The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.

ملاحظة: يبدأ هذا البروتوكول بعد واحد قد عزل الميتوكوندريا من عضلات الهيكل العظمي الأحمر. تم عزل الميتوكوندريا كما هو موضح سابقا من ~ 75-100 ملغ من الهيكل العظمي والعضلات الحمراء (13). بين 5 - سيتحقق 10 ميكروغرام / ميكرولتر من البروتين الميتوكوندريا من هذا المبلغ من الأنسجة عن طريق إعادة التعليق على بيليه النهائي الميتوكوندريا في ≤50 ميكرولتر من العازلة عزل الميتوكوندريا (IBM) 2 (انظر Frisard وآخرون 13). 1. إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العمل حلول الأوراق المالية (الجدول 1) والحل فحص الميتوكوندريا (MAS) يمزج (الجدول 2) لفحوصات لاحقة. ملاحظة: يمكن أن يتم معظم التحضير للفحوصات مقدما لأن معظم الحلول الأسهم وMAS يمكن تخزينها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هيدرات خرطوشة فحص respirometric في 1 مل من محلول المعايرة في الليلة التي سبقت التجربة في غير CO-2 حاضنة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم من التجربة، رأك من الأسهم المجمدة (ركائز وجهري الميتوكوندريا، MAS المزيج، MAS ث / س BSA، الجدول 1)، وذوبان الجليد في 37 ° C حمام أو الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد جميع الحلول الركيزة (الجدول 3) والحقن (الجدول 4-5) وضبط درجة الحموضة كما هو مطلوب (7.4 درجة الحموضة). بعد يتم ضبط درجة الحموضة، وتخزين على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> برنامج متعدد جيدا آلة قياس استهلاك الأوكسجين إلى المزيج الصحيح، الانتظار، والمعلمات قياس (انظر الجدول 6) والخلفية التسمية ومجموعة / حالة الآبار عن طريق إدخال أول برنامج التحليل، يليه وضع &quot;ستاندرد&quot;. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الدخول في منتدى &quot;ضيف&quot; وانقر على &quot;معالج الفحص&quot;. مرة واحدة في &quot;معالج الفحص&quot;، انقر على &quot;بروتوكول&quot; لتغيير المزيج، الانتظار، وقياس المعلمات. تسمية الآبار الخلفية تحت عنوان &quot;عودة. تصحيح &quot;علامة التبويب وتأكد لتسليط الضوء على&quot; هل تصحيح الخلفية &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التسمية كوندitions عن طريق النقر الأول على &quot;المجموعات وتسميات&quot; علامة التبويب، تليها &quot;مجموعة معلومات&quot; علامة التبويب. بعد أن يتم إدخال هذه المعلمات، انقر فوق &quot;إنهاء&quot;، تليها &quot;حفظ القالب&quot;. </li></ol></li></ol> 2. الفحص تشغيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل حلول الحقن في مقايسة خرطوشة تشغيل وبدء المعايرة عن طريق إدخال أول برنامج التحليل، يليه دخول وضع &quot;عادي&quot;. الدخول في منتدى &quot;ضيف&quot;. فتح القالب المحفوظة في الخطوة 1.5 تحت &quot;XF&quot; حملة تحت &quot;قوالب&quot; علامة التبويب. مرة واحدة مفتوحة، انقر على زر &quot;ابدأ&quot; لبدء المعايرة. ملاحظة: يجب إدخال خرطوشة المدى الفحص في الجهاز مع الزاوية حقق إلى أسفل اليسار. وهذا يستغرق حوالي 30 دقيقة. الحرص على حقن الحلول في المنافذ المناسبة. وترد الحقن في الجدول 4-5 في ترتيب التحميل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف، ولكن مزيج دقيق mitochondالأوراق المالية ريا عن طريق اثارة الحل مع ماصة 200 ميكرولتر، تليها الطحن بلطف الأسهم مع ماصة 200 ميكرولتر التي تمت زيارتها فتحتها اتسعت عن طريق خفض ~ 3 ملم من نهاية طرف مع مقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء حمض bicinchoninic (BCA) فحص لتحديد تركيز البروتين في الأوراق المالية الميتوكوندريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام تركيز الأسهم المكتسبة من الخطوة 2.3، و resuspend 10 ميكروغرام من البروتين الميتوكوندريا / 200 ميكرولتر من مزيج الركيزة سوسينات / روتينون (الجدول 3). و resuspend 14 ميكروغرام من البروتين الميتوكوندريا / 200 ميكرولتر من تبقى يمزج الركيزة (يجب أن يتم هذا لكل مزيج الركيزة) (الجدول 3). وضع كل من البروتين الميتوكوندريا / الركيزة تختلط على الجليد. ملاحظة: تم تحديد المبلغ الأمثل للالميتوكوندريا البروتين لكل بئر لكل مقايسة كما هو موضح سابقا 9. تقرر أن البيروفات / مالات، بالميتويل الكارنيتين / مالات، الغلوتامات / مالات لد المقايسات تدفق الإلكترونات تستخدم 3.5 ميكروغرام من البروتين الميتوكوندريا، في حين يستخدم الفحص سوسينات / روتينون 2.5 ميكروغرام من البروتين الميتوكوندريا لكل بئر. ولذلك، يحتاج الباحث ل resuspend ما يكفي من البروتين الميتوكوندريا لمدة 4 يعيد في هذه الخطوة منذ إما 2.5 ميكروغرام أو يتم تحميل 3.5 ميكروغرام في 50 ميكرولتر لكل بئر (انظر الخطوة 2.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج الحلول الميتوكوندريا / الركيزة بلطف، ولكن بدقة عن طريق اثارة الحل مع ماصة 200 ميكرولتر، تليها الطحن بلطف الأسهم مع ماصة 200 ميكرولتر التي تمت زيارتها ~ 3 ملم من نهايته قطع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة الثقافة الخلية على الجليد وفي ثلاث نسخ، تحميل 50 ميكرولتر / جيد لكل من يمزج الميتوكوندريا / الركيزة. المطورين من صفيحة ميكروسكوبية أساس مقايسة respirometric نوصي ترك ما لا يقل عن اثنين فارغة (لا الميتوكوندريا) بئرا، ويفضل على جانبي على لوحة ثقافة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور لوحة الثقافة الخلية في 2000 ز لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. في حين أن لوحة هي الصورةتعلق، الاحماء الحلول الركيزة في حمام مائي 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد زيادة ونقصان كاملة، تحميل بعناية 450 ميكرولتر من كل حل الركيزة على رأس الآبار الخاصة به (أي تحميل البيروفات / الركيزة مالات إلى الآبار التي تحتوي على الميتوكوندريا معلق في البداية في هذا الحل الركيزة). تأكد من تحميل لوحة في RT. ملاحظة: يجب أن يتم تحميل الآبار فارغة مع 500 ميكرولتر من الركيزة. آبار فارغة مخصصة لالإلكترون تدفق الفحص يجب أن يتم تحميل مع الركيزة تدفق الإلكترونات (البيروفات / مالات + FCCP)، في حين أن الفحص إلى جانب الآبار فارغة يمكن تحميلها مع أي الركيزة اقتران الفحص. ملاحظة: إذا كان أداء المقايسات تدفق المترابطة والإلكترون على نفس لوحة، ويجب على الباحث إعادة تعيين الآبار الخلفية لفحوصات منها بعد تشغيل فحص اكتمال باستخدام منصة &quot;XF قارئ&quot; عبر برنامج &quot;الصك&quot; علامة التبويب. مرة واحدة في الإعداد &quot;الصك&quot;، انقر على &quot;الإدارة&quot;علامة التبويب، تلاه سهم &quot;تصحيح الخلفية&quot;. ضرب &quot;إنهاء وضع الإعداد الصك&quot; عند اكتماله. وذلك لأن الجمع بين أسكوربات / TMPD يمكن أن تستهلك O 2، وبالتالي لا بد من تصحيح خلفية منفصلة لكل نوع الفحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إضافة ميكرولتر 450 من الركيزة إلى كل بئر، عرض طبقة من الميتوكوندريا في البئر لضمان فرقت الميتوكوندريا بالتساوي في أحادي الطبقة واحدة (20X التكبير [انظر روجرز 9، الشكل 4]). الآبار التي لا يبدو أن لها أحادي الطبقة موزعة بالتساوي يمكن إزالة اللاحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التحقق من الالتزام الميتوكوندريا، إدراج صفيحة ميكروسكوبية إلى أداة فحص respirometric وبدء فحص تشغيل بالنقر على &quot;OK&quot;. ملاحظة: يجب أن تكون معايرة من الخطوة 2.1 كاملة قبل سيبدأ التشغيل. وبمجرد أن ينقر الباحث &quot;موافق&quot;، فإن آلة إخراج لوحة الأداة التي كانت تستخدم لمعايرة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"> &lt;لى&gt; إزالة لوحة المرافق ووضع لوحة ثقافة الخلية التي تحتوي على الميتوكوندريا على الدرج. يجب وضع الشق الأزرق على لوحة زراعة الخلايا في أسفل الزاوية اليسرى من الدرج. انقر على &quot;متابعة&quot; لبدء تشغيل الفحص. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تشغيل كاملة، إخراج لوحة خلية ثقافة وخرطوشة عن طريق الضغط على &quot;إخراج&quot; على الشاشة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم إخراج لوحة، وإزالة والتخلص من لوحة خلية ثقافة وخرطوشة وانقر على &quot;متابعة&quot; على الشاشة. سيتم حفظها على المدى تلقائيا ملف .xls في ملف &quot;بيانات&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح هذا الملف وتغيير العرض من &quot;O2&quot; إلى &quot;OCR&quot; عن طريق ضرب السهم نحو الانخفاض تحت &quot;Y1:&quot; علامة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التغيير القادم &quot;الشرق بوينت&quot; إلى &quot;نقطة إلى نقطة الاسعار&quot; تحت عنوان &quot;معدل البيانات المعروض ك:&quot; الخيار. انقر على زر &quot;موافق&quot; لتطبيق هذه التغييرات. </li></ol&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على &quot;وضع مجموعة حسنا&quot; علامة على الجزء السفلي الأيسر من الشاشة لآبار مجموعة من الظروف المتشابهة معا. وأخيرا، انقر فوق &quot;متوسط ​​العينة / معيار الخطأ&quot; علامة التبويب نحو منتصف الشاشة، إلى اليسار. بدلا من ذلك، يمكن لهذه الأوامر يكون الإعداد قبل أن يبدأ الفحص في الإعداد &quot;معالج الفحص&quot;. ملاحظة: كل حالة سيكون له يعني ± الانحراف المعياري عرض لكل معدل وكل حالة. هناك قياسات معدل اتخاذها في حالة (حالة 2 [اقتران] / State3u [الكترون تدفق] التنفس تليها أربع حقن). استخدام متوسط ​​معدل الدولة 2 من القياس الثاني، تحديد الدولة 4O في الدنيا نقطة بعد أوليغوميسين الحقن، واستخدام أقصى نقطة للدولة 3 و3U الدولة بعد ADP وحقن FCCP، على التوالي، واستخدام الحد الأدنى من نقطة لAntimycin A التنفس التي يسببها للفحوصات اقتران. استخدام نقطة القصوى لالبيروفات / مالات يسببها الدولة 3U التنفس، واستخدام الحد الأدنىنقطة لروتينون الناجم عن التنفس، واستخدام أقصى نقطة لسوسينات يسببها 3U الدولة التنفس، واستخدام نقطة الحد الأدنى لAntimycin A التنفس التي يسببها للمقايسة الكترون التدفق. أجريت جميع التجارب 3 مرات والبيانات الواردة هي نتائج البحث عن المفقودين تمثيلي. </li></ol>

<ol>
	<li>Brand, M., Nicholls, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem J. 435, 297-312 (2011).</li><li>Wang, H., Hiatt, W. R., Barstow, T. J., Brass, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+muscle+mitochondrial+DNA+content,+mitochondrial+enzyme+activity+and+oxidative+capacity+in+man:+alterations+with+disease.">Relationships between muscle mitochondrial DNA content, mitochondrial enzyme activity and oxidative capacity in man: alterations with disease.</a> European Journal of Applied Physiology and Occupational Physiology. 80, 22-27 (1999).</li><li>Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome+in+aging+and+senescence.">The mitochondrial genome in aging and senescence.</a> Ageing Research Reviews. 18C, 1-15 (2014).</li><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+in+sickness+and+in+health.">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148, 1145-1159 (2012).</li><li>Dube, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+lipid+overload+on+skeletal+muscle+insulin+resistance,+metabolic+flexibility,+and+mitochondrial+performance.">Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance.</a> Endocrinology and Metabolism. 307, E1117-E1124 (2014).</li><li>Disease Control and Prevention Services. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+diabetes+statistics+report:+estimates+of+diabetes+and+its+burden+in+the+United+States.">National diabetes statistics report: estimates of diabetes and its burden in the United States.</a> , (2014).</li><li>Guarino, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+determining+oxygen+consumption+rates+of+static+cultures+from+microplate+measurements+of+pericellular+dissolved+oxygen+concentration.">Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86, 775-787 (2004).</li><li>Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+function+using+phosphorescent+oxygen-sensitive+probes.">Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes.</a> Nature Protocols. 1, 2563-2572 (2007).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6, e21746 (2011).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, C125-C136 (2007).</li><li>Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+biogenetically+competent+mitochondria+from+mammalian+tissues+and+cultured+cells.">Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells.</a> Methods (San Diego, Calif.). 26, 292-297 (2002).</li><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+fibroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).</li><li>Frisard, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+levels+of+lipopolysaccharide+modulate+mitochondrial+oxygen+consumption+in+skeletal+muscle.">Low levels of lipopolysaccharide modulate mitochondrial oxygen consumption in skeletal muscle.</a> Metabolism. 64, 416-427 (2015).</li><li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+chain+and+oxidative+phosphorylation.">The respiratory chain and oxidative phosphorylation.</a> Advances in Enzymology and Related Subjects of Biochemistry. 17, 65-134 (1956).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+pathways+and+respiratory+control.">Mitochondrial pathways and respiratory control.</a> , (2007).</li></ol>

جورج روجرز هو موظف من فرس البحر العلوم البيولوجية التي تقوم بتصنيع الصك الذي وضعت هذه المقايسات.

الطرق الواردة في هذه المادة توفر خطوة بخطوة تعليمات لأداء مجموعة من صفيحة ميكروسكوبية مقرها المقايسات respirometric باستخدام الميتوكوندريا المعزولة 75-100 ملغ من الماوس العضلات والهيكل العظمي. ويمكن تنفيذ هذه المقايسات مع دقة عالية كما يتضح من الانحراف المعياري ضيق بين الآبار ثلاث نسخ. الأهم من ذلك، هذه المقايسات respirometric تسمح التحديد الدقيق من حيث تشوهات و / أو التعديلات قد تحدث في ETC، دورة TCA، مسار β للأكسدة، النقل الركيزة، وما إلى ذلك في نموذج حيواني تستخدم عادة. من المهم تسليط الضوء على الأساس المنطقي لاستخدام مختلف أنواع الوقود ومثبطات المستخدمة في هذا البروتوكول. البيروفات / مالات والغلوتامات / المقايسات respirometric مالات يسمح لتقييم مجمع I التنفس بوساطة، فضلا عن تقييم شركات النقل الخاصة بها، وذلك في حالة من الغلوتامات، ونازعة أمين 15. بدلا من ذلك، فإن الجمع بينسوسينات / روتينون يسمح تقييم تدفق الجهاز التنفسي الميتوكوندريا من خلال مجمع الثاني من ETC منذ روتينون يمنع مجمع الأول ويتيح سوسينات الإلكترونات إلى مجمع II عن طريق الحد من فلافين الأدينين ثنائي النوكليوتيد (القوات المسلحة الهايتية 2) 15. توفر هذه المقايسات معلومات محددة الركيزة لكفاءة اقتران والتنفس القصوى. فحص تدفق الإلكترونات هي فريدة من نوعها في أن الجمع بين ركائز ومثبطات يسمح لتقييم المجمعات متعددة خلال تدفق الجهاز التنفسي الميتوكوندريا 9. مزيج الركيزة الأولي من البيروفات / مالات + FCCP يسمح لتقييم التنفس القصوى يقودها مجمع I، في حين أن حقن روتينون تليها سوسينات يسمح للتنفس القصوى تقييم يقودها مجمع II. حقن Antimycin A، مثبط لمجمع III، تليها حقن أسكوربات / TMPD السماح لللتقييم التنفس يقودها مجمع IV منذ أسكوربات / TMPD هوالإلكترون المانحة لالسيتوكروم C / مجمع IV. في حين يتم الحصول على أي معلومات عن كفاءة اقتران، فإن هذه الطريقة مثالية لأحجام عينة صغيرة جدا التي تحول دون تشغيل ركائز متعددة بشكل مستقل. وأخيرا، واستخدام بالميتويل الكارنيتين / مالات يسمح لتقييم التنسيق بين β للأكسدة وETC منذ ما يعادل خفض إنتاجها من أكسدة الأحماض البالمتيك (β-الأكسدة) تغذي ETC من خلال الإلكترون نقل بروتين فلافيني 15. وتجدر الإشارة إلى أن فحوصات تدفق اقتران والكترون ويمكن أيضا أن تستخدم جنبا إلى جنب لتحديد التغيرات في وظيفة الميتوكوندريا بسبب بعض التدخل (العلاج من تعاطي المخدرات، والتلاعب الجيني). ومن المقرر في المقام الأول إلى خلط دقيق من الميتوكوندريا عالية الدقة بلغ عن هذه المقايسات، سواء كان ذلك قبل تقرير البروتين، أو مع حلول الركيزة. على طول هذه الخطوط، وبمجرد أن الميتوكوندريا وresuspendend في solutio الركيزةنانوثانية، فمن الأهمية بمكان لخلط هذا الحل مسبق بدقة لتحميل لوحة زراعة الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2.2 مع اتساع فتحة طرف ماصة. عدم خلط الميتوكوندريا بدقة سوف يؤدي إلى تفاوت كبير في الفحص. وبالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام فتحة ضيقة ماصة سيخلق قوى القص في حين خلط الميتوكوندريا ويزيد من القدرة على تلف الأغشية الميتوكوندريا والإفراج عن السيتوكروم C. الخطوة التزام (2.7) هي أيضا خطوة حاسمة في هذا البروتوكول. وعدم تدور تحميل لوحة الثقافة خلية طويلة / بسرعة كافية يؤدي إلى الالتزام غير الكامل للالميتوكوندريا إلى البئر، مما أدى إلى زيادة التباين بين الآبار والقياسات. وقد تم تحسين بروتوكول صفها لتشمل: تحميل مبلغ الأمثل للبروتين الميتوكوندريا لكل بئر، وذلك باستخدام تركيزات / أساليب إعداد الصحيحة لجعل الأسهم والركيزة الحلول، وتغيير على المدى فحص للتأكد من جيش التحرير الشعبى الصينى دولة الميتوكوندرياteaus، وخلط المناسب للسهم والميتوكوندريا / الركيزة الميتوكوندريا يمزج. قبل هذه الجهود الأمثل، واجهت عثرات الكتاب في المدى الفحص. يناقش يلي طرق استكشاف الأخطاء وإصلاحها / التعديلات التي كانت مفيدة في تحسين هذا البروتوكول. وفيما يتعلق التحميل الأمثل، وتحميل الميتوكوندريا قليلة جدا لا تثير استجابة قوية، أثناء تحميل الميتوكوندريا الكثير من واستنفاد الأكسجين داخل microchamber وتؤدي إلى قياسات غير دقيقة. روجرز وآخرون 9 يقدم أمثلة من تحديد كميات التحميل الأمثل الميتوكوندريا لكل بئر للصفيحة ميكروسكوبية مقرها المقايسات respirometric. في كثير من الأحيان، يتم تحميل الميتوكوندريا الكثير لكل بئر كما يتضح من الدولة 2 معدلات أكثر من 100-200 بمول / دقيقة / جيد والدولة 3 معدلات&gt; 1500 بمول / دقيقة / جيد. إذا حدث الحمولة الزائدة، إجراء تجربة مع اختلاف تركيز البروتين الميتوكوندريا (على سبيل المثال، بين 1 - 10 ميكروغرام) للحصول OCRs داخل ص الديناميكيانجى للآلة قياس استهلاك الأوكسجين. إعداد واستخدام تركيزات الصحيحة من ركائز والأسهم هي ذات أهمية قصوى. دائما استخدام الحمض من ركائز / الحقن وضبط درجة الحموضة مع هيدروكسيد البوتاسيوم أو حمض الهيدروكلوريك. مخازن الصوديوم / لا ينصح الحلول. بالإضافة إلى ذلك، ركائز إعادة التعليق / الأسهم في DMSO أو الإيثانول بنسبة 100٪ سوف يؤدي إلى فشل قياس أو خطأ. تأكد من استخدام الايثانول 95٪ حيث لوحظ. ومن الشائع لبالميتويل الكارنيتين ليعجل خروج من الايثانول 95٪ بعد ذوبان المجمدة الأسهم، مما تسبب تقلبات كبيرة. ومن المؤكد أن الاحماء الأسهم بالميتويل الكارنيتين ودوامة جيدا قبل الاستخدام. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون شديدة التباين البيروفات / مالات نتيجة الفحص نظرا لكائن الأسهم البيروفات&gt; 2 أسابيع من العمر. مما لا شك فيه أن يعيد قسامات المجمدة البيروفات كل 2 أسابيع. تم تعديل المدى مقايسة لقياسات 2-دقيقة لضمان الهضاب الدولة الميتوكوندريا. إذا كان المطلوب مراقبة استنفاد ADP، يجوز للباحثتمديد وقت القياس تحت عنوان &quot;البروتوكول&quot; التبويب في إطار منتدى &quot;معالج الفحص&quot;. أخيرا، يحدث تفاوت كبير عندما لا يتم المتجانس في الأوراق المالية والميتوكوندريا الميتوكوندريا بالإضافة إلى الركيزة حلول مسبق تماما التحميل. إذا التباين بين الآبار عالية بعد تشغيل الفحص، تأكد من مزيج تماما الحل الركيزة قبل التجربة المقبلة. أبدا دوامة الحلول الميتوكوندريا / الركيزة، وليس إثارة، والهريس، ويسحن بلطف مع اتساع فتحة طرف ماصة. هناك بعض القيود المفروضة على هذه التقنية التي تستحق الملاحظة. أولا، عدد من الآبار على لوحة زراعة الخلايا المستخدمة لهذه المقايسات منخفض نسبيا (أي.، 24 بئرا و 2 على الأقل المعينة للآبار فارغة). إذا كان المطلوب من أداء كل 5 من هذه المقايسات على لوحة واحدة، الباحث هو فقط قادرة على فحص ردود من الماوس في وقت واحد. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن و96 أدوات جيدا المتاحة لhigheص الإنتاجية. ثانيا، هناك نقاط القوة ونقاط الضعف الكامنة في تقييم ضعف الميتوكوندريا في الميتوكوندريا المعزولة مقارنة في خلايا سليمة 1. وتشمل بعض نقاط الضعف التي لها علاقة أقل الفسيولوجية بالمقارنة مع خلايا سليمة وحمل التحف من عملية العزل. وأخيرا، فإن نجاح هذه الطريقة يتوقف على نوعية العملية العزلة الميتوكوندريا. على الرغم من أن بعض هذه المقايسات تم وضعها إما في مختلف النظم أو تم التحقق من صحتها في النماذج الحيوانية الأخرى، الأساليب الواردة في هذه الوثيقة هي الأولى لتجميع كل من المقايسات المذكورة أعلاه للاستخدام الأمثل في الماوس متعددة أيضا آلة قياس استهلاك الأكسجين باستخدام العضلات والهيكل العظمي. الأهم من ذلك، كل 5 من هذه المقايسات لا يمكن أن يؤديها مع كمية من الميتوكوندريا المعزولة من ~ 75-100 ملغ من الماوس العضلات والهيكل العظمي، وبالتالي توفير إنتاجية عالية مع الحد الأدنى من المواد. ذات أهمية كبيرة، وقدرة متعددة جيداتقنيات استهلاك الأكسجين لأداء المقايسات مع كميات ضئيلة من الميتوكوندريا، جنبا إلى جنب مع أسلوب العزل الأمثل، بما يسمح للباحث لإجراء العديد من التجارب الأخرى مع ما تبقى من أنسجة العضلات والهيكل العظمي (على سبيل المثال، البقع الغربية، RT-PCR، المقايسات الأنزيمية، وما إلى ذلك)، والتي غالبا ما يكون الصراع مع هذا النموذج الحيواني. في الختام، الأساليب المقدمة في هذه الوثيقة توفر خطوة بخطوة تعليمات لأداء مجموعة من صفيحة ميكروسكوبية مقرها المقايسات respirometric باستخدام كميات ضئيلة من الماوس العضلات والهيكل العظمي. الأهم من ذلك أن الأساليب المقدمة تتطلب كميات ضئيلة من الأنسجة والميتوكوندريا. مرة واحدة يتقن، فإن الأساليب المذكورة في هذه الوثيقة تسمح للباحثين لتحديد آلية ممكنة لمركب أو الجين المنتج على استهلاك الأوكسجين الميتوكوندريا في نموذج حيواني تستخدم عادة.

دور الفسيولوجية الرئيسي الميتوكوندريا العضلات والهيكل العظمي هو إنتاج ATP من الفسفرة التأكسدية 1. الأهم من ذلك، الميتوكوندريا العضلات والهيكل العظمي دورا محددا في القدرة على ممارسة الرياضة 2، والشيخوخة 3، الأمراض التنكسية (4) والنوع الثاني من مرض السكري 5. كما مجتمع الشيخوخة، والسكري من النوع الثاني يكون السبب الرئيسي ال 7 للوفاة في الولايات المتحدة 6، أصبحت الحاجة إلى أساليب التي تقيم وظيفة الميتوكوندريا على نحو متزايد أكثر انتشارا في البحوث الطبية الحيوية 7،8. على وجه التحديد، وقياس استهلاك الأوكسجين له فائدة استثنائية في تقييم وظيفة الميتوكوندريا لأنها تمثل وظيفة منسقة بين جينوم الميتوكوندريا والنووية للتعبير عن المكونات الوظيفية لالفسفرة التأكسدية 9. العديد من التقنيات موجودة والتي تمكن من قياس استهلاك الأوكسجين في خلايا سليمة وعزلد الميتوكوندريا 7-10. وبالإضافة إلى ذلك، تم تطوير فحوصات لأنواع خلايا متعددة والأنسجة، ومجموعة متنوعة من الأنواع التي تسمح لقياس مسارات الميتوكوندريا والتحكم في الجهاز التنفسي 9،11،12. ومع ذلك، لا يوجد حاليا فراغا في الأدب في ما يخص تجميع كل هذه المقايسات باستخدام الميتوكوندريا المعزولة من الماوس العضلات والهيكل العظمي لاستخدامها في تقنيات استهلاك الأوكسجين صفيحة ميكروسكوبية القائمة. الأهم من ذلك، استخدام صفيحة ميكروسكوبية مقرها المقايسات respirometric ينمو بين علماء الأحياء الميتوكوندريا ويسمح لقياس إنتاجية عالية باستخدام كميات ضئيلة من الميتوكوندريا معزولة 9. لذلك، وضعت مجموعة من صفيحة ميكروسكوبية مقرها المقايسات respirometric التي تسمح التحديد الدقيق من حيث تشوهات و / أو التعديلات قد تحدث في سلسلة نقل الإلكترون (ETC). وبالإضافة إلى ذلك، تم تطوير تحليلين respirometric صفيحة ميكروسكوبية إضافية على أساس أن تمكين تقييم التنسيق بين هذا وذاكن الثلاثي الكربوكسيل حمض (TCA) دورة وETC، وبين ß للأكسدة والخ. الأهم من ذلك أن الأساليب المقدمة توفر وسيلة واضحة وموجزة لقياس التغيرات الميكانيكية في وظيفة الميتوكوندريا في نموذج حيواني تستخدم عادة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63559</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic, minimum 99.0%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate, ACS reagent, 99.0-102.0%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essentially Fatty&#160;</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">A6003</td>
			<td rowspan="2">Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Free- BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>107360</td>
			<td>Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9512</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(-) Malic Acid, BioXtra, &#8805;95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6413</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">L-Glutamic acid</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">G1251</td>
			<td rowspan="2">Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-p-phenylenediamine</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">T7394</td>
			<td rowspan="2">Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99%, powder [TMPD]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl L-carnitine chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A, &#8805; 95% (HPLC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)</td>
			<td rowspan="3">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="3">C2920</td>
			<td rowspan="3">Store at 2-8&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylhydrazone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8805;98% (TLC), powder [FCCP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP]</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">A5285</td>
			<td rowspan="2">Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.

Watch this Scientific Journal Video about Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements at JoVE.com

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

عن طريق عزل الميتوكوندريا من كميات الحد الأدنى من الفأر العضلات الهيكلية لارتفاع صفيحة ميكروسكوبية الإنتاجية قياسات الجهاز التنفسي

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

using-isolated-mitochondria-from-minimal-quantities-mouse-skeletal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.5K Views.  Virginia Tech. The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

Video: Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

العزلة والكمية Immunocytochemical توصيف الخلايا عضلي الابتدائية والخلايا الليفية من العضلات الهيكلية البشرية

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

تحريض الحاد الهيكل العظمي تجديد العضلات التي Cardiotoxin حقن

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

إعداد والثقافة من الخلايا عضلي السلائف / Myoblasts الابتدائية من العضلات الهيكلية من الكبار والمسنين البشر

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

عزل من النوع الأول والنوع الثاني بيريسيتس من عضلات الماوس الهيكل العظمي

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To investigate the underlying mechanisms that bring about various muscle adaptations, a number of exercise protocols such as treadmill, wheel running, and swimming exercise have been used in the animal studies. However, these exercise models require a long period of time to achieve muscle adaptations, which may be also regulated by humoral or neurological factors, thus limiting their applications in studying the muscle-specific contraction-induced adaptations. Indirect low frequency stimulation (10 Hz) to induce chronic contractile activity (CCA) has been used as an alternative model for exercise training, as it can successfully lead to muscle mitochondrial adaptations within 7 days, independent of systemic factors. This paper details the surgical techniques required to apply the treatment of CCA to the skeletal muscle of rats, for widespread application in future studies.

This protocol describes the use of the chronic contractile activity model of exercise to observe stimulation-induced skeletal muscle adaptations in the rat hindlimb.

تطبيق التحفيز المزمن لدراسة التعديلات المظهرية الهيكل العظمى والعضلات الهوس الفئران التي يسببها النشاط

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

تحديد خلايا الهيكل العظمى والعضلات الأقمار الصناعية قبل الفلورة مع Pax7 والأجسام المضادة لامينين

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal muscle. Mouse skeletal muscle has been shown to produce high quality X-ray diffraction patterns on third generation synchrotron beamlines providing an opportunity to link changes at the level of the genotype to functional phenotypes in health and disease by determining the structural consequences of genetic changes. We present detailed protocols for preparation of specimens, collecting the X-ray patterns and extracting relevant structural parameters from the X-ray patterns that may help guide experimenters wishing to perform such experiments for themselves.

We present detailed protocols for performing small-angle X-ray diffraction experiments using intact mouse skeletal muscles. With the wide availability of transgenic mouse models for human diseases, this experimental platform can form a useful test bed for elucidating the structural basis of genetic muscle diseases

الأشعة السينية الانعراج من العضلات الهيكلية Murine سليمة كأداة لدراسة الأساس الهيكلي لأمراض العضلات

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle regenerative process. There are recognized challenges to working with human primary adult stem cells, particularly human muscle progenitor cells (hMPCs) derived from skeletal muscle biopsies, including low cell yield from collected tissue and a large degree of donor heterogeneity of growth and death parameters among cultures. While incorporating heterogeneity into experimental design requires a larger sample size to detect significant effects, it also allows us to identify mechanisms that underlie variability in hMPC&#160;expansion capacity, and thus allows us to better understand heterogeneity in skeletal muscle regeneration. Novel mechanisms that distinguish the expansion capacity of cultures have the potential to lead to the development of therapies to improve skeletal muscle regeneration.

We present techniques for isolating, culturing, characterizing, and differentiating human primary muscle progenitor cells (hMPCs) obtained from skeletal muscle biopsy tissue. hMPCs obtained and characterized through these methods can be used to subsequently address research questions related to human myogenesis and skeletal muscle regeneration.

العزلة والثقافة والتوصيف والتمايز بين خلايا ذرية العضلات البشرية من إجراء خزعة العضلات الهيكلية

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

أداء العضلات الهيكلية البشرية Xenografts في الفئران نقص المناعة

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...