מחקר במעבדתו של Bragonzi כבר מומן על ידי הקרן האיטלקית סיסטיק פיברוזיס (CFaCore) והאיחוד האירופי-F7-2009-223,670. חלק מהעבודה זו בוצע באביק, מעבדת מיקרוסקופיה מתקדמת, וhistopathology העכבר בוצע ביחידת הפתולוגי האנטומיה (מכון המדעי סאן רפאלה).

1. חיידקים מתכוננים לזיהום כרוני (שלושה ויומיים לפני מאוס אתגר) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את פ המתאים זן aeruginosa להיבדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן loopful של פ aeruginosa מ-80 ° C תרבות המניה לצלחת Trypticase סויה אגר (TSA) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק מושבה אחת ולחסן לתוך 5 מיליליטר Trypticase סויה מרק (TSB) בצינור הכתיר הצמד 15 מיליליטר ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך לילה בחממה רועדת בסל&quot;ד 200. </li></ol> 2. הטבעת חיידקים בחרוזים אגר לזיהום כרוני (יום אחד לפני הזיהום) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot קטן של תרבות לילה חיידקים, לדלל 1:50 בופר פוספט (PBS) ולמדוד את הצפיפות האופטית (OD) ב600 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את תרבות חיידקים בלילה על ידי הוספת 2 OD בצינור הכתיר הצמד חדש המכיל 20 מיליליטר של TSB הטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך כ - 34 שעות כדי להיכנס שלב בחממה רועדת בסל&quot;ד 200, עד סכום כולל של 10-15 OD הוא הגיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, להכין את ה-TSA, עשויה TSB עם אגר 1.5%, החיטוי ולאזן על 50 מעלות צלזיוס באמבט מים. לאזן 150 מיליליטר של שמן מינרלים כבדים preautoclaved בבקבוק Erlenmeyer על 50 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שפ aeruginosa מגיע שלב היומן, לאסוף את תאי חיידקים על ידי צנטריפוגה ב2,700 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדור החיידקים ב 1 מיליליטר של PBS סטרילי ומערבולת ביסודיות כדי resuspend את הכדור לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעיה חיידקי מערבבים 1 מיליליטר עם 9 מיליליטר של נוזל TSA מראש equilibrated ב50 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את 10 מיליליטר TSA-פ תערובת aeruginosa לנפט כבד מינרלים (prewarmed על 50 מעלות צלזיוס) ומייד מערבבת במשך 6 דקות בטמפרטורת חדר. התסיסה חייבת לייצר מערבולת גלויה בנפט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצנן את התערובת עד 4 ° C, תוך ערבוב בsp המינימוםeed ל35 דקות (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את תערובת שמן אגר חרוזים בקרח במשך 20 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את אגר חרוזים ל50 צינורות מיליליטר פלקון ו צנטריפוגות ב 2,700 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במדויק להסיר את שמן מינרלים ולשטוף עם PBS סטרילי שש פעמים, כמתואר בשלב 2.11. לאחר שלושה שוטף, ניתן pelleted חרוזים על ידי כוח משיכה במקום להשתמש בצנטריפוגות. לאחר השטיפה האחרונה, resuspend אגר חרוזים ב20-30 מיליליטר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot של חרוזים (כ 0.5 מיליליטר) וסביבה נקיה מחיידקי homogenize. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את של חרוזים הומוגני 100 μl ולדלל ב900 μl של PBS סטרילית. סדרתי לדלל 1:10 עד 10 -6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דילול צלחת סידורי על צלחות ה-TSA, כוללים מדגם חי עד 10 -6 דגירה צלחות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את קוטר חרוז באמצעות מיקרוסקופ אור הפוכה במספר תחומים. קוטר חרוז חייב להיות בין 100-200 מיקרומטר ( <strאונג&gt; איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסנו את חרוזים לילה בשעה 4 ° C. </li></ol><img alt="איור 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1.jpg" width="500px" /> איור 1. סקירה של הזיהום בהכנת חרוזים ועכבר אגר. פ תאי aeruginosa הם resuspended ב 1 מיליליטר של PBS, והוסיפו ל9 מיליליטר של ה-TSA הנוזלי (50 מעלות צלזיוס). תערובת זו מתווספת ל150 מיליליטר שמן מינרלים כבד על 50 מעלות צלזיוס בבקבוק ובחש במהירות גבוהה במשך 6 דקות בטמפרטורה בחדר. כאשר הבקבוק הוא מקורר 4 ° C עם ערבוב איטי ל35 דקות, אגר מתמצק יצירת חרוזים, וחיידקים המצויים בתערובת מוטבעים בחרוזים אגר. פירוט של חרוז אגר המכיל תאים חיידקיים מוצג (א &#39;). לאחר הסרת שמן מינרלים עם כמה שטיפות באמצעות PBS סטרילי, ההשעיה אגר חרוזים מוכנה fאו חיסון לריאות של עכברים על ידי הזרקת intratracheal (ב &#39;). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> 3. עכברי אתגר עם אגר-חרוזים הצהרת אתיקה: פרוטוקול וניסוי זה פעלו בהתאם להנחיות מוועדת הטיפול בבעלי החיים ואתיקה של המכון המדעי סאן רפאלה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר יחידות המושבה להרכיב (CFU) על צלחות TSA כדי לקבוע את מספר CFU / מיליליטר בהשעיה אגר חרוזים. לדלל את אגר חרוזים עם PBS סטרילי ל2-4 x 10 7 CFU / מיליליטר כדי להגיע לבידוד אופטימלי של 1-2 x 10 6 ב50 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי C57Bl/6NCr (ז 20-22, 6-8 שבועות) עכברי זכרים עם קטמין (50 מ&quot;ג / מיליליטר) ו xylazine (5 מ&quot;ג / מיליליטר) ב0.9% NaCl מנוהל בהיקף של 0.002 מיליליטר / גרם משקל גוף על ידי זריקת intraperitoneal. הערה: הרדמה נחשב adequate כאשר החיה נשארת עדיין בשקט, אינו מגיב לגירויים חיצוניים, ויש לו לב ונשימת שיעורים קבועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר במצב שכיבה. לחטא את המעיל של העכבר עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את קנה הנשימה על ידי חתך אנכי של העור וצנרר קנה הנשימה עם קטטר סטרילי, גמיש 22 G 0.9 מ&quot;מ x 25 IV מ&quot;מ, שמירה על תשומת לב כדי להסיר את stylette תוך כדי התנועה לתוך קנה הנשימה. הכנס את הקטטר לא עמוק מדי לתוך קנה הנשימה. עצור לפני שהגיע לקארינה (הסתעפות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לקחת נפח של 50 μl של השעיה חרוז אגר על ידי מזרק 1 מ&quot;ל ולצרף אותו לקטטר. דחף בעדינות את הבוכנה של המזרק, המאפשר את חרוזים שמושתלים לתוך הריאות. סגירת החתך באמצעות קליפים תפר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה על כרית חימום עד ער לחלוטין. </li></ol> 4. הערכת עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו לב לעכברים יומיים לסימנים קליניים כוללים באיכות מעיל, יציבה,ניידות, ומצב הידרציה. לפקח על משקל גוף ביום. עכברים שמאבדים ≥ 20% במשקל גוף חייבים להיות מורדמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב נקודה 5 לאוסף של נוזל שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL) ונקודות 6 או 7 לאוסף של ריאות והניתוח של CFU סך הכל, ניתוח היסטולוגית, תגובה דלקתית במונחים של ספירת תאים מוחלטת והפרש בBAL, ניתוח ציטוקינים, ו myeloperoxidase פעילות (MPO). </li></ol> 5. אוסף נוזל BAL וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים על ידי CO 2 שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר במצב שכיבה. לחטא את המעיל של העכבר עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את קנה הנשימה ואת כלוב בית החזה על ידי חתך אנכי של העור. לחשוף את הריאות על ידי קיצוץ הסרעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס חוט תפר מתחת לקנה הנשימה באמצעות פינצטה וצנרר קנה הנשימה עם קטטר סטרילי, גמיש 22 גרם 0.9 מ&quot;מ x 25 מ&quot;מ IV. משוך את שני קצוות של חוט התפירה כדי לאגד את catheter לקנה הנשימה ולקשור החוט סביב קנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הנפח של 1 מיליליטר של RPMI 1640 באמצעות מזרק 1 מ&quot;ל ולצרף אותו לקטטר. לדחוף את הבוכנה של המזרק כדי לשטוף את הריאות ומייד לשחזר את הנוזל, לאחסן אותו בצינור 15 מיליליטר. שים לב: אם ציטוקינים הם להיות מנותחים, להוסיף מעכבי פרוטאז לRPMI 1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה זו שלוש פעמים עם סכום כולל של 3 מיליליטר של RPMI. מעתה והלאה, לאחסן את נוזל BAL על קרח. עבור לשלב 6 לאיסוף והניתוח של ריאות. הערה: אנא שים לב כי לא כל הנוזל להאסף (2.8 מרבי מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכימות של חיידקים נמצאים בנוזל BAL, לטעום aliquot קטן (300 μl), סדרנו לדלל 1:10 ב PBS סטרילי, צלחת על צלחות TSA ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים הכולל שימוש במיקרוסקופ אופטי אור הפוך דילול aliquot של 1:02 נוזל BAL עם פתרון Tuerk בתא ספירת תאים &#39;שודד גופות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה remaining נוזל BAL ב330 XG במשך 8 דקות ב 4 ° C. קח את supernatant לניתוח ציטוקינים ELISA, לאחסן אותו ב -80 ° C. בצע את פעולות 5.10-5.13 לספירת תאי ההפרש ידי cytospin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם גלולה היא אדומה, lyse אריתרוציטים resuspending גלולה ב 250-300 μl של חיץ תמוגה RBC מדולל 1:10 ב מים מזוקקים אולטרה טהור במשך 3 דקות. לנטרל עם 2 מיליליטר PBS ו צנטריפוגות ב 330 XG במשך 8 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend את הכדור ב 10% בסרום שור עוברי RPMI (FBS). השתמש בנפח שיספק 1 x 10 6 מיליליטר תאים /, המבוסס על סך ספירת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופיות מיקרוסקופ ומסננים לחריצים מתאימים בcytospin עם מסנני הקרטון מול מרכז cytospin. פיפטה 150 μl של כל דגימה לתוך הבארות המתאימות של cytospin ו צנטריפוגות בcytocentrifuge XG 300 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם שקופיות על ידי Romanowsky מכתים באמצעות ערכה מסחרית, על פי maההוראות של nufacturer וכפי שתואר לעיל 12. בצע את פעולות 5.14-5.17 לניתוח פעילות MPO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הנפח הנותר של BAL ב380 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C. בטל supernatant ו resuspend את הכדור ב 250 μl של כלוריד Hexadecyltrimethylammonium 0.5% במים מזוקקים אולטרה טהור לlyse התאים. ההשעיה יכולה להיות קפוא ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים לפני ביצוע assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 16,000 ל30 דקות ב 4 ° C ולהשתמש supernatant לבצע assay MPO בצלחות 96 היטב, ומוסיף את המדגם בשני עותקים לכל טוב ואם יש צורך, גם דילולים הנכונים של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לכל דגימה בבארות נפח שווה של 3,3 &#39;, 5,5&#39;-tetramethylbenzidine (TMB) כמצע לperoxidase. לאפשר התגובה לתתקיים בחושך במשך 5 דקות לפחות ועד שלא יהיה התפתחות נוספת בצבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את התגובה על ידי הוספת 2 MH 2 SO 4nd למדוד את OD ב 450 ננומטר. ערך OD יהיה ביחס ישר לפעילות peroxidase. </li></ol> 6. מדידה של עומס בקטריאלי בריאה וציטוקין ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר איסוף נוזל BAL, ריאות בלו מהעכבר, יש לשטוף אותם בPBS סטרילי, אונות נפרדות, לשים אותם בצינור מסביב לתחתית עם 2 מיליליטר של PBS סטרילי ולאחסן על קרח. שים לב: אם ציטוקינים הם להיות מנותחים, להוסיף מעכבי פרוטאז לPBS לצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסביבה נקיה מהחיידקים homogenize ריאות, לקחת aliquot קטן (300 μl) מhomogenate, סדרנו לדלל 1:10 ב-PBS, צלחת על צלחות TSA ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך לילה. שים לב שסך עומס החיידקים בדרכי האוויר יהיה הסכום של CFUs נמצא בנוזל BAL וריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה homogenate שנותר בXG 16,000 ל30 דקות ב 4 ° C. קח את supernatant לניתוח ציטוקינים ELISA, ולאחסן ב -80 ° C. </li></ol> 7. בדיקה היסטולוגית &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח היסטולוגית רק על הריאות שבנוזל BAL לא נאסף, כדי לשמר את היבט ריאות ומאפיינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר על ידי CO 2 שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את כלוב בית החזה על ידי חתך אנכי של העור, לחשוף את הריאות על ידי חיתוך הסרעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאות והבלו, לשטוף אותם ב-PBS, להפריד בין האונות, לשים אותם בצינור המכיל פורמלין 5-10 מיליליטר 10% ניטראליים שנאגרו (פורמלין 4%) ולאחסן ב 4 ° C המוגנים מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאות להטביע בפרפין, באמצעות נהלים סטנדרטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך 5 מיקרומטר חלקים עבים באמצעות microtome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות כתם עם hematoxylin ו eosin ולכסות את השקופיות עם coverslip, על פי נהלים קבועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחן את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ brightfield הפוך ולרכוש תמונות על ידי חיבור למיקרוסקופ למצלמה. </li></ol>

<ol>
	<li>Gibson, R., Burns, J. L., Ramsey, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+and+management+of+pulmonary+infections+in+cystic+fibrosis.">Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis.</a> Am. J. Respir. Crit. Care. 168, 918-951 (2003).</li><li>Bragonzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+acute+and+chronic+lung+infection+with+cystic+fibrosis+pathogens.">Murine models of acute and chronic lung infection with cystic fibrosis pathogens.</a> IJMM. 300, 584-593 (2010).</li><li>Cash, H. A., McCullough, B., Johanson, W. G., Bass, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+model+of+chronic+respiratory+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa.">A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 119, 453-459 (1979).</li><li>Starke, J. R., Langston, C., Baker, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+chronic+pulmonary+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa+and+Pseudomonas+cepacia.">A mouse model of chronic pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas cepacia.</a> Pediatr. Res. 22, 698-702 (1987).</li><li>Pedersen, S. S., Hansen, B. L., Hansen, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+experimental+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection+with+P.+aeruginosa+entrapped+in+alginate+microspheres.">Induction of experimental chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection with P. aeruginosa entrapped in alginate microspheres.</a> APMIS. 98, 203-211 (1990).</li><li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmucoid+Pseudomonas+aeruginosa+expresses+alginate+in+the+lungs+of+patients+with+cystic+fibrosis+and+in+a+mouse+model.">Nonmucoid Pseudomonas aeruginosa expresses alginate in the lungs of patients with cystic fibrosis and in a mouse model.</a> J. Infect. Dis. 192, 410-419 (2005).</li><li>van Heeckeren, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection.">Murine models of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection.</a> Lab. Anim. 36, 291-312 (2002).</li><li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+microevolution+during+cystic+fibrosis+lung+infection+establishes+clones+with+adapted+virulence+AJRCCM.">Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence AJRCCM.</a> 180, 138-145 (2009).</li><li>Kukavica-Ibrulj, I., Facchini, M., Cigana, C., Levesque, R. C., Bragonzi, A., Filloux, S., Ramos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+and+the+host+response+using+murine+models+of+acute+and+chronic+lung+infection.">Assessing Pseudomonas aeruginosa virulence and the host response using murine models of acute and chronic lung infection.</a> Methods in Pseudomonas aeruginosa: Humana Press. , (2014).</li><li>Moalli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Therapeutic+Potential+of+the+Humoral+Pattern+Recognition+Molecule+PTX3+in+Chronic+Lung+Infection+Caused+by+Pseudomonas+aeruginosa.">The Therapeutic Potential of the Humoral Pattern Recognition Molecule PTX3 in Chronic Lung Infection Caused by Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Immunol. 186, 5425-5534 .</li><li>Paroni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+CFTR-deficient+mice+to+long-term+Pseudomonas+aeruginosa+chronic+infection+and+PTX3+therapeutic+treatment.">Response of CFTR-deficient mice to long-term Pseudomonas aeruginosa chronic infection and PTX3 therapeutic treatment.</a> J. Infect. Dis. In press, .</li><li>Maxeiner, J., Karwot, R., Hausding, M., Sauer, K. A., Scholtes, P., Finotto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+enable+the+investigation+of+murine+bronchial+immune+cells,+their+cytokines+and+mediators.">A method to enable the investigation of murine bronchial immune cells, their cytokines and mediators.</a> Nat. Protoc. 2, 105-112 (2007).</li><li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+microevolution+during+cystic+fibrosis+lung+infection+establishes+clones+with+adapted+virulence..">Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence..</a> AJRCCM. In press, (2009).</li><li>Pirone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+cenocepacia+strains+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+are+apparently+more+invasive+and+more+virulent+than+rhizosphere+strains.">Burkholderia cenocepacia strains isolated from cystic fibrosis patients are apparently more invasive and more virulent than rhizosphere strains.</a> Environ. Microbiol. 10, 2773-2784 (2008).</li><li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+co-infection+of+the+cystic+fibrosis+lung+by+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cenocepacia+reveals+influences+on+biofilm+formation+and+host+response.">Modelling co-infection of the cystic fibrosis lung by Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cenocepacia reveals influences on biofilm formation and host response.</a> PLoS One. 7, .</li><li>Bianconi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+signature-tagged+mutagenesis+in+Pseudomonas+aeruginosa:+tracking+patho-adaptive+mutations+promoting+long-term+airways+chronic+infection.">Positive signature-tagged mutagenesis in Pseudomonas aeruginosa: tracking patho-adaptive mutations promoting long-term airways chronic infection.</a> PLoS Pathog.. 7, (2011).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

השלבים הקריטיים בפ הכנת aeruginosa-חרוזים ואתגר עכבר מדווחים להלן. זן פ aeruginosa משמש לאתגר עכברים הוא קריטי. תמותה, זיהום או פינוי כרוני עשוי להיות שונה באופן משמעותי בהתאם לזן החיידקים המשמש לאתגר. פ זן קליני aeruginosa...

סיסטיק פיברוזיס (CF) הוא מחלה גנטית הנגרמת על ידי מוטציות ברגולטור המוליכות הטרנסממברני סיסטיק פיברוזיס גן (CFTR). גן זה מקודד לערוץ כלוריד הביע על הממברנה של רוב תאי האפיתל. הרס bronchiectasis, סתימת הריר וparenchymal נגרמים בעיקר על ידי זיהומי Pseudomonas aeruginosa בהדרגה לגרום למחלת ריאות קשה ותמותה ברוב של חולי CF 1. פתוגנזה CF הבנה ופיתוח נוסף של טיפולים חדשניים מסתמכים על מודל חיה עם תכונות אופייניות של CF. כמה עכברים, מהונדסים גנטי לגן CFTR, כבר נוצרו, אבל מגבלות ביכולתם של מינים אלה לשחזר מחלת ריאות כמו CF וכמה חריגות איבר אחרות ראו בחולי CF תועדו 2 באופן נרחב. התפתחות הזיהום היא אחד האתגרים העיקריים במודל החיה CF. CL הספרותמוקדם מצביע על כך שזיהום כרוני שנמשך יותר מפעם אחת בחודש יכול להיות מושגת רק אם עכברים מחוסן עם חיידקים מוטבעים בסוכן משתק כגון אגר, agarose, או אלגינט אצות 3-5. סוכנים לשתק אלה מספקים את תנאי microaerobic / אנאירובי המאפשרים לחיידקים לגדול בצורה של microcolonies, בדומה לצמיחה בליחה של חולי CF 6. מודל זה של זיהום כרוני מוביל להתמדה של החיידקים לריאות וגורמות לדלקת בדרכי הנשימה ונזק 7. עם זאת, בהתאם לשיטה, זן החיידקים והמינון מחוסן לריאות, את האחוז של עכברים נגועים כרוניים ועומס החיידקים התאושש בתוך הריאות בנקודות זמן שונות יכולים להיות שונה במידה ניכרת. בפרט, האתגר העיקרי לזיהום כרוני לטווח ארוך נותר נטל החיידקים הנמוך על ידי פ &#39; aeruginosa ואחוז הנמוך של שבועות עכברים נגועים לאחר אתגר, המציין thaתאי חיידקיים לא נמחקים בהדרגה על ידי המארח. על ידי בחירת פ זן קליני aeruginosa RP73 מתוך אוסף של CF מבודד 8 השגנו הצלחת תמותה נמוכה, נגעים חמורים יותר, ואחוז הגבוה של זיהום כרוני עם מטען יציב חיידקים עד חודש בעכברי C57Bl/6NCrl. מאמר זה מפרט את המתודולוגיה להטבעת פ aeruginosa בחרוזים אגר, אנחנו נגועים בעכברים על ידי החדרת intratracheal, מדדנו את עומס החיידקים וציטוקינים בריאות, אספנו נוזל BAL וביצעו בדיקה היסטולוגית. בסך הכל, בפרוטוקול זה יסייע לחוקרים בהתמודדות עם שאלות חשובות ביסודו על 8,9 פתוגנזה ובדיקת טיפולים חדשניים נגד פ זיהום כרוני aeruginosa 10,11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="605">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Bacto Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:143px;">211823</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Difco Agar, granulated</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:143px;">214510</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Heavy mineral oil</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">330760-1L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">S-(+)-Ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">K1884</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">X1251</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:272px;">1 ml syringe 25 G 5/8&#39;&#39;&#160;0.5 x 16 mm</td>
			<td style="width:191px;">PIC</td>
			<td style="width:143px;">3071250300350</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Catheter 22GA 0.9 x 25 mm</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:143px;">381223</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Curved</td>
			<td style="width:191px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">11152-10</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Scissors, Iris, 11 cm, straight</td>
			<td style="width:191px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:143px;">501758</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Suture clips</td>
			<td style="width:191px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">12040-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Suture thread</td>
			<td style="width:191px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">18020-40</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:191px;">Lonza</td>
			<td style="width:143px;">BE12-167F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Complete protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:143px;">11836145001</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:272px;">Fast-Read 102 Burker disposable chamber</td>
			<td style="width:191px;">Biosigma</td>
			<td style="width:143px;">390497</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Tuerk solution</td>
			<td style="width:191px;">Fluka</td>
			<td style="width:143px;">93770</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">RBC lysis buffer</td>
			<td style="width:191px;">Biolegend</td>
			<td style="width:143px;">420301</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:191px;">Lonza</td>
			<td style="width:143px;">DE14-801F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">EZ cytofunnel</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;">A78710021</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Superfrost ultra plus microscope slides</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;">J3800AMNZ</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Diff-Quik Romanowsky staining set</td>
			<td style="width:191px;">Medion Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">130832</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:272px;">Hexadecyltrimethylammonium chloride</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">52366-10G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">96-well EIA/RIA plate</td>
			<td style="width:191px;">Costar</td>
			<td style="width:143px;">3590</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">3,3&#8217;,5,5&#8217;- tetramethylbenzidine</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">T8665-1L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Sulfuric acid</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">320501-1L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">10% neutral buffered formalin</td>
			<td style="width:191px;">Bio-optica</td>
			<td style="width:143px;">05-01005Q</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Harris haematoxylin non Papanicolau</td>
			<td style="width:191px;">Bio-optica</td>
			<td style="width:143px;">05-M06004</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Eosin plus alcoholic solution</td>
			<td style="width:191px;">Bio-optica</td>
			<td style="width:143px;">05-M11007</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Shaking incubator</td>
			<td style="width:191px;">Amerex Instruments</td>
			<td style="width:143px;">Steady Shake 757</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Water bath</td>
			<td style="width:191px;">Grant</td>
			<td style="width:143px;">SUB14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Homogenizer</td>
			<td style="width:191px;">Ystral</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Precision balance</td>
			<td style="width:191px;">KERN</td>
			<td style="width:143px;">440-47N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;">A78300003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Low Cost Heating Pad</td>
			<td style="width:191px;">2biol</td>
			<td style="width:143px;">LCHP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:272px;">Homogenization probe</td>
			<td rowspan="2" style="width:191px;">Ystral</td>
			<td style="width:143px;">2366931(great)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:143px;">2366925(small)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Inverted optical microscope</td>
			<td style="width:191px;">Zeiss</td>
			<td style="width:143px;">Axioplan2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Camera (microscope)</td>
			<td style="width:191px;">Zeiss</td>
			<td style="width:143px;">Axiocam MRc5</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Rotary microtome</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:143px;">RM2255</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long term chronic pseudomonas aeruginosa airway infection in mice

מודל עכבר של זיהום דרכי הנשימה הכרונית הוא נכס מרכזי בסיסטיק פיברוזיס מחקר (CF), אם כי יש מספר חששות לגבי המודל עצמו. שלבים מוקדמים של דלקת וזיהום נחקרו בהרחבה על ידי שימוש במודל העכבר אגר חרוזים Pseudomonas aeruginosa, בעוד שרק כמה דיווחים התמקדו בזיהום הכרוני לטווח הארוך בגוף חי. האתגר העיקרי לזיהום כרוני לטווח ארוך נותר נטל החיידקים הנמוך על ידי פ &#39; aeruginosa ואחוז הנמוך של שבועות עכברים נגועים לאחר אתגר, המציין כי תאי חיידקיים נמחקים בהדרגה על ידי המארח. מאמר זה מציג שיטה להשגת זיהום כרוני לטווח ארוך יעיל בעכברים. שיטה זו מבוססת על ההטבעה של פ זני aeruginosa קליניים באגרו חרוזים במבחנה, ואחריו החדרת intratracheal בעכברי C57Bl/6NCrl. דלקת ריאות דו צדדית קשורה sevקריאה פסקי מדידים eral כולל ירידה במשקל, תמותה, זיהום כרוני, ותגובה דלקתית. פ זן קליני aeruginosa RP73 הועדף על זן המעבדה התייחסות PAO1 שכן היא גרמה לתמותה נמוכה יחסית, נגעים חמורים יותר, וזיהום כרוני גבוה יותר. פ קולוניזציה aeruginosa יכולה להתמיד בריאה במשך למעלה משלושה חודשים. הפתולוגיה ריאות Murine דומה לזו של חולי CF עם מחלת ריאות כרונית מתקדמת. מודל עכברי זה מחקה באופן קרוב ביותר את מהלך המחלה האנושית ויכול לשמש הן ללימודים בפתוגנזה ולהערכת טיפולים חדשים.

כאשר הפרוטוקול הוא נעשה בצורה נכונה, פ אגר חרוזים aeruginosa ימדדו בין 100-200 מיקרומטר וניתן להבחין במיקרוסקופ אור הפוכה על ידי pipetting נפח קטן של ההשעיה אגר חרוזים בשקופית. תאי חיידקים בודדים נראים בחרוזים אגר, כפי שמוצגים בפירוט באיור 1. <p class="jove_content" style="...

Watch this Scientific Journal Video about Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice at JoVE.com

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

אנו מתארים את השיטה אגר חרוזים להקים זיהום מתמשך לטווח ארוך כרוני Pseudomonas aeruginosa בדרכי אוויר במודל העכבר.

כרוני לטווח ארוך<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; זיהום דרכי הנשימה בעכברים

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

long-term-chronic-pseudomonas-aeruginosa-airway-infection-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

22.2K Views.  San Raffaele Scientific Institute.  אנו מתארים את השיטה אגר חרוזים להקים זיהום מתמשך לטווח ארוך כרוני Pseudomonas aeruginosa בדרכי אוויר במודל העכבר. 

Video: Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-מודלים של תרבות Pseudomonas aeruginosa Biofilms גדל על תאים חיים Airway האדם

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa ו biofilm Saccharomyces cerevisiae בתוך תאים Flow

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

RNA בידוד Pseudomonas aeruginosa מיישבים את מערכת העיכול Murine

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa מושרה ריאות פגיעה דגם

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. Chronic mouse wounds models have been used to understand the underlying interactions between the microorganisms and the host. The models developed to date rely on the use of haired animals and terminal collection of wound tissue for determination of viable bacteria. While significant insight has been gained with these models, this experimental procedure requires a large number of animals and sampling is time consuming. We have developed a novel murine model that incorporates several optimal innovations to evaluate biofilm progression in chronic wounds: a) it utilizes hairless mice, eliminating the need for hair removal; b) applies pre-formed biofilms to the wounds allowing for the immediate evaluation of persistence and effect of these communities on host; c) monitors biofilm progression by quantifying light production by a genetically engineered bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa, allowing real-time monitoring of the infection thus reducing the number of animals required per study. In this model, a single full-depth wound is produced on the back of STZ-induced diabetic hairless mice and inoculated with biofilms of the P. aeruginosa bioluminescent strain Xen 41. Light output from the wounds is recorded daily in an in vivo imaging system, allowing for in vivo and in situ rapid biofilm visualization and localization of biofilm bacteria within the wounds. This novel method is flexible as it can be used to study other microorganisms, including genetically engineered species and multi-species biofilms, and may be of special value in testing anti-biofilm strategies including antimicrobial occlusive dressings.

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Here we describe a novel diabetic murine model utilizing hairless mice for real-time, non-invasive, monitoring of biofilm wound infections of bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. This method can be adapted to evaluate infection of other bacterial species and genetically modified microorganisms, including multi-species biofilms, and test the efficacy of antibiofilm strategies.

לצידו. אור: בויוו ניטור של דלקות Biofilm Pseudomonas aeruginosa לפצעים כרוניים במודל מאתר של שיער סוכרתית

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

שיטות זיהוי ציטוטוקסיות Amyloids הבאים זיהום של אנדותל תאי הריאות על ידי Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of these products are naturally produced by the organisms, other products require genetic engineering of the organism to increase the yields of production. Avirulent strains of Escherichia coli have traditionally been the preferred bacterial species for producing biopharmaceuticals; however, some products are difficult for E. coli to produce. Thus, avirulent strains of other bacterial species could provide useful alternatives for production of some commercial products. Pseudomonas aeruginosa is a common and well-studied Gram-negative bacterium that could provide a suitable alternative to E. coli. However, P. aeruginosa is an opportunistic human pathogen. Here, we detail a procedure that can be used to generate nonpathogenic strains of P. aeruginosa through sequential genomic deletions using the pEX100T-NotI plasmid. The main advantage of this method is to produce a marker-free strain. This method may be used to generate highly attenuated P. aeruginosa strains for the production of commercial products, or to design strains for other specific uses. We also describe a simple and reproducible mouse model of bacterial systemic infection via intraperitoneal injection of validated test strains to test the attenuation of the genetically engineered strain in comparison to the FDA-approved BL21 strain of E. coli.

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Here, we describe a simple and reproducible protocol of mouse model of infection to evaluate the attenuation of the genetically modified strains of Pseudomonas aeruginosa in comparison to the United States Food and Drug Administration (FDA)-approved Escherichia coli for commercial applications.

הדור של המסגרת של גן In-Frame מוטציות מחיקה ב פסאודומונס aeruginosa ובדיקת התקפה אלימה מודל עכבר פשוט של זיהום

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

תרבות של וריאציה של המושבה הקטנה של הפסאודומונס וככמת של האלגיאט

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of chronic wound infections in diabetic and hospitalized patients. There is an urgent need for chronic infection models to aid in the investigation of wound pathogenesis and the development of new therapies against this pathogen. Here, we describe a protocol that uses delayed inoculation 24 hours after full-thickness excisional wounding. The infection of the provisional wound matrix present at this time forestalls either rapid clearance or dissemination of infection and instead establishes chronic infection lasting 7&#8211;10 days without the need for implantation of foreign materials or immune suppression. This protocol mimics a typical temporal course of post-operative infection in humans. The use of a luminescent P. aeruginosa strain (PAO1:lux) allows for quantitative daily assessment of bacterial burden for P. aeruginosa wound infections. This novel model may be a useful tool in the investigation of bacterial pathogenesis and the development of new therapies for chronic P. aeruginosa wound infections.

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

We describe a delayed inoculation protocol for generating chronic wound infections in immunocompetent mice.

מדבקת החיסון נגד הידבקות כרונית בנגיף הדלקת בפצע

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...