הפרוטוקול שלנו מספק לנו דרך לחקור חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה בסביבה תזונתית ופיזית הדומה לאופן שבו הם ככל הנראה קיימים ב- vivo. אחד היתרונות הגדולים ביותר של טכניקה זו הוא היכולת ללכוד תמונות ברזולוציה גבוהה ונתונים פנוטיפיים של חיידקים בגדלים אוכלוסיה רלוונטיים לזיהום. זה אגרגטים של בערך 10 עד 1,000 תאים.
מדגימה את ההליך תהיה אלכסה גנון, עוזרת מחקר לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, לחטא את המדיום המכיל mucin תחת אור אולטרה סגול במשך ארבע שעות. העבר את המוצין שטופלו UV לצינורות סטריליים של 1.7 מיליליטר בתנאים סטריליים ולאחסן את הצינורות במינוס 20 מעלות צלזיוס.
לאחר הכנת הבסיס המאוגר, הוסף את תמיסת המלאי של מוצין לבסיס המאגר המכיל DNA כמתואר בכתב היד של הטקסט. בערב שלפני הניסוי, לחסן חמישה מיליליטר של מרק LB עם כמה מושבות של פסאודומונס aeruginosa PAO1 pMRP91 מאנטיביוטיקה המכילה צלחת אגר LB ותרבות החיידקים לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה ב 250 סיבובים לדקה. למחרת בבוקר, לפחות שעתיים לפני תחילת הניסוי, הפעל את מיקרוסקופ סריקת הלייזר הקונפוקלי ופתח את מודול הדגירה בתוכנת ההדמיה המשויכת.
לדלל 500 microliters של התרבות בחמישה מיליליטר של מרק LB טרי ולדגירה ההשעיה החיידקית ב 37 מעלות צלזיוס ו 250 סיבובים לדקה במשך 60 עד 90 דקות. כאשר החיידקים נכנסו לשלב היומן, גלולה את תאי החיידקים על ידי צנטריפוגה לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS מעוקר מסנן. לאחר הכביסה האחרונה, respend הכדור במיליליטר אחד של PBS.
למדוד את הספיגה של השעיית התא החיידקי ב 600 ננומטר כדי לקבוע את נפח התרבות הנדרש לצפיפות אופטית של 0.05 בחמישה מיליליטר של סיסטיק פיברוזיס סינטי ליחה בינונית שתיים. לחסן את הנפח המחושב של השעיית תאי חיידקים במדיום ובמערבולת בעדינות לפני הוספת מיליליטר אחד של תאים לכל תא של צלחת תרבית אופטית בעלת ארבעה תאים, ואז לדגור על החיידקים במשך ארבע שעות בתנאים סטטיים ב 37 מעלות צלזיוס. כדי לדמיין את פסאודומונס aeruginosa אגרגטים על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal, בסוף הדגירה, לייעד שלוש בארות של צלחת התרבות כטיפול אנטיביוטי משכפל אחד גם את בקרת ללא טיפול ומניחים את הצלחת על הבמה המחוממת במיקרוסקופ.
בחר יעד טבילת שמן פי 63 ופתח את לשונית האיתור כדי לזהות את אגרגטים החיידקים בשדה הבהיר. הגדר אזור להדמיה בתוך כל באר והשתמש במודול המיקום כדי לאחסן את מיקום האזור. הגדר את אורך גל העירור ל 488 ננומטר ואת אורך גל הפליטה ל 509 ננומטר.
במודול הרכישה, בחר באפשרות Z-stack כדי לרכוש את התמונות ולהשתמש במודול ממוצע הקו כדי להפחית את פלואורסצנטיות הרקע בערוץ GFP בתוך אמצעי האחסון הכולל של תמונות Z-stack. הגדר את אפשרות סידרת הזמן כדי ללכוד 60 פרוסות בכל באר במרווחים של 15 דקות למשך 18 שעות והשתמש באסטרטגיית המיקוד המובהקה כדי לאחסן מישור מוקד לכל מיקום שיצולם מחדש בכל נקודת זמן לאורך הניסוי. 4-1/2 שעות לאחר הגדרת ניסוי ההדמיה, תמונה כל עמדה כדי לקבוע את הביומסה המצטברת בתוך כל אחת מארבע הבארות לפני הוספת האנטיביוטיקה.
לאחר שש שעות, הוסיפו בעדינות אנטיביוטיקה פעמיים מתחת לריכוז המעכב המינימלי לאמצע כל באר פשוט לפוצץ את ממשק נוזל האוויר ולחץ על התחל הניסוי כדי להתחיל את הדמיית הטיפול לאחר אנטיביוטיקה. כדי לבודד את התאים החיים, בסוף תקופת ההדמיה של 18 שעות, לתייג את החיידקים בכל באר עם הנפח המתאים של יוד propidium על פי המלצות היצרן. בסוף הדגירה, השתמש במיכל מבודד כדי להעביר את הצלחת לציטומטר הזרימה ולהגדיר את cytometer כדי לזהות GFP ו propidium יודיד באמצעות זרבובית 70 מיקרון, ולאחר מכן להפעיל aliquots מיליליטר אחד של כל תרבות supernatant בקצב הזרימה הנמוך ביותר כדי למיין את GFP-חיובי ולא קיימא פרופידיום יודי שלילי פסאודומונס aeruginosa אגרגטים.
כדי לכמת את הדינמיקה המצטברת, טען את התמונות לתוכנת ניתוח תמונה מתאימה וצור היסטוגרמה של הספירות המיוצרות עבור התרבויות שליטה לא מטופלת ואנטיביוטיקה בערוץ GFP כדי לאפשר כימות של פלואורסצנטיות הרקע. כדי להבטיח ש-voxels GFP שזוהה יתאמו לביומסה החיידקית, הגדר ווקסל חיובי GFP כגדול או שווה לערך ספירת הרקע של GFP. הפיקו את משטחי ISO עבור כל הווקסלים הנותרים וזיהו צבירים בודדים, אפשרו את האפשרות 'אובייקטים מפוצלים' והגדירו את הצבירה כאובייקטים.
השתמש במודול התצפית כדי לחשב את אמצעי האחסון XYZ ואת הסכום של voxels GFP עבור כל אובייקט בודד. יצא נתונים אלה לפלטפורמה סטטיסטית חיצונית. סנן את הנתונים המיוצאים לפי גודל כדי להגדיר אובייקטים עם אמצעי אחסון הגדולים או שווים לחמישה מיקרומטרים מעוקבים.
הסר אובייקטים שפחות מ- 0.5 מיקרומטר מעוקב והשתמש במודול התצפית כדי לחשב את המרחק של כל אובייקט ביחס לאובייקטים אחרים בתוך כל תמונה. לחלופין, ניתן לחשב את המרחק באמצעות הנוסחה, ולאחר מכן להשתמש בחישובי הסכום והממוצע כדי לקבוע את סך הביומסה בנפח הצבירה הממוצע. למרות שצטברויות חיידקיות רבות נשארות לאחר ארבע שעות של יישום אנטיביוטי, הביומסה הכוללת של האוכלוסיות המצרפיות בתוך התרבויות המטופלות באנטיביוטיקה מופחתת באופן משמעותי בהשוואה לזה של תרביות לא מטופלות.
מיקרוסקופיה סדרת זמן יכול לשמש כדי לקבוע את הדפוסים המרחביים בין רגיש propidium יודיד חיובי וסביל GFP חיובי אגרגטים לאחר טיפול אנטיביוטי. על ידי חישוב האופן שבו אגרגטים בגדלים שונים תורמים לאוכלוסייה הכללית, ניתן לזהות דפוסים של האופן שבו אגרגטים מגיבים לטיפול אנטיביוטי ביחס לגודלם, צורתם ומיקומה. לאחר טיפול אנטיביוטי, אגרגטים קיימא ולא קיימא ניתן להפריד בהצלחה על פי ביטוי האות הפלואורסצנטי שלהם.
אנו מקווים שפרוטוקול זה יעורר השראה לחוקרים אחרים לחקור את האורגניזם המועדף עליהם ברזולוציה דומה. המטרה שלנו היא למצוא חוטים ביולוגיים נפוצים בקהילות מורכבות אלה ללא קשר לאתר ההדבקה.
