספק תפוקה גבוהה עם חומר מינימאלי. משמעות רבה, היכולת של רב גםטכנולוגיות צריכת חמצן כדי לבצע מבחני עם כמויות מינימליות של מיטוכונדריה, בשילוב עם שיטת בידוד מותאמת, מאפשר לחוקר לבצע מספר רב של ניסויים אחרים עם שארית רקמת שריר שלד (למשל., כתמים מערביים, RT-PCR, מבחני האנזימטית, וכו &#39;), אשר לעתים קרובות מאבק עם מודל חיה זו. לסיכום, השיטות שהוצגו במסמך זה מספקות הוראות צעד-אחר-צעד לביצוע אוסף של מבחני respirometric microplate מבוסס באמצעות כמויות מינימליות של שריר שלד עכבר. חשוב לציין, השיטות שהוצגו דורשות כמויות מינימליות של רקמות ומיטוכונדריה. ברגע שמשתלט עליו, הטכניקות המתוארות במסמך זה תאפשר לחוקרים לקבוע מנגנון פוטנציאלי של מוצר או מתחם גן על צריכת חמצן במיטוכונדריה במודל חיה נפוץ.

התפקיד הפיזיולוגי העיקרי של המיטוכונדריה שרירי שלד הוא לייצר ATP מזרחון חמצוני 1. חשוב לציין, מיטוכונדריה שריר השלד לשחק תפקיד ספציפי בתרגיל קיבולת 2, 3 הזדקנות, מחלה ניוונית 4 וסוכרת סוג II 5. כחברה מזדקנת, ולהיות הגורם המוביל -7 של מוות בארצות הברית 6 סוכרת סוג II, את הצורך בשיטות שלהעריך את התפקוד המיטוכונדריה הפך יותר ויותר נפוץ יותר במחקר ביו 7,8. באופן ספציפי, המדידה של צריכת חמצן יש שירות יוצא דופן בהערכה של תפקוד המיטוכונדריה שכן הוא מייצג את הפונקציה מתואמת בין הגנום המיטוכונדריאלי והגרעיני להביע רכיבים פונקציונליים של חמצוני זירחון 9. מספר טכנולוגיות הקיימות לאפשר המדידה של צריכת חמצן בתאים שלמים ולבודדמיטוכונדריה ד 7-10. בנוסף, מבחני פותחו עבור סוגי תאים רבים ורקמות, ובמגוון רחב של מינים המאפשרים המדידה של מסלולי המיטוכונדריה ושליטה בדרכי הנשימה 9,11,12. עם זאת, אין כיום חלל בספרות בנוגע לאוסף של כל מבחני אלה באמצעות המיטוכונדריה מבודדת משרירי שלד עכבר לשימוש בטכנולוגיות צריכת חמצן microplate מבוססים. חשוב לציין, שימוש במבחני respirometric microplate מבוסס גדל בקרב הביולוגים המיטוכונדריה ומאפשר למדידות תפוקה גבוהות באמצעות כמויות מזעריות של מיטוכונדריה המבודדת 9. לכן, אוסף של מבחני respirometric microplate מבוסס פותחו המאפשר איתור של חריגות שבו ו / או התאמות עשויות להיות מתרחשות בשרשרת הובלת אלקטרונים (וכו &#39;). בנוסף, שני מבחני respirometric מבוססים microplate נוסף פותחו המאפשרות ההערכה של התיאום between חומצת מחזור tricarboxylic (TCA) והכד &#39;, ובין SS-חמצון ווכו&#39; חשוב לציין, השיטות שהוצגו מספקות דרך ברורה ותמציתית כדי למדוד שינויי מכניסטית במיטוכונדריה במודל חיה נפוץ.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63559</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic, minimum 99.0%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate, ACS reagent, 99.0-102.0%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essentially Fatty&#160;</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">A6003</td>
			<td rowspan="2">Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Free- BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>107360</td>
			<td>Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9512</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(-) Malic Acid, BioXtra, &#8805;95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6413</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">L-Glutamic acid</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">G1251</td>
			<td rowspan="2">Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-p-phenylenediamine</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">T7394</td>
			<td rowspan="2">Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99%, powder [TMPD]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl L-carnitine chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A, &#8805; 95% (HPLC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)</td>
			<td rowspan="3">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="3">C2920</td>
			<td rowspan="3">Store at 2-8&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylhydrazone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8805;98% (TLC), powder [FCCP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP]</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">A5285</td>
			<td rowspan="2">Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.

Watch this Scientific Journal Video about Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements at JoVE.com

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

באמצעות מבודד המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות נשימה microplate תפוקה הגבוה

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

using-isolated-mitochondria-from-minimal-quantities-mouse-skeletal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.6K Views.  Virginia Tech. The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

Video: Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

אינדוקציה של התחדשות שריר שלד החריף ידי Cardiotoxin הזרקה

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

הכנה והתרבות של תאים מבשר myogenic / ראשי myoblasts מן שרירי השלד של מבוגר ובני אדם בני

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

בידוד של סוג אני ו II סוג pericytes של עכבר שרירי השלד

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To investigate the underlying mechanisms that bring about various muscle adaptations, a number of exercise protocols such as treadmill, wheel running, and swimming exercise have been used in the animal studies. However, these exercise models require a long period of time to achieve muscle adaptations, which may be also regulated by humoral or neurological factors, thus limiting their applications in studying the muscle-specific contraction-induced adaptations. Indirect low frequency stimulation (10 Hz) to induce chronic contractile activity (CCA) has been used as an alternative model for exercise training, as it can successfully lead to muscle mitochondrial adaptations within 7 days, independent of systemic factors. This paper details the surgical techniques required to apply the treatment of CCA to the skeletal muscle of rats, for widespread application in future studies.

This protocol describes the use of the chronic contractile activity model of exercise to observe stimulation-induced skeletal muscle adaptations in the rat hindlimb.

יישום של גירוי כרוני ללמוד עיבודים פנוטיפי של שרירי השלד כויץ הנוצרות על-ידי פעילות עכברוש

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

זיהוי של שרירי השלד תאים הלוויין על-ידי Immunofluorescence עם Pax7 ו- Laminin נוגדנים

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal muscle. Mouse skeletal muscle has been shown to produce high quality X-ray diffraction patterns on third generation synchrotron beamlines providing an opportunity to link changes at the level of the genotype to functional phenotypes in health and disease by determining the structural consequences of genetic changes. We present detailed protocols for preparation of specimens, collecting the X-ray patterns and extracting relevant structural parameters from the X-ray patterns that may help guide experimenters wishing to perform such experiments for themselves.

We present detailed protocols for performing small-angle X-ray diffraction experiments using intact mouse skeletal muscles. With the wide availability of transgenic mouse models for human diseases, this experimental platform can form a useful test bed for elucidating the structural basis of genetic muscle diseases

צילום רנטגן של שריר השלד Murine שלמים ככלי לחקר בסיס מבניים של מחלת שרירים

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle regenerative process. There are recognized challenges to working with human primary adult stem cells, particularly human muscle progenitor cells (hMPCs) derived from skeletal muscle biopsies, including low cell yield from collected tissue and a large degree of donor heterogeneity of growth and death parameters among cultures. While incorporating heterogeneity into experimental design requires a larger sample size to detect significant effects, it also allows us to identify mechanisms that underlie variability in hMPC&#160;expansion capacity, and thus allows us to better understand heterogeneity in skeletal muscle regeneration. Novel mechanisms that distinguish the expansion capacity of cultures have the potential to lead to the development of therapies to improve skeletal muscle regeneration.

We present techniques for isolating, culturing, characterizing, and differentiating human primary muscle progenitor cells (hMPCs) obtained from skeletal muscle biopsy tissue. hMPCs obtained and characterized through these methods can be used to subsequently address research questions related to human myogenesis and skeletal muscle regeneration.

בידוד, תרבות, אפיון, והבידול של תאים האדם שריר ביופסיה של השלד שרירי השגרה נוהל

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

ביצוע שריר השלד האנושי Xenografts בעכברים חיסוני

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...