This work was supported by grants funded by the British Heart Foundation (BHF), Dinosaur Trust, McAlpine Foundation, Fondation Leducq, Fight for Sight, the Cambridge Biomedical Research Centre, National Institute of Health Research including (i) the BHF Oxbridge Centre of Regenerative Medicine [RM/13/3/30159], (ii) the BHF Cambridge Centre of Research Excellence, (iii) Addenbrooke's Hospital, Cambridge University Hospitals NHS Foundation Trust and (iv) Papworth Hospital NHS Foundation Trust, and supported the Cambridge NIHR BRC Cell Phenotyping Hub. MLO is funded by a BHF Intermediate Fellowship. FNK is funded by a BHF PhD Studentship.

סכמטי של פרוטוקול דור BOEC מוצג באיור 1. צנטריפוגה שיפוע אוסף וצפיפות 1. דם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל תורם, להוסיף 3 מיליליטר של נתרן ציטרט לכל אחד מצינורות צנטריפוגות חרוטי שני 50 מיליליטר. לאסוף 60 מיליליטר של דם על ידי venipuncture ולהוסיף 30 מיליליטר לכל צינור. היפוך בעדינות 2-3 פעמים כדי לערבב. השתמש קטן כמו 40 מיליליטר של דם בפרוטוקול, עם כרכי ציטראט בהתאם. הערה: זה חיוני כי דגימות דם מעובדות בתוך 2 שעות של אוסף. מושהה עיבוד של תוצאות דם בירידה ניכרת בתשואת מושבה תולדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צינורות חרוטי חדשים המכילים בינוני צנטריפוגה שיפוע צפיפות על ידי היפוך הראשון הבקבוק כמה פעמים כדי לערבב. במנדף סטרילי, להוסיף 15 מיליליטר של מדיום צנטריפוגה שיפוע צפיפות לצינור חרוטי 50 מיליליטר (1 צינור לכל 10 מיליליטר של דם, 6 צינורות לתורם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל דם 1: 1 עם פוספט Dulbecco שלמלוח -Buffered (DPBS). הטה את הצינור המכיל מדיום צנטריפוגה שיפוע צפיפות לזווית של 20 מעלות עם משטח העבודה. באמצעות סיוע פיפטה וטפטף סרולוגיות 25 מיליליטר, שכבה לאט 21 מיליליטר של דם מדולל על גבי המדיום על ידי הוספת דם בהדרגה במורד הקיר של הצינור הנטוי. הערה: אם תעשה זאת תהיה למזער ערבוב של הדם עם שכבת שיפוע צפיפות ויפיק מעיל הדוק באפי, כמו גם תשואה משופרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות צנטריפוגה ב 400 XG במשך 35 דקות ב RT עם המאיץ והבלם מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופה זו צנטריפוגה, להתחיל ציפוי קולגן המפורט בצעדים 2.1-2.4. להבטיח את השלבים הבאים כבר הושלמו לפני שימשיכו לשלב 3.1. </li></ol> 2. קולגן ציפוי של T-75 בקבוק והכנה של תרבות בינונית הערה: בצע את השלבים הבאים במכסת מנוע תרבית תאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון קולגן / מיליליטר 50 מיקרוגרם ידי דילול המניות טאיpe אני קולגן 10 מיליליטר של 0.02M חומצה אצטית דוגמא:. למניית קולגן בריכוז של 4.05 מ&quot;ג / מיליליטר, להוסיף 123.5 μL של קולגן 10 מיליליטר של חומצה אצטית 0.02 M. ההשעיה קולגן סינון סטרילי לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה סרולוגיות, להוסיף 7.5 מיליליטר של תמיסת קולגן לבקבוק תרבית תאי T-75. נפח זה נותן 5 מיקרוגרם קולגן / 2 סנטימטר (או 375 מיקרוגרם / בקבוק). בקבוק מעיל עבור שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מדיום גידול האנדותל המשמש לייצור BOEC ידי השלמה בינונית בסיסי אנדותל עם תוספי גורם גדילה הניתנים על ידי היצרן. הוסף את כל התוספים, אבל לא להוסיף סרום. כדי להכין 15 מיליליטר של מדיום דור BOEC, להוסיף 2.5 מיליליטר של סרום שור עוברי מוגדר (FBS) 12.5 מיליליטר של מדיום גידול האנדותל המכיל תוספי גורם גדילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך בצעדים המפורטים בסעיף 3. לאחר תקופה ציפוי 1 שעה, לשאוב את פתרון קולגן ולשטוף את החומצה אצטית שייר ידי pipettingב 10 DPBS מיליליטר. לשאוב את DPBS וחזור על שלב זה לשטוף פעם נוספת. אם ההשעיה התא שהושגה במהלך שלב 3.3 אינה מוכנה לציפוי בשלב זה, להוסיף 5 מ&quot;ל של מדיום דור BOEC לבקבוק כדי לשמור על ציפוי קולגן מהתייבשות. </li></ol> 3. איסוף וציפוי של PBMNCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צנטריפוגה שיפוע צפיפות המתוארת בשלב 1.4, לאסוף בזהירות את שכבת מעיל באפי בעזרת פיפטה העברה פלסטיק סטרילי. אוסף של המעיל באפי אמור להניב כ 20 מיליליטר של השעיה תא ופלזמה מצינור אחד. הימנע העברה בינוני שיפוע צפיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את ההשעיה תא mononuclear 1: 1 בDPBS ולהפוך לערבב. צנטריפוגה ב RT במשך 20 דקות ב 300 XG עם בלם ודוושת גז במקסימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צנטריפוגה, לשאוב את תאי supernatant וגלולים על ידי הוספת 1 מיליליטר של מדיום דור BOEC לכל גלולה וpipetting למעלה ולמטה שוב ושוב. תא בריכת השעיותהעליון עד נפח כולל ד עד 10 מיליליטר עם המדיום שנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבל הערכה של מספר הכולל של תאים, מדגם 10 μl של השעיה תא ולדלל 50x עם 490 μl של הפתרון של טורק, שlyse תאי דם אדומים. רוזן מדגם 10 μl של ההשעיה התא המדולל באמצעות haemocytometer. הערה: 60 מ&quot;ל של דם אמור להניב כ 100-150 x 10 6 תאי דם לבנים לציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעיה צלחת כל תא לבקבוק T-75 בודד, מצופה קולגן, נפח העליון עד בינוני ל15 מ&quot;ל / בקבוק ותרבות על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified המכילה 5% CO 2. תאים מצופים בשלב זה מייצגים מעבר 0. הערה: אפשר להקפיא את PBMNCs המבודד לפני בידוד BOEC כדי לגזור את BOECs במועד מאוחר יותר או כדי להעביר את PBMNCs למעבדה שונה שבי יכול להיות שנוצרה BOECs. עם זאת, חשוב לשים לב כי PBMNCs הקפאה יכולה להפחית את היעילות של בידוד BOEC. Sסעיף 8 להלן EE לשיטה. </li></ol> תרבית תאים 4. לטווח ארוך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה בינונית כל 2 ימים על ידי הוספת 15 מיליליטר של מדיום דור BOEC הטרי (5: 1 תערובת של מדיום גידול תא האנדותל ומוגדר FBS). לסופי שבוע, יכולים להתעכב שינויים בינוניים לכל 3 ימים. הערה: מושבות תולדה אמורות להופיע בין 7 ו -14 ימים של התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג בקבוק תרבות BOEC בימים 7-14 להופעתו של מושבות תולדה. לזהות מושבות כקבוצות מעגליות של תאים מציגות מורפולוגיה מרוצפת אנדותל קלאסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שמושבה או במושבות מרובות מזוהות בבקבוק, תמשיך עם שינויים בינוניים ולאפשר מושבות לגדול לכ 1000-2000 תאים לכל מושבה לפני passaging. לקבוע את המספר הסלולרי למושבה דרך אומדן חזותי גס. הערה: כמדריך, נהוג מושבות תולדה ראשוניות מעבר שבוע לאחר זיהוי של המושבה תולדה הראשונה. </li> &lt;li&gt; תאי מעבר על ידי שטיפת צלוחיות פעמיים עם 10 מיליליטר של DPBS. הוסף 5 מיליליטר של 1X טריפסין-EDTA ודגירה בחממה 37 ° C במשך 5 דקות. לאחר 5 דקות, לנטרל טריפסין עם 10 מיליליטר של מדיום (המכיל FBS) ולהביא להשעית תאים עם pipetting חוזר ונשנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשעיה צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות, resuspend ב 15 מיליליטר של מדיום דור BOEC הטרי וצלחת ההשעיה תא כולו לT-75 בקבוק חדש (המייצג מעבר 1, P1). אין ציפוי קולגן נדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך שינויים בינוניים כמתואר לעיל עד תאים (בערך 3-5 x 10 6 תאים לכל בקבוק) ומחוברות. ברגע שמחוברות, תאי מעבר כמתואר בשלב 4.3. הערה: ממעבר 2 ואילך, תאים כבר לא דורשים בינוני דור BOEC ויכולות להיות מתורבת במדיום גידול תא האנדותל וFBS חום מומת הסטנדרטי של 10%. ציפוי קולגן יכול לשמש כצעד אופציונאלי הולך קדימה, כמו שיש ראיות לכך שהנוכחות של קולגן יכולה לשפר prolifer BOECשיעורי ני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לpassaging המשך, צלחת לא פחות מ 750,000 תאים לכל T-75 בקבוק כצפיפות תא נמוך יכולה לגרום BOECs להפסיק מתרבים. </li></ol> 5. הקפאה והפשרת תרבויות BOEC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize תאים כפי שתואר בסעיף 4.3 ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant וגלול ב 10 מיליליטר של מדיום. זה אינו דורש בינוני צמיחת תאי אנדותל; DMEM עם FBS הסטנדרטי 10% יהיה מספיק. לאסוף דגימת 10 μl של ההשעיה התא לבצע ספירת תאים ידנית באמצעות haemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה שוב וגלול ב2x10 6 תאים / מיליליטר במדיום הקפאה קר כקרח (DMEM 40% FBS עם 50% ו -10% DMSO). הוסף 0.5 מיליליטר (10 6 תאים) לכל בקבוקון, בקבוקוני מקום בכלי קרח isopropanol הקרה הקפאה ומקום במקפיא -80 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות לפני העברה לחנקן נוזלי. אל תשאירו תאים ב -80 ° C במשך יותר מ 24 שעות. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר תאים, להוסיף 10 מיליליטר של מדיום מראש חימם לצינור צנטריפוגות חרוטי 15 מיליליטר. הערה: כאשר מפשירים את המעבר 1 תאים, להפשיר למדיום גידול תא האנדותל בתוספת 20% הגדירו FBS עבור 2 הימים הראשונים לאחר הפשרה. זה מוביל לבידוד תא יציב יותר הולך קדימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאים מחנקן נוזלי והפשרה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה עד שרק גביש קרח קטן שנשאר בבקבוקון. מוסיף את תכולת בקבוקון ירידה מבחינת לצינור צנטריפוגות חרוטי וספין למטה XG ב 300 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ותא גלולה גלול בFBS + 10% 10 מיליליטר EGM-2MV. הוסף לבקבוק T-75 ועליון עד בינוני עד 15 מיליליטר. </li></ol> 6. אפיון BOECs ידי cytometry הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שמושבות BOEC המתואר בסעיף 4 כבר מותרת להרחיב, trypsinize תאים כפי שתוארו בסעיף 4.4 וגלול בריכוז של 10 6 תאים למ&quot;ל במאגר מכתים (שנינות DPBSh 2% FBS ו -2 מ&quot;מ EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב 10 5 תאים עם נוגדני fluorochrome מצומדות המכוונים נגד (כל שעת 1:20 דילול שימוש) CD45, CD14, CD34, CD31 או VEGFR2 (לדלל 01:10) (ראה טבלה 1 לפרטים מלאים). דגירה של 30 דקות ב 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם 1 מיליליטר מכתים חיץ צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant וגלול ב400 חיץ מכתים μl לניתוח. שמור את התאים ב 4 מעלות צלזיוס ומוגנות מפני אור לפני הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח cytometric על cytometer המצויד כדי לזהות את הנוגדנים מצומדות fluorescently בשימוש assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במדגם BOEC בלא כתם לזהות אוכלוסיית התא על cytometer ידי התאמה קדימה ומתחי צד פיזור, כמו גם המתחים לערוצי FITC וAPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע gating ספים באמצעות תאי אלוטיפ מוכתם לכל fluorochrome. להעריך חיובי עבור כל סמן פני תא המבוסס על presencדואר של משמרת שיא בעוצמת הקרינה לעומת שליטת אלוטיפ לfluorochrome להיות מנותח. </li></ol> 7. אפיון BOECs ידי Immunofluorescent מיקרוסקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> BOECs צלחת ב24-היטב, צלחת תרבית רקמה שטוח תחתונה ללא coverslips בצפיפות של 5 x 10 4 תאים ב500 μl של מדיום גידול תא האנדותל + 10% FBS בכל טוב ולהשאיר לדבוק ולגדול ב 37 חום מומת מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד תאים לכסות לפחות 70-80% משטח הפנים של כל טוב (confluency הערכה על ידי בדיקה ויזואלית תחת microsope אור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים בכל טוב במשך 5 דקות עם 1 מיליליטר של DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאי O / N ב 4 ° C עם 500 μl של 4% פתרון paraformaldehyde בDPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים במשך 3 x 5 דקות עם 1 מיליליטר של DPBS בכל טוב. הוספה והסרה של DPBS בעזרת פיפטה וaspirator, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize תאים עבור 3 x 10 דקות עם 0.2% polysorbate 20 בDPBS. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור שעה 1 ב RT בחסימת מאגר המכיל 10% FBS בDPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי כתם על 4 מעלות CO / N 300 μl של חיץ דילול נוגדן (0.1% אלבומין בסרום השור בDPBS) המכיל נוגדנים עיקריים המכוונים נגד CD34 (10 מיקרוגרם / מיליליטר), CD144 (1: 300) או vWF (1: 250) . ראה טבלת 1 לפרטים מלאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הנוגדנים מאוגד עיקריים במשך 5 x 10 דקות עם DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור שעה 1 ב RT עם הנוגדנים משני שכותרתו fluorescently המתאימים, כמפורט בטבלה 1 (כל יום 1: 200). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הנוגדנים משני מאוגד ל5 x 10 דקות עם DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם 1 מיקרוגרם / מיליליטר 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) בDPBS במשך 10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם DPBS לדקות 3 x 5 נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תמונה בהגדלה 100x באמצעות מיקרוסקופ הפוכה מצוידת במקור אור חיצוני לעירור הקרינה, וללכוד תמונות באמצעות לצרףמצלמה דיגיטלית אד למחובר ניתוח שלאחר מכן. </li></ol> 8. PBMNCs ההקפאה להפשרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של שלב 3.2, בעקבות צנטריפוגה, לשאוב את המדיום וידני לשבש את התא גלולה עם pipetting למעלה חזר ולמטה באמצעות קצה פיפטה P1000. הוסף 1 מיליליטר של מדיום הקפאה, סרום 90% וDMSO 10%, והקפד לערבב בעדינות כדי לייצר השעיה תא. מעבירים את ההשעיה התא לcryovial ולהקפיא ולהפשיר כאמור בסעיף 5. </li></ol>

<ol>
	<li>Yancopoulos, G. D., Klagsbrun, M., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenesis,+angiogenesis,+and+growth+factors:+ephrins+enter+the+fray+at+the+border.">Vasculogenesis, angiogenesis, and growth factors: ephrins enter the fray at the border.</a> Cell. 93, 661-664 (1998).</li><li>Flamme, I., Fr&#246;lich, T., Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+vasculogenesis+and+embryonic+angiogenesis.">Molecular mechanisms of vasculogenesis and embryonic angiogenesis.</a> J Cell Physiol. 173, 206-210 (1997).</li><li>Asahara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+putative+progenitor+endothelial+cells+for+angiogenesis.">Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.</a> Science. 275, 964-967 (1997).</li><li>Shi, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+circulating+bone+marrow-derived+endothelial+cells.">Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells.</a> Blood. 92, 362-367 (1998).</li><li>Ormiston, M. L., Deng, Y., Stewart, D. J., Courtman, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+in+the+therapeutic+actions+of+endothelial+progenitor+cells+in+pulmonary+hypertension.">Innate immunity in the therapeutic actions of endothelial progenitor cells in pulmonary hypertension.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 546-554 (2010).</li><li>Hur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+two+types+of+endothelial+progenitor+cells+and+their+different+contributions+to+neovasculogenesis.">Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 288-293 (2004).</li><li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood.">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> J Clin Invest. 105, 71-77 (2000).</li><li>Yoder, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem/progenitor+cell+principals.">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li><li>Toshner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+analysis+reveals+a+specific+HOX+signature+associated+with+positional+identity+of+human+endothelial+cells.">Transcript analysis reveals a specific HOX signature associated with positional identity of human endothelial cells.</a> PLOS ONE. 9, e91334 (2014).</li><li>Toshner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+dysfunction+of+endothelial+progenitors+in+pulmonary+arterial+hypertension.">Evidence of dysfunction of endothelial progenitors in pulmonary arterial hypertension.</a> Am J Respir Crit Care Med. 180, 780-787 (2009).</li><li>Wang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+storage+and+secretion+of+von+Willebrand+factor+in+blood+outgrowth+endothelial+cells+derived+from+patients+with+von+Willebrand+disease.">Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease.</a> Blood. 121, 2762-2772 (2013).</li><li>O'Neill, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+revascularisation+of+ischaemic+tissue:+the+opportunities+and+challenges+for+therapy+using+vascular+stem/progenitor+cells.">Therapeutic revascularisation of ischaemic tissue: the opportunities and challenges for therapy using vascular stem/progenitor cells.</a> Stem Cell Res &amp; Ther. 3, 31 (2012).</li><li>Geti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Practical+and+Efficient+Cellular+Substrate+for+the+Generation+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adults:+Blood-Derived+Endothelial+Progenitor+Cells.">A Practical and Efficient Cellular Substrate for the Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Adults: Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells.</a> Stem Cells TM. 1, 855-865 (2012).</li><li>Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+characterization+of+endothelial+colony+forming+cells+derived+from+human+umbilical+cord+blood.">Phenotypic and functional characterization of endothelial colony forming cells derived from human umbilical cord blood.</a> Journal of Vis Exp: JoVE. , (2012).</li><li>Martin-Ramirez, J., Hofman, M., van den Biggelaar, M., Hebbel, R. P., Voorberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+outgrowth+endothelial+cells+from+peripheral+blood.">Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood.</a> Nat Prot. 7, 1709-1715 (2012).</li><li>Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+large+scale+expansion+of+adult+human+endothelial+colony+forming+progenitor+cells.">Isolation and large scale expansion of adult human endothelial colony forming progenitor cells.</a> Journal of Vis Exp: JoVE. , (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

We present a detailed protocol that allows for the robust and efficient derivation of BOECs from adult peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs). Our protocol includes two important refinements that represent advances on previous methods of BOEC isolation.14-16 These include the absence of heparin in the initial PBMNC culture medium and the use of defined, embryonic stem cell-qualified serum. This latter refinement is of particular importance. Embryonic stem cell (ESC)-qualified serum is a more consistent grade of serum and, although it is not known yet what component(s) are enriched in the serum that benefit BOEC isolation, the impact of this defined serum on the efficiency of BOEC generation is clear in our hands. In addition, we have also had success in isolating BOECs using human serum, thereby allowing for the generation of BOECs for clinical translation. In our hands, this refined protocol results in the successful isolation of stable BOEC cultures from greater than 90% of donors, making it one of the most reliable BOEC generation methods reported thus far. Although the use of particular sera is critical to BOEC generation, it also represents a primary limitation of the current protocol. Future improvements to the technique could include the generation of these cells in serum-free, defined culture conditions.
Critical Steps in the protocol include processing blood samples as soon as possible after collection, complete harvesting of the buffy coat cells after density gradient centrifugation and the timely passaging of initial colonies from P0 to P1. This passaging step is critical to establishment of a stable isolation. Like other endothelial cells, BOECs appear to be very sensitive to plating density. If the plating density after passaging is too low, the BOECs will not proliferate. Conversely, if the colonies are allowed to become overconfluent before passaging, the cells will also cease to proliferate and have the tendency to convert into an elongated, mesenchymal cell phenotype. If few colonies appear from days 7 to 14, or if the colonies are small in size, troubleshooting can include increasing cell density by passaging P0 colonies into a T-25 flask instead of a T-75.
Once the technique is mastered, the resultant BOECs can be used in several applications, including in vitro studies of endothelial cell biology, disease modeling and drug screening, as well as in vivo cell transplantation therapies. An important consideration for the development of any cell therapy process is to use cells that are free from pathogenic mutations. We have previously shown that BOECs isolated using our protocol possess genomes that are free from copy number variations and are thus representative of the individual from which they were collected. In addition, we have also demonstrated that the majority of BOEC-derived iPSC lines are free from copy number variations.13 This contrasts with previous reports of copy number variation in fibroblast-derived iPSCs. To date, these cells remain the only iPSCs for which this degree of genomic fidelity has been reported. This feature is important for the field of iPSC biology and the use of iPSCs in disease modeling, drug screening and future cell transplantation therapies.

עד לאחרונה, הדור שלאחר הלידה של כלי דם החדשים היה האמין להתרחש אך ורק באמצעות תהליך המכונה אנגיוגנזה כ, מוגדר כהנבטה של כלי דם חדשים מתאי האנדותל של כלי קיימים מראש. 1 תהליך זה מנוגד מvasculogenesis, או היווצרות דה נובו של כלי דם מהאבות אנדותל, שחשבו שיתרחשו באופן בלעדי בעובר. 2 עם זאת, מחקרים שנעשה לאחרונה יותר זיהו ומבודדים במחזור תאי האנדותל אב (EPCs) בדם ההיקפי של מבוגרים. תאים אלה יש את היכולת להתמיין לתאי אנדותל בוגרים בתרבות ובהם האמינו להשתתף בvasculogenesis לאחר הלידה. 3,4 פרוטוקולים לבידוד והרחבת EPCs אלה בדרך כלל כרוכים בתרבות של תאים ההיקפיים mononuclear הדם (PBMNCs) בתקשורת המכילים גורמי גדילת אנדותל, כולל vasculגורם ar אנדותל צמיחה (VEGF) וצמיחה פיברובלסטים גורם-2. 5-8 תרבויות EPC לייצר מגוון רחב של סוגים שונים באופן דרמטי תא. תרבויות ראשוניות (&lt;7 ימים) נשלטות על ידי סוג תא monocytic, ידוע בספרות כ&quot; מוקדם &quot;EPCs. למרות שמם, תאים אלה מבטאים את סמן CD14 מונוציטים, הם שליליים עבור CD34 סמן האב ולהביע את הרמות מזעריות בלבד של CD31 הקלאסי אנדותל הסמנים וVEGF קולט 2 (VEGFR2). 5 תרבות המשך מולידה אוכלוסייה משנית של תאים, ידוע כEPCs מאוחר תולדה או תאי האנדותל תולדת דם (BOECs), המופיעים מושבות דיסקרטיות לתאי האנדותל כמו-. בניגוד לEPCs המוקדם monocytic, BOECs, שגם היה נקרא תאי האנדותל מושבה להרכיב (ECFCs), תאי האנדותל תולדה או תאי האנדותל מאוחר תולדה, התערוכה המורפולוגיה המרוצפת שאופייני לmonolayers תא אנדותל ודומה מאוד בסמן משטח5 וגן ביטוי 9 להבשיל לתאי אנדותל. הדור של תאי האנדותל כמו-מהדם היקפי מציע מספר יתרונות, במיוחד לחקר תפקוד התא האנדותל קשור עם הפרעות כלי דם כגון יתר לחץ דם עורקי ריאתי (PAH) 10 או פון Willebrand מחלה. 11 לפני הזמינות של BOECs, אנדותל תאים יכולים לנבוע רק מאיברי explanted בעת מוות או השתלת איבר, או מבודד מוריד הטבור בלידה. זמינות מופחת מיוצג מגבלה רצינית להבנת הביולוגיה של תאי האנדותל מחולים עם הפרעות לב וכלי דם, כמו גם את יחסי הגומלין בין תאי האנדותל וגם תאי דם או תאי ציור קיר. יתר על כן, הבידוד וculturing אוכלוסייה טהורה של תאי האנדותל ממקורות אלה הוא מאתגרים מבחינה טכנית והתאים שהופקו על ידי שיטות אלה מפגינים רק limiteיכולת שגשוג ד. BOECs לכן מציע תחליף בעל ערך לבידוד והתרבות של תאי האנדותל עיקריים הנגזר מטופל. בנוסף ליישומים שלהם במבחנה, BOECs גם שעשוי להיות שימושי בטיפולי השתלה אוטולוגית של תאים. יישומים אלה כוללים שתי השתלת אנדותל התא לקדם neovascularization (ראה 12 והפניות בו), כמו גם את הדור של תאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs). 13 iPSCs נגזר BOEC יכול לשמש לדוגמנות מחלה ומציעים פוטנציאל עצום כהתחלה חומר לטיפולים בתאים אוטולוגית. BOECs לתכנת מחדש מהר יותר ועם יעילות גבוהה יותר מאשר fibroblasts עור. יתר על כן, BOECs גם לאפשר לדור של iPSCs שהם ללא חריגות karyotypic, אשר היא תכונה חיונית של כל טכנולוגיה שתהיה מתאים ליישומי translational. היכולת ליצור iPSCs מדגימת דם חולההסימפונית מבטל את הצורך בביופסיה של עור ואת הדור של fibroblasts עור, ובכך להקל על הדור של תאים מחולים עם הפרעות ריפוי פצע, או צעירות מאוד. הפרוטוקול המפורט להלן, שאושר על ידי ונערך בהתאם להנחיות ועדת האתיקה הלאומית למחקר השירות (מזרח אנגליה), מספק שיטה פשוטה ואמינה לדור של BOECs ביעילות רבה יותר מ -90% מנפח קטן יחסית (60 מיליליטר) של דם היקפי. תאים אלה הם שגשוג מאוד ויכולים להיות passaged שוב ושוב, ומאפשרים לדור של מאה מיליון תאים מדגימת דם אחת.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">For blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL syringe with luer-lok tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19G Surflo Winged Infusion Set</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SV-19BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>E1450</td>
			<td>2 per donor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Martindale Pharmaceuticals</td>
			<td>270541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">For buffy coat isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile wrapped plastic transfer pipettes</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>KC231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turk&#8217;s Solution</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.093E+09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">For cell culture, passaging and freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 Collagen (derived from rat tail)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>35-4236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.02M Acetic Acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td>prepared in reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Medium-2MV 
			(containing Bullet Kit, but not serum)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3202</td>
			<td>Note: It is essential that the medium does not contain heparin.&#160;&#160; 
			Do not use EGM-2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (U.S.), Defined</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>T4174</td>
			<td>Dilute to 1x in PBS prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">For flow cytometric characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated mouse anti-human CD14</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555397</td>
			<td>Mouse IgG1k, Clone: WM59 
			Dilution: 1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated mouse anti-human CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555445</td>
			<td>Mouse IgG1k, Clone: WM59 
			Dilution: 1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse anti-human CD34</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555824</td>
			<td>Mouse IgG1k, Clone: 581/CD34 
			Dilution: 1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated mouse anti-human CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560976</td>
			<td>Mouse IgG1k, Clone: HI30 
			Dilution: 1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;APC-conjugated mouse anti-human VEGFR2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB357A</td>
			<td>Mouse IgG1, Clone: 89106 
			Dilution: 1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated mouse IgG1k isotype control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555748</td>
			<td>Clone: MOPC-21 
			Dilution: 1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse IgG1k isotype control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555751</td>
			<td>Clone: MOPC-21 
			Dilution: 1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse IgG1k isotype control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC002A 
			Dilution: 1:10</td>
			<td>Clone: 11711</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">For immunofluorescent microscopy&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 24-well tissue culture plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-human CD34 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB72271</td>
			<td>Clone 756510, IgG1, use at 10 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal goat anti-human VE-cadherin (CD144)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF938</td>
			<td>Antigen affinity- purified IgG, use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal rabbit anti-human Von Willebrand Factor (vWF)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab154193</td>
			<td>Clone EPSISR15, use at 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Polyclonal, 2 mg/ml, use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>Polyclonal, 2 mg/ml, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-10042</td>
			<td>Polyclonal,&#160; 2 mg/ml, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>use at 1 &#956;g/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

בידוד של תאי mononuclear המעיל באפי מ- 60 מיליליטר של דם בדרך כלל תשואות 100-150x10 6 תאי דם לבנים הכולל. כאשר מצופה לתוך T-75 בקבוק אחד, המספר הגדול של תאים בתרחיף תאי unlysed מקשה לפתור תאים חסיד פרט באמצעות מיקרוסקופ brightfield. שינויים בינוניים חזרו לגרום לשחרור של תאים שאינם חסיד ולאפשר להדמיה של האוכלוסייה חסיד של monocytic &quot;מוקדם&quot; EPCs. ביום 7, T-75 יכילו כ 7x10 6 תאים חסיד המוארכים אלה. מיום 7 עד 14, מושבות של BOECs אמורות להופיע בתוך הבקבוק (איור 2 א). מושבות יופיעו כ3 עד 5 תאים סמוכים ראשונה. מספר מושבה תולדה יכול להשתנות 1-10 מושבות בכל 60 מיליליטר של דם. בדרך כלל, תורמים צעירים (כלומר, 20-25 שנים) נוטים לייצר מספר גדול יותר של מושבות תולדה, שגם מופיעות מוקדם יותר בתרבות.BOECs להתרבות מקבוצה מרכזית זו של תאים ליצור מושבות עגולות בהיקף של כמה מאה תאים. תאים בתוך מושבות אלה מפגינים מורפולוגיה מרוצפת אנדותל קלאסית. עדיף מושבות ראשוניות מעבר כאשר הם מכילים כ 1000 תאים לכל מושבה. מושבות תולדה בדרך כלל להגיע לגודל זה 7 ימים לאחר ההופעה המקורית שלהם בתרבות. ברגע שהמושבות המקוריות passaged לתוך T-75 בקבוק חדש, הם צריכים להתרבות בצורת monolayer ומחוברות (3-5x10 6 תאים לכל בקבוק) בתוך 5 ימים או פחות (איור 2). באחוז קטן של בידודים (&lt;10%), מושבות תולדה אינן מופיעות, או לא מספיק להתרבות הבא צעד passaging ראשוני זה. BOECs כי התערוכה התפשטות נמוכה לאחר passaging הראשון שלהם כמעט ולא ללכת על מנת להפוך בידודי BOEC יציבים ולעתים קרובות להפסיק מתרבים בתוך שנים עד שלושה קטעים. MonocyticEPCs המוקדם בתוך תרבויות BOEC הינו ללא שגשוג ונמחקים בדרך כלל מהתרבויות בתוך 1-2 קטעים. חיסול של תאים מוקדמים אלו נובע מוות של תאים, כישלון של התאים המוקדמים מחדש לדבוק לאחר passaging ודילול של EPCs המוקדם אינו השגשוג עם passaging חוזר ונשנה. או יכולים להיות passaged תאי 1 מעבר נוסף בתרבות או קפוא מטה לשימוש מאוחר יותר. ברגע שבידוד יציב שנוצר, ניתן passaged תאים בשיעור של בקבוק ומחוברות 1 עד 3-5 T-75 צלוחיות חדשות עד מעבר 8 או 9 לפני שהפכתם שקט. שוב, צפיפות תאים היא קריטית בכל תרבות. מניסיוננו, צריכים להיות מצופים לא פחות מ 750,000 תאים בבקבוק T-75, כפי שצפיפות תא תחתונה יכול לגרום למעצר צמיחה. למרות פוטנציאל השגשוג הגבוה של BOECs, צריכים גם לא יורשו תאים להפוך overconfluent (כלומר.,&gt; 5x10 6 תאים לכל בקבוק) כמו זה יכול לגרום convers<html> יון של BOECs לפנוטיפ הלא שגשוג. אנו מציעים שכל תא שכותרתו כBOEC צריך להציג פני תא מתאים וצביעה תאית לסמנים האנדותל. אפיון של BOECs יכול להיות מושגת על ידי cytometry זרימה (איור 3) או מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 4), הבא מכתים עבור סמני תא האנדותל טיפוסיים. BOECs הם חיוביים עבור CD31 סמני משטח אנדותל וVEGFR2 ושליליים עבור CD14 סמן מונוציטים וCD45 הסמן פאן-יקוציט. BOECs גם posess גופי Weibel-Palade ובכך להביע את פון Willebrand פקטור (vWF) כמכתים בדיד, punctate cytoplasmic. בניגוד לסוגים אחרים בוגרים אנדותל תא, כגון עורק ריאה או תאי האנדותל אב העורקים, BOECs גם להביע את האב וCD34 סמן הפעלה על פני השטח שלהם. ftp_upload / 53,384 / 53384fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1. תרשים סכמטי של פרוטוקול דור BOEC. תאי דם היקפי mononuclear מבודדים מהדם ורידים על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות ותרבותי על צלחות מצופים קולגן במדיום גידול האנדותל מכיל מוגדר FBS. מושבות BOEC מופיעות בתוך 7-14 ימים של התרבות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53384/53384fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53384/53384fig2.jpg" /> איור 2. תמונות Brightfield של תרבויות BOEC נציג. () מושבות תולדה מופיעות בתרבויות בין ימים 7 ו -14 מושבות הנוכחיים כאוספים של תאי האנדותל כמו-, אשר מסודרים בשכבה מרוצפת ולהתרבות רדיאלית החוצה מתוך נקודה מרכזית. המקיף את מושבות תולדה הן מונו חסידתאי cytic שמרכיבים את הרוב המכריע של תאים בתרביות מוקדמות. תאים אלה, שתוארו בעבר כ&quot; מוקדם &quot;ותאים אנדותל, יש מורפולוגיה כמו ציר-ולהביע CD14 סמן monocytic. (ב) בעקבות passaging, BOECs השגשוג מאוד להשתלט על תרבויות, כמו התאים monocytic הלא השגשוג או למות או להיכשל לצרף מחדש לאחר passaging. 250μm בר סולם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53384/53384fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53384/53384fig3.jpg" /> איור 3. אפיון של BOECs ידי cytometry זרימה. BOECs היה trypsinized ומוכתם עם נוגדני fluorescently- מצומדות שליטת אלוטיפ (אפור שיא מלא) או נוגדנים מכוונים נגד סמנים ספציפיים משטח (קו אדום). סמני משטח לאפיון cytometricכולל סמני hematopoietic CD45 וCD14, הסמנים האנדותל CD31 וVEGFR2 וprogentior וסמן הפעלת האנדותל CD34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53384/53384fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53384/53384fig4.jpg" /> איור 4. מכתים Immunofluorescent של BOECs לסמני תא האנדותל. תמונות immunofluorescence נציג של BOECs immunostained עם נוגדנים המכוונים נגד הסמן פני תא אנדותל CD144 (VE-cadherin, פנל ימני עליון) וגליקופרוטאין הדם פון Willebrand פקטור (vWF, פנל ימני תחתון) . לוחות מקבילים מראים מכתים DAPI גרעיני מוצגים בצד השמאל. 50μm בר סולם. לCD144. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53384/53384fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה גדולה יותר</a>גרסה של נתון זה.

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood at JoVE.com

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

דור והתרבות של דם תולדה תאי אנדותל מאדם דם היקפי

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

generation-culture-blood-outgrowth-endothelial-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Biology

18.8K Views.  University of Cambridge. This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

Video: Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

והעשרה של תאים NK מ דם אדם עם קיט RosetteSep מ StemCell טכנולוגיות

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) were first identified in adult human peripheral blood by Asahara et al. in 1997 2 bringing an infusion of new hypotheses and strategies for vascular regeneration and repair. EPCs are rare but normal components of circulating blood that home to sites of blood vessel formation or vascular remodeling, and facilitate either postnatal vasculogenesis, angiogenesis, or arteriogenesis largely via paracrine stimulation of existing vessel wall derived cells3. No specific marker to identify an EPC has been identified, and at present the state of the field is to understand that numerous cell types including proangiogenic hematopoietic stem and progenitor cells, circulating angiogenic cells, Tie2+ monocytes, myeloid progenitor cells, tumor associated macrophages, and M2 activated macrophages participate in stimulating the angiogenic process in a variety of preclinical animal model systems and in human subjects in numerous disease states4, 5. Endothelial colony forming cells (ECFCs) are rare circulating viable endothelial cells characterized by robust clonal proliferative potential, secondary and tertiary colony forming ability upon replating, and ability to form intrinsic in vivo vessels upon transplantation into immunodeficient mice6-8. While ECFCs have been successfully isolated from the peripheral blood of healthy adult subjects, umbilical cord blood (CB) of healthy newborn infants, and vessel wall of numerous human arterial and venous vessels 6-9, CB possesses the highest frequency of ECFCs7 that display the most robust clonal proliferative potential and form durable and functional blood vessels in vivo8, 10-13. While the derivation of ECFC from adult peripheral blood has been presented14, 15, here we describe the methodologies for the derivation, cloning, expansion, and in vitro as well as in vivo characterization of ECFCs from the human umbilical CB.

Endothelial colony forming cells (ECFCs) are circulating endothelial cells with robust clonal proliferative potential that display intrinsic in vivo vessel forming ability. Phenotypic and functional characterization of outgrowth endothelial cells derived from CB are important to identify and isolate bona fide ECFCs for potential clinical application in repairing damaged tissues.

אפיון פנוטיפי ופונקציונלי של תאים מושבה אנדותל יוצרי נגזר דם טבורי האדם קורד

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

דור של תאים אנושיים מושרים pluripotent גזע מדם היקפי באמצעות STEMCCA lentiviral הווקטור

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs are protected from degradation by sequestration in small vesicles called exosomes. Exosomes can fuse with the plasma membrane resulting in the transfer of RNA and proteins to the target cell. Their biological functions include immune response, antigen presentation, and intracellular communication. Delivery of miRNAs that can regulate gene expression in the recipient cells via blood has opened novel avenues for target intervention. In addition to offering a strategy for delivery of drugs or RNA therapeutic agents, exosomal contents can serve as biomarkers that can aid in diagnosis, determining treatment options and prognosis.	Here we will describe the procedure for quantitatively analyzing miRNAs and messenger RNAs (mRNA) from exosomes secreted in blood and cell culture media. Purified exosomes will be characterized using western blot analysis for exosomal markers and PCR for mRNAs of interest. Transmission electron microscopy (TEM) and immunogold labeling will be used to validate exosomal morphology and integrity. Total RNA will be purified from these exosomes to ensure that we can study both mRNA and miRNA from the same sample. After validating RNA integrity by Bioanalyzer, we will perform a medium throughput quantitative real time PCR (qPCR) to identify the exosomal miRNA using Taqman Low Density Array (TLDA) cards and gene expression studies for transcripts of interest.	
 These protocols can be used to quantify changes in exosomal miRNAs in patients, rodent models and cell culture media before and after pharmacological intervention. Exosomal contents vary due to the source of origin and the physiological conditions of cells that secrete exosomes. These variations can provide insight on how cells and systems cope with stress or physiological perturbations. Our representative data show variations in miRNAs present in exosomes purified from mouse blood, human blood and human cell culture media.	
 Here we will describe the procedure for quantitatively analyzing miRNAs and messenger RNAs (mRNA) from exosomes secreted in blood and cell culture media. Purified exosomes will be characterized using western blot analysis for exosomal markers and PCR for mRNAs of interest. Transmission electron microscopy (TEM) and immunogold labeling will be used to validate exosomal morphology and integrity. Total RNA will be purified from these exosomes to ensure that we can study both mRNA and miRNA from the same sample. After validating RNA integrity by Bioanalyzer, we will perform a medium throughput quantitative real time PCR (qPCR) to identify the exosomal miRNA using Taqman Low Density Array (TLDA) cards and gene expression studies for transcripts of interest.
 These protocols can be used to quantify changes in exosomal miRNAs in patients, rodent models and cell culture media before and after pharmacological intervention. Exosomal contents vary due to the source of origin and the physiological conditions of cells that secrete exosomes. These variations can provide insight on how cells and systems cope with stress or physiological perturbations. Our representative data show variations in miRNAs present in exosomes purified from mouse blood, human blood and human cell culture media

The presence of stable microRNAs (miRNAs) in exosomes has generated immense interest as a novel mode of intercellular communication, for their potential utility as biomarkers and as a route for therapeutic intervention. Here we demonstrate exosome purification from blood and culture media followed by quantitative PCR to identify miRNAs being transported.

טיהור וmicroRNA פרופיל של Exosomes נגזר מדיה דם ותרבות

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs  are protected from degradation by sequestration in small vesicles called  ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

דור יעיל iPS תא מהדם באמצעות Episomes וHDAC המעכבים

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

הדמיה שני פוטונים של תאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; תאי טיפול ותחמוצת חנקן ייצור בהאנדותל ושריר חלק של עכברוש אב העורקים מבודדים

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

חלבונים Immunofluorescence ניתוח של אנדוגני אקסוגניים centromere-קינטוכור

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived microvesicles (MVs, diameter &#62; 100 nm) is a fundamental cellular process that occurs in all living cells. These vesicles transport proteins, lipids and nucleic acids specific for their cell of origin and in vitro studies have highlighted their importance as mediators of intercellular communication. EVs have been successfully isolated from various body fluids and especially EVs in blood have been identified as promising biomarkers for cancer or infectious diseases. In order to allow the study of MV subpopulations in blood, we present a protocol for the standardized isolation and characterization of MVs from peripheral blood samples. MVs are pelleted from EDTA-anticoagulated plasma samples by differential centrifugation and typically possess a diameter of 100 - 600 nm. Due to their larger size, they can easily be studied by flow cytometry, a technique that is routinely used in clinical diagnostics and available in most laboratories. Several examples for quality control assays of the isolated MVs will be given and markers that can be used for the discrimination of different MV subpopulations in blood will be presented.

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

בידוד ואפיון של Microvesicles מן הדם היקפי

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like pressure or mechanical perturbations. Mechanoreceptors detect their stimuli and transmit signals via a great diversity of mechanisms. Some of the most common roles for mechanoreceptors are in neuronal responses, like touch and pain, or hair cells which function in balance and hearing. Mechanosensation is also important for cell types which are regularly exposed to shear stress such as endothelial cells, which line blood vessels, or blood cells which experience shear in normal circulation. Viscometers are devices that detect the viscosity of fluids. Rotational viscometers may also be used to apply a known shear force to fluids. The ability of these instruments to introduce uniform shear to fluids has been exploited to study many biological fluids including blood and plasma. Viscometry may also be used to apply shear to the cells in a solution, and to test the effects of shear on specific ligand-receptor pairs. Here, we utilize cone-plate viscometry to test the effects of endogenous levels of shear stress on platelets treated with antibodies against the platelet mechanosensory receptor complex GPIb-IX.

We describe an in-solution method to apply uniform shear to platelet surface receptors using cone-plate viscometry. This method may also be used more broadly to apply shear to other cell types and cell-fragments and need not target a specific ligand-receptor pair.

מדים להטות שיטת של טסיות האדם וקולטני פני שטח התא דרך קונוס-וזיקוק הלוח

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like ...