ברצוננו להודות טרנט וו לקבלת הסיוע הטכני שלו. אנחנו גם מכירים מחלקת הילדים בבית החולים לילדים וקיור מולדים ניוון שרירים (CMD) למימון הנדיב שלהם לפרויקט זה.

1. הכנת צלחות אגר הזרקה (זמן: 45 דקות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים agarose 2% עד 3% בתקשורת E3 ולאפשר פתרון להתקרר מעט על ספסל. הערה: מספר צלחות הזרקת הכנה מכתיב את כמות agarose הנדרשת. כל צלחת הזרקה צריכה כ 35 מיליליטר של פתרון agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרתיחה, לאפשר agarose להתקרר עד לטמפרטורה רצויה (למשל., C ° 45) כמו לכל הוראות יצרן עובש הזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים כ 35 מיליליטר של מקורר agarose לתוך צלחת 100 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בקצה אחד של עובש הזרקה מועדפת לפתרון, אז שכב שארית העובש על פתרון agarose (זה יעזור להפחית את ההתרחשות של בועות אוויר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר פתרון agarose כדי לחזק או ב RT או 4 מעלות צלזיוס למשך כ 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במרית כדי להפריד קצה אחד של העובש מagarose המוצק. לאט לאט להסיר את שארית מ &#39;<html> יָשָׁן. </li></ol> 2. הכנת אוונס הכחול צבע (EBD) הזרקת מיקס (זמן: 30 דקות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך מניית 1% מEBD בפתרון של 1X רינגר (155 מ&quot;מ NaCl; 5 מ&quot;מ KCl; 2 מ&quot;מ CaCl 2; 1 מ&quot;מ MgCl 2; 2 מ&quot;מ Na 2 4 HPO; 10 מ&quot;מ HEPES; 10 גלוקוז מ&quot;מ; pH 7.2), אשר יכול להיות מאוחסן בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון מניות של isothiocyanate והעמסת (FITC) -dextran MW 10,000 kDa ב 25 מ&quot;ג / מ&quot;ל בפתרון של 1X רינגר ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת הזרקה על ידי דילול EBD 0.1% ישירות במניות פתרון של מניית FITC-dextran (כלומר, לעבודת נפח סופי של 100 μl:. מערבבים 10 μl של EBD 1% ב -90 μl של מניית dextran FITC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות לערבב זריקת מערבולת (זה צריך להפוך ירוק) ולשמור את האור הישיר על ידי עטיפת צינור תערובת הזרקה ברדיד אלומיניום. </li></ol> 3. הזרקת EBD הכנה (זמן: כ -30 דקות) אף אוזן גרון &quot;&gt; הערה: הפרוטוקול עובד הכי טוב עם זחלים מן 3-7 ימים לאחר הפריה (DPF). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת הזרקה טרום חמה לRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מנגנון הזרקה על ידי סידור micromanipulator על לוחית מתכת ולעמוד ליד מיקרוסקופ משמש להזרקה. הפעל בקר microinjection אוויר מונע. הערה: מערכת ההזרקה העדיפה תשתנה על ידי מעבדה ולא צריך לשנות תוצאה של ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזרה למלא מחט זריקה עם כ 2-4 μl של תערובת EBD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכייל נפח הזרקה לכ 5 NL של תערובת EBD. הערה: כיול נפח הזרקה יהיה תלוי בשיטת כיול. הזרקת בוכנה מונעת ניתן להגדיר ישירות לניתן זריקת נפח ואילו מזרקי לחץ הגז יצטרכו ההזרקה מכוילת באמצעות בולוס נפח עם השימוש של מיקרומטר הנפח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת הזרקה רטובה עם הפתרון של 1X רינגר ולהסיר עודפים מבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זחלים טרום לטפל עם סאל methanesulfonate אתיל 0.04% 3-aminobenzoatet (tricaine) בדילול מלא בפתרון של 1X רינגר כדי לשתק זחלים לפני תחילת ההזרקה. הערה: הבטחת הזחלים immotile לחלוטין חשובה כמו הזרקה נכונה היא קשה עם כל תנועה שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח זחלים מורדמים לבארות של צלחות ההזרקה אגר באמצעות פיפטה זכוכית. ודא שהזחלים נמצאים בלגמרי טוב ושוכב על הצד שלהם. הערה: מספר הזחלים לכל גם הוא עד לנסיין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזחלים לשים בבארות, להסיר הפתרון של רינגר העודף כדי למזער את תנועת זחלים בתוך הבאר. השאר סכום שייר של פתרון כל כך זחלים שלא ליבש. </li></ol> 4. הזרקת קרום הלב של דג הזברה זחלים עם EBD (זמן: תלוי במספר הזרקת זחלים, מוערכת 1-3 שעות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת ההזרקה המכילה את הזחלים בהיקף לנתח בי הזריקות תבוצענה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את מחט פיפטה ההזרקה המכילהEBD לערבב על זחלי דג הזברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש את עמדת צלחת ההזרקה ידי סיבוב זה כל כך את מחט הזריקה היא ליד הלב של הזחלים וכ 45 ° ventrally מהציר הקדמי-אחורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את מחט הזריקה לתוך וריד הקרדינל הנפוץ (CCV) באזור של הווריד בחלק הקדמי של החלמון בי הווריד תחילה פונה לכיוון הגב (איור 1). הערה: הגדלה של עד 40x עשויה להיות שימושית כדי לראות את CCV ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 5 NL של תערובת EBD ולשמור מחט זריקה בעמדה במשך 5-8 שניות למזעור זליגה מיידית של תערובת EBD. הערה: הזרקה טובה תהיה צבע לצבוע ראה בחדרי הלב (איור 1). אם תערובת EBD לא נצפתה בלב, אז הזרקת 5 NL נוסף של תערובת EBD עשוי להיות מספיק כדי לגרום ספיגת צבע. לחלופין, יכול להיות מושלך העובר. הערה: במצבים מסוימים, הלב עלול להפסיק לפעום. אם o זהccurs, תמשיך לעקוב אחר הזחלים ל20-40 שניות. בדרך כלל, הלב פועם קורות חיים כצבע עובר דרך מערכת הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור על הזחלים וחזור הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות עוברים הוחדרו בהצלחה על ידי התבוננות נוכחות FITC-הפולימרים בכלי הדם מייד לאחר ההזרקה (איור 2). </li></ol> 5. דגירה וEBD ספיגה (זמן: 4-6 שעות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המספר הרצוי של זחלים מוזרקים, תמורה הזריקו זחלים לפתרון של 1X רינגר ללא tricaine ב100 מנות מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור מנות עטופות ברדיד אלומיניום. הערה: שמירה על זחלים מוזרקים בחושך מגדילה באופן משמעותי את שיעורי הישרדות ומבטיחה את העקביות הגדולה ביותר בעוצמת אות. עטיפה בנייר אלומיניום חשובה במיוחד עבור פרק זמן שהזחלים הם מחוץ לחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר זחלים כדי לדגור על 28.5 מעלות צלזיוס במשך 4-6 שעות על מנת להבטיח ספיגת EBD מספיק. </li></ol&gt; 6. ויזואליזציה של EBD בשריר (הזמן: תלוי במספר הזרקת זחלים והסוג של מיקרוסקופ, שעה 0.5-3 משוערת) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההדמיה, להרדים את הזחלים עם tricaine 0.04% כדי למנוע תנועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה בזחלים תחת הקרינה אדומה כדי לקבוע אם ספיגת EBD מתרחשת בשרירי השלד (איור 3). </li></ol>

<ol>
	<li>Verma, S., Anziska, Y., Cracco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+Duchenne+muscular+dystrophy+(DMD)+for+the+pediatricians+in+the+community.">Review of Duchenne muscular dystrophy (DMD) for the pediatricians in the community.</a> Clin Pediatr (Phila. 49, 1011-1017 (2010).</li><li>Gibbs, E. M., Horstick, E. J., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swimming+into+prominence:+the+zebrafish+as+a+valuable+tool+for+studying+human+myopathies+and+muscular+dystrophies).">Swimming into prominence: the zebrafish as a valuable tool for studying human myopathies and muscular dystrophies).</a> FEBS J. 280, 4187-4197 (2013).</li><li>Lancet, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , 381-845 (2013).</li><li>Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dystrophin+glycoprotein+complex:+signaling+strength+and+integrity+for+the+sarcolemma.">The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma.</a> Circ Res. 94, 1023-1031 (2004).</li><li>Campbell, K. P., Kahl, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+dystrophin+and+an+integral+membrane+glycoprotein.">Association of dystrophin and an integral membrane glycoprotein.</a> Nature. 338, 259-262 (1989).</li><li>Cohn, R. D., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+muscular+dystrophies.">Molecular basis of muscular dystrophies.</a> Muscle Nerve. 23, 1456-1471 (2000).</li><li>Yoshida, M., Ozawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoprotein+complex+anchoring+dystrophin+to+sarcolemma.">Glycoprotein complex anchoring dystrophin to sarcolemma.</a> J Biochem. 108, 748-752 (1990).</li><li>Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+muscular+dystrophy+show+different+patterns+of+sarcolemmal+disruption.">Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption.</a> J Cell Biol. 139, 375-385 (1997).</li><li>Matsuda, R., Nishikawa, A., Tanaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+dystrophic+muscle+fibers+in+mdx+mouse+by+vital+staining+with+Evans+blue:+evidence+of+apoptosis+in+dystrophin-deficient+muscle.">Visualization of dystrophic muscle fibers in mdx mouse by vital staining with Evans blue: evidence of apoptosis in dystrophin-deficient muscle.</a> J Biochem. 118, 959-964 (1995).</li><li>Bassett, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+zebrafish+model+of+muscular+dystrophy.">Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. 31, 537-540 (2004).</li><li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+dag1+mutant:+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies.">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum Mol Genet. 20, 1712-1725 (2011).</li><li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5331-5336 (2011).</li><li>Guyon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+muscle+disease+in+zebrafish.">Modeling human muscle disease in zebrafish.</a> Biochim Biophys Acta. 1772, 205-215 (2007).</li><li>Cavanna, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+genetic+mapping+of+the+mouse+mdx+locus.">Molecular and genetic mapping of the mouse mdx locus.</a> Genomics. 3, 337-341 (1988).</li><li>Bassett, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+is+required+for+the+formation+of+stable+muscle+attachments+in+the+zebrafish+embryo.">Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo.</a> Development. 130, 5851-5860 (2003).</li><li>Horstick, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stac3+is+a+component+of+the+excitation-contraction+coupling+machinery+and+mutated+in+Native+American+myopathy.">Stac3 is a component of the excitation-contraction coupling machinery and mutated in Native American myopathy.</a> Nat Commun. 4, (1952).</li><li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+deletion+of+lysine+7+expands+the+clinical,+histopathological+and+genetic+spectrum+of+TPM2-related+myopathies.">Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies.</a> Brain. 136, 508-521 (2013).</li><li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neb:+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation.">Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).</li><li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+successful+antioxidant+treatment+in+models+of+RYR1-related+myopathy.">Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy.</a> Brain. 135, 1115-1127 (2012).</li><li>Detrich, H. W., Westerfield 3rd, ., M, L. I., Zon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).</li><li>Whitfield, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+development+of+the+zebrafish+inner+ear+and+lateral.">Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral.</a> , 123-241 (1996).</li><li>Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+for+human+FKRP+muscular+dystrophies.">Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies.</a> Hum Mol Genet. 19, 623-633 (2010).</li><li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment.">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nat Commun. 4, (2013).</li><li>Waugh, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoxetine+prevents+dystrophic+changes+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Fluoxetine prevents dystrophic changes in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Hum Mol Genet. 23 (17), 4651-4662 .</li><li>Horstick, E. J., Gibbs, E. M., Li, X., Davidson, A. E., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+embryonic+and+larval+zebrafish+skeletal+myofibers+from+dissociated+preparations.">Analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations.</a> J Vis Exp. 50259, (2013).</li><li>Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+skeletal+muscle+defects+in+larval+zebrafish+by+birefringence+and+touch-evoke+escape+response+assays.">Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays.</a> J Vis Exp. 50925, (2013).</li><li>Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evans+Blue+Dye+as+an+in+vivo.+marker+of+myofibre+damage:+optimising+parameters+for+detecting+initial+myofibre+membrane+permeability.">Evans Blue Dye as an in vivo. marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability.</a> J Anat. 200, 69-79 (2002).</li><li>Guyon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+isolation+and+characterization+of+a+splicing+mutant+of+zebrafish+dystrophin.">Genetic isolation and characterization of a splicing mutant of zebrafish dystrophin.</a> Hum Mol Genet. 18, 202-211 (2009).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+Modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).</li><li>Majczenko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+Mutation+of+CCDC78+in+a+Unique+Congenital+Myopathy+with+Prominent+Internal+Nuclei+and+Atypical+Cores.">Dominant Mutation of CCDC78 in a Unique Congenital Myopathy with Prominent Internal Nuclei and Atypical Cores.</a> Am J Hum. , (2012).</li><li>Wooddell, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Evans+blue+dye+to+compare+limb+muscles+in+exercised+young+and+old+mdx+mice.">Use of Evans blue dye to compare limb muscles in exercised young and old mdx mice.</a> Muscle Nerve. 41, 487-499 (2010).</li><li>Hall, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+alpha2-deficient+congenital+muscular+dystrophy.">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7092-7097 (2007).</li></ol>

יש הסופרים לא אינטרסים כלכליים מתחרים או סכסוכים אחרים של עניין.

דג הזברה הם מתעוררים ככלי רב עוצמה לחקר מחלה עצבית-שרירית 2,29. עד כה, מערכת דג הזברה נעשתה שימוש כדי לאמת את המוטציות הגורמות למחל שריר חדש 16,17,30, להבהיר pathomechanisms רומן 18, ולזהות תרופות טיפוליות פוטנציאלי חדשות 12,24. מאמצים הקולקטיביים אלה הקימו את השירות של דג הזברה מודל מחלות עצבית-שרירית אנושיות. עם זאת, למרות ההתקדמות שנעשתה עם מודלים דג הזברה ויונקים, יש אפשרויות טיפול מוגבלות לחולים בתוך הספקטרום הרחב של מצבים עצבית-שרירית. לכן, דרישה גבוהה קיימת לפיתוח טיפול לקבוצה זו של מחלות הרסניות. במקביל לדרישה זו לתרופות הוא הצורך המקביל לחדשנות מתמשכת ניסיונית, כמו גם ניתוח קפדני כדי לוודא מודלים של בעלי חיים חדשים ואסטרטגיות טיפוליות המשוערות. ניתוח EBD משמש בדרך כלל במודלים של עכברים לרקמת מחקר ונזק לתאים במוח, לב, ו27,31 שרירי שלד. בעיקר, EBD נעשה שימוש נרחב במודלים של עכברים של תת ניוון שרירים שונים כדי להראות את החומרה של חוסר יציבות קרום שריר וניזק 8. השימוש בEBD לחשוף נזק קרום שריר הוא פרמטר תומך הקמת דמיון של מודל החיה למצב המחלה האנושי 9. כוחו של EBD בעכבר הוביל כמה מעבדות, כוללים שלנו, לפתח וליישם EBD לדגמי דג הזברה של מחלה עצבית-שרירית. בשל תחולתו של ניתוח EBD, טכניקה זו מיושמת באופן פעיל כדי לאשש דגמי דג הזברה למצב המחלה האנושי 11,15,22,24,32. זחלים עם ממברנות שריר פגועות יהיו ספיגת EBD וקרינה לכן אדומה בתוך סיבי שריר. הקרינה שנצפתה בחלל הבין-סיבים, אך לא בתוך סיבי שריר בודדים יכולה להיות גם להיות אינפורמטיבי של סיבי ניתוק מהקרום במרתף בtהוא היעדר נזק קרום, מתן פירוט אבחון שימושי. יש ניתוח EBD יישום פוטנציאל מעבר אימות מודל חיה. מאמצים מהמעבדה שלנו הוכיחו לאחרונה כי ניתוח EBD מועיל באימות תרופות טיפוליות פוטנציאלי רומן 24. קביעה אם טיפולים טיפוליים פוטנציאל להפחית או לבטל ספיגת EBD במודלי מחלה עצבית-שרירית יכולים לסמן פעולה טיפולית רלוונטית 8. סוג זה של ניתוח יכול לעזור להקים את המנגנון (ים) של תרופות ומרחיב את היישום של ניתוח EBD. כמו בטכניקות רבות, ניתוח EBD יש לי כמה אזהרות שנצפו במהלך עיצוב ובפועל ניסיוניים. לדוגמא, זה יכול להיות מאתגר לזהות CCV בשל העיבוי של הרקמות עם גיל. בנוסף, קל לפגוע זחלים בהכנה לפני ובמהלך הזרקת קרום הלב, הפחתת ספירה ניסיונית והגדלת הצורך מכין מספר גדול של זחלים.יתר על כן, נזק פיזי שנגרם לזחלים במהלך טיפול והזרקה עלול לגרום לתוצאות חיוביות שגויות כמו שריר שנפגע יכול לקחת עד EBD. על מנת להתגבר על חלק מהמכשולים הללו, שתארנו את אסטרטגית שיתוף הזרקה במאמר זה וידאו, המאפשר זיהוי קל ואמין של זחלים עם עירוי צבע מוצלח מייד לאחר הזרקה ולפני ניתוח שלאחר מכן. FITC-dextran בקרות שיתוף הזרקה להזרקה מוצלחת על ידי מתן אישור של EBD בכלי הדם לפני ספיגתו על ידי סיבי השריר. זה יכול להיות שימושי במיוחד כקרינת EBD הופכת מפוזרת מאוד בזחלים לאחר כמה שעות אם לא נאסף בסיבי השריר; ככזה, הוא יכול להיות קשה לזהות. בנוסף, חסר CCV והזרקת EBD לתוך חלל החלמון או גוף יכול, לאחר דגירה, לגרום לקרינה אדומה מפוזרת דומה לשלוט עוברים, עדיין עם הסיכוי המופחת של ספיגה על ידי סיבי שריר פגועים. באופן קולקטיבי, מערה אלהATS מציע הזרקת EBD דורשת סבלנות ותרגול כדי להשיג תוצאות עקביות ואמינות. בסך הכל, אנו מתארים שיטה מעשית ופשוטה לביצוע ניתוח EBD על זחלי דג הזברה. נכון להיום, השימוש בדג הזברה כמערכת מודל, במיוחד כמודל מחלה אנושי, כבר מתרחב במהירות. הרחבה זו היא באופן חלקי בשל הפיתוח והשינוי המתמשכים של שיטות ניסיוניות שלשפר את היתרונות הנוכחיים של מערכת דג הזברה. טכניקת הזרקת EBD מספקת כלי נוסף ורב עוצמה לארסנל של חוקר לאימות והמחקר של מודלים מחלת שריר דג הזברה. יש יישום והשינוי המתמשך של טכניקה זו יש הפוטנציאל לסייע לחשוף אסטרטגיות טיפוליות חדשניות, כמו גם מנגנוני מחלה גורמת.

Muscular dystrophies constitute a group of prevalent and heterogeneous human muscle diseases with specific histopathological features1,2. Symptoms typically associated with this devastating group of diseases include muscle weakness, muscle degeneration, loss of motility, and early mortality1,3. The primary pathomechanisms of muscular dystrophies are the loss of proteins that stabilize the sarcolemma, anchor transmembrane complexes, and mediate cell signaling across the membrane4-6. For example, complete loss of the protein dystrophin, a primary scaffold protein of the dystrophin-glycoprotein complex, results in destabilization of the muscle membrane in Duchenne muscular dystrophy7. Due to the fact that most muscular dystrophies result from mutations in proteins that participate in the link between the extracellular matrix and the sarcolemmal cytoskeleton, a common observation at the cellular level is the loss of sacrolemmal integrity8,9. This understanding of the primary pathomechanism(s) associated with muscular dystrophies is the product of numerous years of research employing animal model systems2,10-15. However, despite advances in the field, there are still limited therapeutic options for treatment or management of the range of dystrophy subtypes. This limitation of viable therapies is due to several key factors: 1) the difficulty of gene therapy strategies, 2) a high frequency of de-novo disease cases and the corresponding lack of translatable animal models, and 3) the lack of rigorous strategies to test the physiological consequences of putative therapeutic agents with clear and reproducible outcome measures.
To overcome some of these limitations, numerous labs including our own are employing zebrafish as a system to model and study human neuromuscular diseases2. To date, zebrafish have proven a valuable tool in disease research. The zebrafish model has been used to identify and validate novel human disease causing mutations16,17, elucidate uncharacterized disease causing mechanisms17,18, and identify novel therapeutic strategies12,19. These advances were made, in part, by the canonical strengths of the zebrafish system such as their optical clarity, ease of genetic manipulation, and ability to breed in large numbers20. Zebrafish have additionally proven amendable to large-scale drug screens21, a valuable method for the identification of novel therapeutics22-24. Regarding muscle disease research, these strengths are complemented by the ability to isolate single zebrafish skeletal muscle fibers via dissociation25 and by the ability to examine myofiber organization in vivo using the optical phenomenon called birefringence26, which collectively allows for rapid determination of macroscopic muscle integrity. Regardless of these available utilities, further tool development is continuously required to advance investigation.
We, and others, have adapted a protocol for EBD injection and analysis in the zebrafish model. EBD is a vital, cell permeable dye that is taken up by damaged, degenerating, or apoptotic cells and then visualized under fluorescence27. To date, EBD analysis has extensively been used to analyze muscle membrane integrity in mouse models of skeletal muscle and heart diseases8,9,27. However, in mammalian preparations, harvested muscle typically requires laborious sectioning or dissection prior to analysis. In zebrafish, direct analysis is possible in high numbers using live and intact animals. In this video article, we will demonstrate the methodology to perform EBD injection and analysis in live zebrafish larvae, with representative images of EBD uptake in the zebrafish dystrophy mutant line sapje15,28. Furthermore, we present a co-injection strategy that allows for increased quantification of EBD preparations.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="801">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Fluorescein isothiocyanate-dextran MW 10,000</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">FD10S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Evan&#39;s Blue Dye</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">100 mm Petri dish</td>
			<td style="width:173px;">Fischerbrand</td>
			<td style="width:140px;">FB0875712</td>
			<td>Injection mold base</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:321px;">Thin wall glass capillaries</td>
			<td style="width:173px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:140px;">TW100F-4</td>
			<td>For Injection needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Agarose</td>
			<td style="width:173px;">Bioshop</td>
			<td style="width:140px;">AGA001</td>
			<td>Injection mold</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Microinjection mold</td>
			<td style="width:173px;">Adaptive Science Tools</td>
			<td style="width:140px;">TU-1</td>
			<td>Injection mold</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:173px;">Bioshop</td>
			<td style="width:140px;">SOD001</td>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:173px;">Bioshop</td>
			<td style="width:140px;">POC888</td>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Magnessium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">M2670</td>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">S9638</td>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">HEPES</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">H4034</td>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Glucose</td>
			<td style="width:173px;">BioBasic</td>
			<td style="width:140px;">GB0219</td>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">C1061</td>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of zebrafish larvae skeletal muscle integrity with evans blue dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

תמהיל הזרקת EBD הוזרק לCCV של מוטציות הומוזיגוטים sapje ואחים בר-סוג 3 DPF. זריקות שמלאו את חדרי לב (איור 1) ולאחר מכן נותחו לזריקה מוצלחת על ידי לדמיין FITC-פולימרים בכלי הדם תחת הקרינה ירוקה (איור 2). לאחר תקופת דגירה 4 שעות, ספיגת EBD נבדקה ברמת somite באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אחים סוג בר הציגו שום הקרינה EBD בתוך כל סיבי שריר גלויים (איור 3 א), ואילו מוטציות הומוזיגוטים sapje הראו ספיגת EBD, המצביע על נזק לשריר הקרום 15 (איור 3). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig1.jpg" /> איור 1. לערבב הזרקת ההזרקה EBD לוריד הקרדינל הנפוץ (CCV) של אמברי דג הזברהo. עובר () uninjected. חץ מציין מיקום אידיאלי להזרקת CCV. זריקה מוצלחת לCCV (B). הצבע נכנס לחדרי הלב (החץ) ומתחיל להישאב דרך כלי הדם. (ג) הזרקת CCV לא מוצלחת תגרום חלק או את כל הצבע שנכנס לצק החלמון של העובר (חץ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53183/53183fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig2.jpg" /> עוברים 2. איור ניתן למיין לזריקה מוצלחת על ידי התבוננות הפצת FITC-dextran תחת הקרינה ירוקה לאורך כלי הדם לאחר הזרקה ולפני ספיגת EBD מייד.אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig3.jpg" /> איור 3: EBD יילקח על ידי סיבים עם ממברנות פגומות אחים wildtype () לא מראים הקרינה EBD בסיבי שריר.. (ב) מוטציה הומוזיגוטים Sapje ​​עם הקרינה EBD בתוך סיבי שריר מרובים (חיצים). כל הזחלים הוזרקו תערובת הזרקת EBD ונותחו לאחר תקופת דגירה 4 שעות ב 3 DPF. אחים ומוטציות מוינו על ידי ניתוק סיבי שריר לפני הזרקת CCV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53183/53183fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye at JoVE.com

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

analysis-zebrafish-larvae-skeletal-muscle-integrity-with-evans-blue

Google

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.0K Views.  The Hospital for Sick Children. In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Video: Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

אינדוקציה של התחדשות שריר שלד החריף ידי Cardiotoxin הזרקה

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Microstructured מכשירי Microinjection אופטימיזציה והדימות של הזחלים דג זברה

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To investigate the underlying mechanisms that bring about various muscle adaptations, a number of exercise protocols such as treadmill, wheel running, and swimming exercise have been used in the animal studies. However, these exercise models require a long period of time to achieve muscle adaptations, which may be also regulated by humoral or neurological factors, thus limiting their applications in studying the muscle-specific contraction-induced adaptations. Indirect low frequency stimulation (10 Hz) to induce chronic contractile activity (CCA) has been used as an alternative model for exercise training, as it can successfully lead to muscle mitochondrial adaptations within 7 days, independent of systemic factors. This paper details the surgical techniques required to apply the treatment of CCA to the skeletal muscle of rats, for widespread application in future studies.

This protocol describes the use of the chronic contractile activity model of exercise to observe stimulation-induced skeletal muscle adaptations in the rat hindlimb.

יישום של גירוי כרוני ללמוד עיבודים פנוטיפי של שרירי השלד כויץ הנוצרות על-ידי פעילות עכברוש

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

זיהוי של שרירי השלד תאים הלוויין על-ידי Immunofluorescence עם Pax7 ו- Laminin נוגדנים

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle regenerative process. There are recognized challenges to working with human primary adult stem cells, particularly human muscle progenitor cells (hMPCs) derived from skeletal muscle biopsies, including low cell yield from collected tissue and a large degree of donor heterogeneity of growth and death parameters among cultures. While incorporating heterogeneity into experimental design requires a larger sample size to detect significant effects, it also allows us to identify mechanisms that underlie variability in hMPC&#160;expansion capacity, and thus allows us to better understand heterogeneity in skeletal muscle regeneration. Novel mechanisms that distinguish the expansion capacity of cultures have the potential to lead to the development of therapies to improve skeletal muscle regeneration.

We present techniques for isolating, culturing, characterizing, and differentiating human primary muscle progenitor cells (hMPCs) obtained from skeletal muscle biopsy tissue. hMPCs obtained and characterized through these methods can be used to subsequently address research questions related to human myogenesis and skeletal muscle regeneration.

בידוד, תרבות, אפיון, והבידול של תאים האדם שריר ביופסיה של השלד שרירי השגרה נוהל

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

ביצוע שריר השלד האנושי Xenografts בעכברים חיסוני

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

בידוד והבידול של מכשולים ראשוניים מתוך שריר השלד של העכבר Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...