אנו מציעים לייצר תאי דם מתאים גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנחנו מקבלים תשואות עקביות ומדויקות של תאים אנדותל hemogenic. אנו מצפים כי הפלטפורמה שלנו תאפשר יישומים רחבים ניטור מחלות הקרנה עבור תרכובות טיפוליות.
טכניקה זו מועילה במיוחד לחקר המטולוגיה ואימונולוגיה. השיטה יכולה להיות מיושמת על התערבות גנטית או עריכת גנים של תאי דם אנושיים. זה מאפשר אינדוקציה קלה של וקטורים בתאי אנדותל hemogenic.
הנקודה הקריטית ביותר היא ציפוי LM511-E8 להקלדת מושבות PSC. איננו ממליצים לדלג על הציפוי או להחליף במטריצה אחרת. הדגמות חזותיות חשובות מכיוון שברצוננו להראות כיצד לשטוף את התאים במאגר דיסוציאציה וכיצד לצפות צלחות ב- LM511-E8.
לגדל תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים או hPSCs בין 70 ל 80%confluency על צלחת LM511-E8 מצופה שש בארות במדיום mTeSR1. ארבעה ימים לפני אינדוקציה hemogenic, שאפו את המדיום לשטוף פעמיים עם PBS. שוטפים את התאים בתת פתרון דיסוציאציה, ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
תן שימוש חוזר בתאים במדיום תחזוקה PSC ולהעביר את ההשעיה לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה התאים ב 200 פעמים G במשך שלוש דקות. שאפו את העל-טבעי, והתינו מחדש את התאים במדיום הציפוי של PSC.
צלחת ההשעיה PSC על פי הוראות כתב היד על כלי פלסטיק microfabricated, ו דגירה לילה. שלושה ימים לפני אינדוקציה hemogenic, בעדינות pipette spheroids PSC לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר ולהשאיר אותם במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר כדי לזרז על ידי כוח הכבידה. שאפו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את הכדורואידים במדיום ציפוי כדורי.
הפץ את ההשעיה לתוך צלחת תרבות LM511-E8 מצופה 10 ס"מ בצפיפות של ארבעה כדוריות לסנטימטר מרובע ודגירה במשך שלושה ימים. לאחר שלושה ימים, שאפו את המדיום, הוסיפו מדיום התברואה של יום אפס, ותרבו את התאים במשך יומיים באינקובטור היפוקסי. לאחר מכן, שאפו את היום אפס בינוני, הוסיפו מדיום ההידול של היום השני, ותרבות ליומיים נוספים.
יומיים לאחר מכן, שאפו את המדיום ושטפו את התאים פעמיים עם PBS. שוטפים את התאים בתת דיסוציאציה ודולרים במשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר הדגירה, נתק את התאים על ידי שימוש חוזר בעדינות בהם ב- EDTA מילימולרי אחד.
מעבירים את ההשעיה לצינור חרוט 50 מיליליטר, וצנטריפוגה התאים ב 200 פעמים G במשך שלוש דקות. שאף את העל-טבעי והתן מחדש את גלולת התא עם 300 מיקרוליטרים של חיץ הפרדה מגנטית. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חיידקים חיוביים ל-CD34 לתאים, וערבבו בעדינות על-ידי צינורות.
דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות, ולאחר מכן להשתמש מסננת תא 40 מיקרומטר כדי לאמץ את ההשעיה ולהפריד את התאים החיוביים CD34 באמצעות מפריד מגנטי. לוותר על 0.5 מיליליטר של 5 מיקרוגרם לכל מיליליטר פיברונקטין ציפוי פתרון לתוך כל באר של צלחת תרבות 24 היטב, ולהדקר את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. בינתיים, צנטריפוגה תאים חיוביים CD34 ממוין ב 200 פעמים G במשך שלוש דקות, ו resuspend את גלולה במיליליטר אחד של מדיום EHT.
קבע את צפיפות התאים בת קיימא באמצעות מונה תאים והתאם את צפיפות התא ל- 200, 000 תאים למיליליטר על-ידי הוספת מדיום EHT. שאפו והשליכו את תספורת הציפוי מה בארות מצופות הפיברונאטין, ופונו 0.5 מיליליטר של מתלי תאים חיוביים CD34 לכל באר. דגירה התאים באינקובטור היפוקסי במשך שבוע.
כדי לאסוף את התאים הצפים, להעביר את מדיום התרבות לצינור חרוט 15 מיליליטר, וצנטריפוגה ב 200 פעמים G במשך שלוש דקות. אז שאף את העל-טבעי. כדי לאסוף את התאים חסידים, לשטוף אותם פעמיים עם 0.5 מיליליטר של PBS, ולשטוף אותם עם חיץ דיסוציאטיבי.
שאפו את הנוזל העודף והגררו את הצלחת ב-37 מעלות במשך חמש דקות. תן שימוש חוזר בתאים במיליליטר אחד של מאגר Facs וערבב את התאים הצפים והחסידים. צנטריפוגה התאים המעורבים ב 200 פעמים G במשך שלוש דקות, ואז לשאוף את supernatant ו resuspend התאים ב 50 microliters של מאגר Facs.
לדלל נוגדנים נגד CD34 ואנטי CD45 ב 50 microliters של מאגר Facs;להוסיף אותם לתאים דגירה התאים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS, צנטריפוגה ב 200 פעמים G במשך שלוש דקות לאחר כל לשטוף. שאף את העל-טבעי והשקיע מחדש את התאים ב- 0.5 מיליליטר של מאגר Facs עם 0.5 מיקרוגרם למיליליטר דאפי.
מדוד ביטוי CD34 ו- CD45 לפי ציטומטריית זרימה. כדי לאסוף את התאים hematopoietic, להעביר את מדיום התרבות לצינור חרוט 15 מיליליטר. לאסוף את התאים הנותרים על ידי שטיפה עדין של באר פעמיים עם PBS.
צנטריפוגה התאים ב 200 פעמים G במשך שלוש דקות ואז לשאוף את supernatant ו resuspend במיליליטר אחד של מדיום EHT. לאחר ספירת התאים, להוסיף 10, 000 תאים לשלושה מיליליטר של מדיה במים methylcellulose, בתוספת אנטיביוטיקה, ולהשתמש מזרק מד 16 לערבב חמש פעמים. לוותר על כל ההשעיה התקשורתית לתוך כל באר של צלחת שש בארות.
כדי לשמור על התאים לחים, מוסיפים מים או PBS ל בארות הריקות על הצלחת. דגירה התאים במשך שבועיים, הקפדה לא להפריע את המנה כמו מושבות רגישים לתנועה. אחרי שבועיים, לספור את המושבות תחת מיקרוסקופ.
התא משתנה מורפולוגית מתאי אנדותל להמטופוטויטיים עם גירוי עם הקוקטייל המטופויטי. מושבות תאים hematopoietic להגיח בתרבות. תאים מולדים hematopoietic אקספרס CD34 ו CD45, כך cytometry זרימה משמש כדי לאשר את נוכחותם של מושבות תא hematopoietic על ידי ניתוח ביטוי של CD34 ו CD45.
אסיאת יחידה יוצרת מושבה הדגימה את הדור של גרנולוציטים או מושבות מקרופאג' מהתאים ההמוטופיים החיוביים של CD34 ו- CD45 חיוביים. מספר המושבה הוערך ב-38 יחידות יוצרות מושבה לכל 10,000 תאים. הצעדים המכריעים ביותר הם מספירת כדורי PSC.
מצאנו כי מדד פני השטח הוא הגורם דטרמיניסטי ביותר ביעילות של פרוטוקול זה. הליך זה יכול להיות מלווה על ידי ייצור מחוץ למדף של תאים לא כירורגיים כגון תאים המתרחשים באופן טבעי מקרופאגים. פלטפורמה זו מאפשרת לחוקרים לחקור גורמים דטרמיניסטיים מרכזיים בהתפתחות ההמוטופיטית האנושית.
