Name: studying microbial communities in vivo: a model of host-mediated interaction between candida albicans and pseudomonas aeruginosa in the airways
Uploaded: 2016-01-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways at JoVE.com

The authors would like to acknowledge the University of Lille and the Pasteur Institute of Lille, especially Thierry Chassat and Jean-Pierre Decavel, responsible for animal housing breeding safety and husbandry. This work was supported by the "Soci&#233;t&#233; de Pathologies Infectieuses de Langue Fran&#231;aise" (SPILF).

<ol>
	<li>Casadevall, A., Pirofski, L. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+damage-response+framework+of+microbial+pathogenesis.">The damage-response framework of microbial pathogenesis.</a> Nat. Rev. Micro. 1 (1), 17-24 (2003).</li><li>Eddens, T., Kolls, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+defenses+against+bacterial+lower+respiratory+tract+infection.">Host defenses against bacterial lower respiratory tract infection.</a> Curr. Opi. Immunol. , (2012).</li><li>Beck, J. M., Young, V. B., Huffnagle, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiome+of+the+lung.">The microbiome of the lung.</a> Translational research : J. Lab. Clin Med. 160 (4), 258-266 (2012).</li><li>Hogan, D. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas-Candida+interactions:+an+ecological+role+for+virulence+factors.">Pseudomonas-Candida interactions: an ecological role for virulence factors.</a> Science. 296 (5576), 2229-2232 (2002).</li><li>Nseir, S., Ader, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+and+Candida+albicans:+do+they+really+need+to+stick+together.">Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans: do they really need to stick together.</a> Crit. Care Med. 37 (3), 1164-1166 (2009).</li><li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+competition:+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle.">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nat. Rev. Micro. 8 (1), 15-25 (2010).</li><li>Gibbons, D. L., Spencer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+and+human+intestinal+immunity:+same+ballpark,+different+players;+different+rules,+same+score.">Mouse and human intestinal immunity: same ballpark, different players; different rules, same score.</a> Mucosal Immunol. 4 (2), 148-157 (2011).</li><li>Ariffin, J. K., Sweet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+repertoire,+regulation+and+function+of+Toll-like+Receptors+and+inflammasome-forming+Nod-like+Receptors+between+human+and+mouse.">Differences in the repertoire, regulation and function of Toll-like Receptors and inflammasome-forming Nod-like Receptors between human and mouse.</a> Curr. Opi. Micro.. , (2013).</li><li>Slutsky, A. S., Ranieri, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventilator-Induced+Lung+Injury.">Ventilator-Induced Lung Injury.</a> NEJM. 369 (22), 2126-2136 (2013).</li><li>Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medically+important+bacterial-fungal+interactions.">Medically important bacterial-fungal interactions.</a> Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).</li><li>Roux, D., Gaudry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+impairs+macrophage+function+and+facilitates+Pseudomonas+aeruginosa+pneumonia+in+rat.">Candida albicans impairs macrophage function and facilitates Pseudomonas aeruginosa pneumonia in rat.</a> Crit. Care Med. 37 (3), 1062-1067 (2009).</li><li>Mear, J. B., Gosset, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+Airway+Exposure+Primes+the+Lung+Innate+Immune+Response+against+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+through+Innate+Lymphoid+Cell+Recruitment+and+Interleukin-22-Associated+Mucosal+Response.">Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response.</a> Infect. Immun. 82 (1), 306-315 (2013).</li><li>Ader, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+term+Candida+albicans+colonization+reduces+Pseudomonas+aeruginosa+load+and+lung+injury+in+a+mouse+model.">Short term Candida albicans colonization reduces Pseudomonas aeruginosa load and lung injury in a mouse model.</a> Crit. care. , 1-33 (2009).</li><li>Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-drop+anesthesia+for+small+laboratory+animals.">Open-drop anesthesia for small laboratory animals.</a> Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).</li><li>Stover, C. K., Pham, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1,+an+opportunistic+pathogen.">Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen.</a> Nature. 406 (6799), 959-964 (2000).</li><li>Boutoille, D., Marechal, X., Pichenot, M., Chemani, C., Guery, B. P., Faure, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FITC-albumin+as+a+marker+for+assessment+of+endothelial+permeability+in+mice:+comparison+with+125I-albumin.">FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin.</a> Exp. Lung Res. 35 (4), 263-271 (2009).</li><li>Faure, E., Mear, J. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+type-3+secretion+system+dampens+host+defense+by+exploiting+the+NLRC4-coupled+inflammasome.">Pseudomonas aeruginosa type-3 secretion system dampens host defense by exploiting the NLRC4-coupled inflammasome.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (7), 799-811 (2014).</li><li>Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medically+important+bacterial-fungal+interactions.">Medically important bacterial-fungal interactions.</a> Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

מודלים של בעלי חיים, במיוחד יונקים, שימושיים להבהיר מנגנונים מורכבים של אינטראקציה מארח הפתוגן בתחומי חסינות. כמובן, את הצורך במידע זמין רק ממודלים של בעלי החיים חייבים להיות חיוני; אחרת, שימוש בבעלי החיים חייב להיות מוחלף על ידי מודלים במבחנה. מודל חיה זה ממחיש ?...

<html> מודלים של בעלי חיים, בעיקר עכברים, נעשו שימוש נרחב כדי לחקור את תגובה חיסונית נגד פתוגנים. למרות חסינות מולדת ונרכשת שונה בין מכרסמים ובני האדם 7, הקלות בגידול והפיתוח של knockouts לגנים רבים, להפוך עכברי מודל מצוין ללמוד תגובות חיסוני 8. התגובה החיסונית היא מורכבת ותוצאות מהאינטראקציה של הפתוגן, (תאי האפיתל, תאי האנדותל) צמחיית תושב חיידקים וכמה (לימפוציטים, נויטרופילים, מקרופאגים) חיסוניים ואינם חסינים סוגים סלולריים 2. במבחנה אינה מאפשרות התבוננות אינטראקציות המורכבות אלה ומתמקדים בעיקר באינטראקציות התא-פתוגן ייחודיים. בעוד מודלים של בעלי חיים יש להשתמש בזהירות ובמוגבלת לשאלות מאוד ספציפיות ורלוונטיות, מודלים עכבר מספקים תובנה טובה לתגובה החיסונית יונק in vivo ויכולים להתייחס לחלקים של שאלות קליניות חשובות 7. &quot;Jove_content&quot;&gt; בדרכי הנשימה, קהילת החיידקים היא מורכבת שיוך מספר גדול של מיקרואורגניזמים שונים 6. בעוד מה שמהווה Microbiome &quot;נורמלי&quot; בדרכי נשימה עדיין לא נקבע, קהילות תושב לעתים קרובות polymicrobial, ומקורן ממקורות אקולוגיים מגוונים. חולים עם מחלת ריאות כרונית מוגלתית (סיסטיק פיברוזיס, bronchectasis) או חולי מאוורר מכאני התערוכה צמחייה מסוימת בשל התישבות של דרכי הנשימה על ידי מיקרואורגניזמים לסביבה שנרכשו-9. אלביקנס Pseudomonas aeruginosa וקנדידה שניהם הבעיה פתוגנים 5, לעתים קרובות מבודדת יחד מדגימות tracheobronchial , ואחראי לזיהום אופורטוניסטי חמור בחולים אלה, במיוחד ביחידה לטיפול הנמרצת (ICU) 4. בידוד של מיקרואורגניזמים אלה בדלקת ריאות חריפות בתוצאות טיפול נמרץ בטיפול אנטי-מיקרוביאלי נגד פ aeruginosa בשמרי ut בדרך כלל לא נחשבים פתוגניים באתר זה 5. במבחנה אינטראקציות בין פ aeruginosa וג אלביקנס כבר דווח בהרחבה, והראה כי מיקרואורגניזמים אלה יכולים להשפיע על הצמיחה וההישרדות של אחד את השני, אבל מחקרים לא הצליחו להסיק אם נוכחותם של ג אלביקנס הוא מזיק או מועיל למארח 10. מודלים העכבר פותחו כדי לטפל בזה רלוונטי של פ aeruginosa וג אלביקנס in vivo, אבל האינטראקציה בין מיקרואורגניזמים לא הייתה נקודת המפתח. ואכן, המודל הוקם כדי להעריך את מעורבותו של ג אלביקנס בתגובה מארח חיסוני, ותוצאה. דגם קודם שנקבע על ידי רו et al כבר השתמש התישבות ראשונית עם ג אלביקנס אחרי דלקת ריאות חריפה הנגרמת על ידי פ &#39; aeruginosa. שימוש במודל שלהם, החוקרים מצאו תפקיד מזיק של prior ג אלביקנס קולוניזציה 11. עם זאת רו et al משמש עומס גבוה של ג אלביקנס במודל שלהם עם 2 x 10 6 CFU / עכבר במהלך 3 ימים רצופים. הקמנו מודל 4 ימים של ג קולוניזציה בדרכי הנשימה אלביקנס, או בהתמדה לפחות ללא פגיעת ריאות, במודל זה ג אלביקנס אוחזר עד 4 ימים לאחר החדרה יחידה של 10 5 CFU לכל עכבר (איור 2) 12,13. לאחר 4 ימים, אין עדות לגיוס דלקתי תא, ייצור ציטוקינים דלקתי ולא נזק אפיתל נצפתה. ב24 - 48 שעות, בנוכחות השיא של ג אלביקנס, למרות שתגובה חיסונית מולדת סלולרית וציטוקינים נצפתה, לא היה עדות לפגיעת ריאות. באופן מפתיע, עכברים וכך יישבו עם ג אלביקנס 48 שעות לפני intranasal החדרה של פ aeruginosa שנחלש זיהום בהשוואה לעכברים עם פ זיהום aeruginosa לבד. אניndeed, עכברים הציגו פציעת ריאות פחותה וירידה בניטל חיידקי 12,13. כמה השערות יכולות להסביר השפעה חיובית זו של התישבות מוקדמת עם ג אלביקנס על פ aeruginosa בתיווך דלקת ריאות חריפה. ראשון, שיחה בין-interspecies מעורב כל מיקרואורגניזמים מערכות חישת מניין, פ מבוסס homoserinelactone מערכת aeruginosa וג מבוסס פרנסול מערכת אלביקנס, הוערכה. שנית, ג אלביקנס פועל כמטרה &quot;דמה&quot; לפ aeruginosa הסטת הפתוגן מתאי האפיתל ריאות נחקר. שני ההשערות ביטלו (נתונים שלא פורסמו). ההשערה השלישית הייתה של &quot;תחול&quot; של מערכת החיסון המולדת על ידי ג אלביקנס האחראי לתגובה מולדת הבאה משופרת נגד פ aeruginosa. ההשערה האחרונה זו אושרה. אכן ג קולוניזציה אלביקנס הובילה ליחול חסינות מולדת throuGH IL-22, בעיקר מופרש על ידי תאי הלימפה מולדים, וכתוצאה מכך אישור חיידקים גדל ומופחת פגיעת ריאות 12. לסיכום, המארח הוא שחקן מרכזי ביחסי הגומלין בין מיקרואורגניזמים ויסות התגובה חיסונית המולדת ומעורבים סוגי תאים דלקתיים שונים. בעוד שניתן גזור אינטראקציות חיסוני המורכבות אלה במבחנה ניתן לספק השערות הראשוניות רק על ידי מתאים בדגמי vivo. הפרוטוקול הבא מספק דוגמא למחקר vivo של אינטראקציה הפתוגן בתיווך מארח שעשוי להיות מותאם למייקרו-אורגניזמים אחרים.

<table><tbody><tr><td>Sevorane, Sevoflurane</td><td>Abott</td><td>05458-02</td><td>250 ml plastic bottle</td></tr><tr><td>Fluorescence Reader Mithras&amp;nbsp; LB940</td><td>Berthold Technologies</td><td>reference in first column</td><td>no comment</td></tr><tr><td>Bromo-cresol purple agar</td><td>Biomerieux</td><td>43021</td><td>20x per unit</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodique 5.47%</td><td>CEVA</td><td>6742145</td><td>100 ml plastic bottle</td></tr><tr><td>2-headed valve&amp;nbsp;</td><td>Distrimed</td><td>92831</td><td>no comment</td></tr><tr><td>Sterile inoculation loop 10 &amp;micro;l</td><td>Dutscher</td><td>10175</td><td>x1,000 conditioning</td></tr><tr><td>Insuline syringes 1 ml</td><td>Dutscher</td><td>30003</td><td>per 100 conditioning</td></tr><tr><td>2 positions Culture tube 8 ml</td><td>Dutscher</td><td>64300</td><td>no comment</td></tr><tr><td>Ultrospec 10&amp;nbsp;</td><td>General Electric life sciences</td><td>80-2116-30</td><td>no comment</td></tr><tr><td>Hemolysis tubes 13 x 75 mm&amp;nbsp;</td><td>Gosselin</td><td>W1773X</td><td>per 100</td></tr><tr><td>PBS - Phosphate-Buffered Saline</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td>packaged in 500 ml</td></tr><tr><td>amikacin 1 g</td><td>Mylan</td><td>62516778</td><td>per 10&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Heparin 10,000 UI in 2 ml</td><td>Pan pharma</td><td>9128701</td><td>10x per unit</td></tr><tr><td>RAL 555 coloration kit</td><td>RAL Diagnostics</td><td>361550</td><td>3 flacons of 100 mL</td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tube</td><td>Sarstedt</td><td>55.526.006</td><td>x 1000</td></tr><tr><td>Transparent 300 &amp;micro;l 96-well plate</td><td>Sarstedt</td><td>82 1581500</td><td>no comment</td></tr><tr><td>Yest-peptone-Dextrose Broth</td><td>Sigma</td><td>95763</td><td>in powder</td></tr><tr><td>FITC-albumin</td><td>Sigma</td><td>A9771</td><td>in powder</td></tr><tr><td>Luria Bertani Broth</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>in powder</td></tr><tr><td>25-gauge needle</td><td>Terumo or unisharp</td><td>A231</td><td>x 100 conditioning</td></tr><tr><td>Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>no comment</td></tr></tbody></table>

studying microbial communities in vivo: a model of host-mediated interaction between candida albicans and pseudomonas aeruginosa in the airways

לימוד אינטראקציה מארח הפתוגן מאפשר לנו להבין את המנגנון הבסיסי של פתוגניות במהלך זיהום חיידקים. הפרוגנוזה של המארח תלוי במעורבות של תגובה חיסונית מותאמת נגד הפתוגן 1. תגובה חיסונית היא מורכבת ותוצאות מהאינטראקציה של פתוגנים וכמה סוגים חיסוניים תאיים או אי-חיסון 2. מחקרים במבחנה לא יכולים לאפיין אינטראקציות אלה ולהתמקד באינטראקציות תא-הפתוגן. יתר על כן, בדרך הנשימה 3, במיוחד בחולים עם מחלת ריאות כרונית מוגלתית או בחולי מאוורר מכאני, קהילות polymicrobial נמצאים ולסבך אינטראקציה מארח הפתוגן. אלביקנס Pseudomonas aeruginosa וקנדידה שניהם הבעיה פתוגנים 4, לעתים קרובות מבודדת מדגימות tracheobronchial, ו קשורים לזיהומים חמורים, במיוחד ביחידה לטיפול נמרץ 5. יש אינטראקציות חיידקיםדווח בין פתוגנים אלה במבחנה, אך ההשפעה הקלינית של אינטראקציות אלה נותרה 6 לא ברורים. כדי לחקור את יחסי הגומלין בין C. אלביקנס ופ aeruginosa, מודל עכברי של ג קולוניזציה אלביקנס דרכי הנשימה, ואחריו פ דלקת ריאות חריפה בתיווך aeruginosa- בוצעה.

כפי שניתן לראות בעבר בתיאור הפרוטוקול, הניסוי צריך 5 ימים כדי להשלים (איור 1: ציר זמן ניסוי). מפעיל אחד שידל במשך כל הריצה של הניסוי ויכול להתמודד עם התהליכים עד למקסימום של 10 עכברים. אם יותר בעלי חיים נדרשים, שני אנשים נדרשים במיוחד עבור אוסף מדגם כירורגית. ואכ?...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways at JoVE.com

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

לומד קהילות חיידקים<em&gt; In vivo</em&gt;: דגם של אינטראקציה בתיווך בין מארח<em&gt; קנדידה אלביקנס</em&gt; ו<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; באיירווייס

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

studying-microbial-communities-vivo-model-host-mediated-interaction

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

8.5K Views.  Université Lille. While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Video: Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-מודלים של תרבות Pseudomonas aeruginosa Biofilms גדל על תאים חיים Airway האדם

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

כרוני לטווח ארוך<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; זיהום דרכי הנשימה בעכברים

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their intercommunication, are paramount for the protection against infections. The interactions of epithelial and innate immune cells with a pathogen are best investigated in vivo, where complex behavior unfolds over time and space. However, existing models do not allow for easy spatio-temporal imaging of the battle with pathogens at the mucosal level.
The model developed here creates a mucosal infection by direct injection of the fungal pathogen, Candida albicans, into the swimbladder of juvenile zebrafish. The resulting infection enables high-resolution imaging of epithelial and innate immune cell behavior throughout the development of mucosal disease. The versatility of this method allows for interrogation of the host to probe the detailed sequence of immune events leading to phagocyte recruitment and to examine the roles of particular cell types and molecular pathways in protection. In addition, the behavior of the pathogen as a function of immune attack can be imaged simultaneously by using fluorescent protein-expressing C. albicans. Increased spatial resolution of the host-pathogen interaction is also possible using the described rapid swimbladder dissection technique.
The mucosal infection model described here is straightforward and highly reproducible, making it a valuable tool for the study of mucosal candidiasis. This system may also be broadly translatable to other mucosal pathogens such as mycobacterial, bacterial or viral microbes that normally infect through epithelial surfaces.

In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

דוגמנות רירית פטרת בזחל דג הזברה על ידי הזרקת Swimbladder

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of bacteria in lung models can re-adapt epithelial arrangement, while immune cells coordinate an inflammatory response against the bacteria in the microenvironment. While in vivo models have been the choice for testing new anti-infectives in the context of cystic fibrosis, they still do not accurately mimic the in vivo conditions of such diseases in humans and the treatment outcomes. Complex in vitro models of the infected airways based on human cells (bronchial epithelial and macrophages) and relevant pathogens could bridge this gap and facilitate the translation of new anti-infectives into the clinic. For such purposes, a co-culture model of the human cystic fibrosis bronchial epithelial cell line CFBE41o- and THP-1 monocyte-derived macrophages has been established, mimicking an infection of the human bronchial mucosa by P. aeruginosa at air-liquid interface (ALI) conditions. This model is set up in seven days, and the following parameters are simultaneously assessed: epithelial barrier integrity, macrophage transmigration, bacterial survival, and inflammation. The present protocol describes a robust and reproducible system for evaluating drug efficacy and host responses that could be relevant for discovering new anti-infectives and optimizing their aerosol delivery to the lungs.

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We describe a protocol for a three-dimensional co-culture model of infected airways, using CFBE41o- cells, THP-1 macrophages, and Pseudomonas aeruginosa, established at the air-liquid interface. This model provides a new platform to simultaneously test antibiotic efficacy, epithelial barrier function, and inflammatory markers.

פ. ארוגינוזה נגוע 3D שיתוף תרבות של תאים אפיתל הסיפונות מקרופאגים בממשק אוויר נוזלי להערכה פרה-סרטנית של אנטי זיהומים

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic infection. The development of chronic P. aeruginosa infections is associated with a decline in lung function and increased morbidity. Therefore, there is a great interest in elucidating the reasons for the failure to eradicate P. aeruginosa with antibiotic therapy which occurs in approximately 10-40% of pediatric patients. One of many factors that can affect host clearance of P. aeruginosa and antibiotic susceptibility is variations in spatial organization (such as aggregation or biofilm formation) and polysaccharide production. Therefore, we were interested in visualizing the in situ characteristics of P. aeruginosa within the sputum of CF patients. A tissue clearing technique was applied to sputum samples after embedding the samples into a hydrogel matrix to retain the 3D structures relative to host cells. After tissue clearing, fluorescent labels and dyes were added to allow visualization. Fluorescence in situ hybridization was performed for the visualization of bacterial cells, binding of fluorescently labeled anti-Psl-antibodies for the visualization of the exopolysaccharide and DAPI staining to stain host cells to obtain structural insight. These methods allowed for the high-resolution imaging of P. aeruginosa within the sputum of CF patients via confocal laser scanning microscopy.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

This protocol provides methods for visualization of bacterial cells and polysaccharide synthesis locus (Psl) polysaccharide within the sputum of cystic fibrosis patients.

הדמיה של Pseudomonas aeruginosa בתוך כיח של חולי סיסטיק פיברוזיס

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a large proportion of the infecting bacteria form biofilms within airway sputum. Pa biofilms isolated from CF sputum have been shown to grow in small, dense aggregates of ~10-1,000 cells that are spatially organized and exhibit clinically relevant phenotypes such as antimicrobial tolerance. One of the biggest challenges to studying how Pa aggregates respond to the changing sputum environment is the lack of nutritionally relevant and robust systems that promote aggregate formation. Using a synthetic CF sputum medium (SCFM2), the life history of Pa aggregates can be observed using confocal laser scanning microscopy (CLSM) and image analysis at the resolution of a single cell. This in vitro system allows the observation of thousands of aggregates of varying size in real time, three dimensions, and at the micron scale. At the individual and population levels, having the ability to group aggregates by phenotype and position facilitates the observation of aggregates at different developmental stages and their response to changes in the microenvironment, such as antibiotic treatment, to be differentiated with precision.

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Synthetic cystic fibrosis sputum medium (SCFM2) can be utilized in combination with both confocal laser scanning microscopy and fluorescence-activated cell sorting to observe bacterial aggregates at high resolution. This paper details methods to assess aggregate populations during antimicrobial treatment as a platform for future studies.

כלים להערכה בזמן אמת של מודל זיהום פסאודומונס ארוגינוזה

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...

הקמת מודל עכברי לזיהום הקשור לצנתר קנדידה אלביקנס

A Catheter-Related Candida albicans Infection Model in Mouse

Catheter-related infection (CRI) is a common nosocomial infection caused by candida albicans during catheter implantation. Typically, biofilms are formed on the outer surface of the catheter and lead to disseminated infections, which are fatal to patients. There are no effective prevention and treatment management in clinics. Therefore, it is urgent to establish an animal model of CRI for the preclinical screening of new strategies for its prevention and treatment. In this study, a polyethylene catheter, a widely used medical catheter, was inserted into the back of the BALB/c mice after hair removal. Candida albicans ATCC MYA-2876 (SC5314) expressing enhanced green fluorescent protein was subsequently inoculated on the skin's surface along the catheter. Intense fluorescence was observed on the surface of the catheter under a fluorescent microscope 3 days later. Mature and thick biofilms were found on the surface of the catheter via scanning electron microscopy. These results indicated the adhesion, colonization, and biofilm formation of candida albicans on the surface of the catheter. The hyperplasia of the epidermis and the infiltration of inflammatory cells in the skin specimens indicated the histopathological changes of the CRI-associated skin. To sum up, a mouse CRI model was successfully established. This model is expected to be helpful in the research and development of therapeutic management for candida albicans associated CRI.

מחבר זרקור: שיפור זיהוי קנדידה אלביקנס בזיהומי קטטר באמצעות תיוג חלבון פלואורסצנטי 

We establish a mouse model of C.albicans-associated catheter-related infection (CRI), in which biofilm forms on the catheter, and the interaction between C.albicans and host correlates well with the clinical CRI. This model helps screen therapies for C.albicans biofilm-associated CRI, laying a foundation for clinical transformation.

מודל זיהום קנדידה אלביקנס הקשור לצנתר בעכבר

Catheter-related infection (CRI) is a common nosocomial infection caused by candida albicans during catheter implantation. Typically, biofilms are formed ...

לומד קהילות חיידקים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Co-מודלים של תרבות Pseudomonas aeruginosa Biofilms גדל על תאים חיים Airway האדם

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד

כרוני לטווח ארוך

דוגמנות רירית פטרת בזחל דג הזברה על ידי הזרקת Swimbladder

פ. ארוגינוזה נגוע 3D שיתוף תרבות של תאים אפיתל הסיפונות מקרופאגים בממשק אוויר נוזלי להערכה פרה-סרטנית של אנטי זיהומים

הדמיה של Pseudomonas aeruginosa בתוך כיח של חולי סיסטיק פיברוזיס

כלים להערכה בזמן אמת של מודל זיהום פסאודומונס ארוגינוזה

מודל זיהום קנדידה אלביקנס הקשור לצנתר בעכבר

מודל זיהום קנדידה אלביקנס הקשור לצנתר בעכבר

מודל זיהום קנדידה אלביקנס הקשור לצנתר בעכבר