This work was supported by grants funded by the British Heart Foundation (BHF), Dinosaur Trust, McAlpine Foundation, Fondation Leducq, Fight for Sight, the Cambridge Biomedical Research Centre, National Institute of Health Research including (i) the BHF Oxbridge Centre of Regenerative Medicine [RM/13/3/30159], (ii) the BHF Cambridge Centre of Research Excellence, (iii) Addenbrooke's Hospital, Cambridge University Hospitals NHS Foundation Trust and (iv) Papworth Hospital NHS Foundation Trust, and supported the Cambridge NIHR BRC Cell Phenotyping Hub. MLO is funded by a BHF Intermediate Fellowship. FNK is funded by a BHF PhD Studentship.

Ein Schema des BOEC Erzeugungsprotokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. 1. Blutentnahme und Dichte-Zentrifugation <ol><li> Für jeden Spender 3 ml Natriumcitrat, um jeden von zwei 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen. Sammeln Sie 60 ml Blut durch Venenpunktion und 30 ml in jedes Röhrchen. Kehren sanft 2-3 Mal zu mischen. Verwenden weniger als 40 ml Blut in das Protokoll, mit Citrat Volumina entsprechend eingestellt. HINWEIS: Es ist wichtig, dass Blutproben werden innerhalb von 2 h Kollektion verarbeitet. Verzögerte Verarbeitung von Blut führt zu einer deutlichen Reduktion der Auswuchs Kolonie Ausbeute. </li><li> Bereiten Sie neue konische Röhrchen, die Dichtegradientenzentrifugation Medium durch erste Umdrehen der Flasche mehrmals, um zu mischen. In einer sterilen Haube 15 ml Dichtegradientenzentrifugation Medium pro 50 ml konische Röhrchen (1 Röhrchen pro 10 ml Blut, 6 Röhrchen pro Spender). </li><li> Verdünnte Blut 1: 1 mit Dulbecco-Phosphat-gepufferten Saline (DPBS). Kippen der Röhrchen mit dem Dichtegradientenzentrifugation Medium zu einem Winkel von 20 ° mit der Arbeitsfläche. Mit einer Pipette Hilfe und eine 25 ml serologische Pipette langsam Schicht 21 ml verdünntes Blut auf dem Medium durch allmähliche Zugabe von Blut auf der Wand der geneigten Röhre. HINWEIS: Dadurch wird Mischung des Blutes mit dem Dichtegradienten Schicht zu minimieren und eine engere Buffy-Coat sowie eine verbesserte Ausbeute herzustellen. </li><li> Zentrifuge Proben bei 400 × g für 35 min bei RT mit dem Gaspedal und der Bremse ausgeschaltet. </li><li> Während dieser Zentrifugation Zeit beginnen die Kollagenbeschichtung in den Schritten 2.1 detailliert - 2.4. Achten Sie darauf, diese Schritte, bevor zu Schritt 3.1 abgeschlossen. </li></ol> 2. Kollagenbeschichtung der T-75-Kolben und Vorbereitung des Kulturmediums HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte in einer Zellkultur Kapuze. <ol><li> Bereiten Sie eine 50 ug / ml Kollagenlösung durch Verdünnen Lager TyPE I-Kollagen in 10 ml 0,02 M Essigsäure. Beispiel: für Kollagen Lager in einer Konzentration von 4,05 mg / ml, so 123,5 ul Kollagen zu 10 ml 0,02 M Essigsäure. Sterilfilter Kollagensuspension vor der Verwendung. </li><li> Verwendung einer serologischen Pipette 7,5 ml Kollagenlösung mit einem T-75-Zellkulturflasche. Dieses Volumen gibt 5 ug Kollagen / cm 2 (oder 375 &amp; mgr; g / Kolben). Mantel Kolben für 1 h bei RT. </li><li> Bereiten Sie das Hinzu endothelialen Grundmedium mit den Wachstumsfaktor Ergänzungen durch den Hersteller zur Verfügung gestellt für BOEC Erzeugung verwendet endothelialen Wachstumsmedium. Fügen Sie alle Ergänzungen, aber nicht Serum hinzuzufügen. Vorzubereiten 15 ml Erzeugungsmedium BOEC, fügen 2,5 ml definiert fötalem Rinderserum (FBS) zu 12,5 ml Endothelwachstumsmedium den Wachstumsfaktor enthaltenden Präparate. </li><li> Fahren Sie mit den Schritten in Abschnitt 3 skizzierten Nach 1 Std Beschichtungszeitraum absaugen Kollagenlösung und abwaschen restliche Essigsäure durch Pipettierenin 10 ml DPBS. Absaugen des DPBS und wiederholen Sie diesen Waschschritt noch einmal. Wenn die im Schritt 3.3 erhaltene Zellsuspension ist nicht bereit für die Beschichtung zu dieser Zeit, fügen Sie 5 ml Generation mittel BOEC in den Kolben, um die Kollagenbeschichtung vor dem Austrocknen zu halten. </li></ol> 3. Erhebung und Oberflächen von PBMNCs <ol><li> Im Anschluss an die Dichtegradientenzentrifugation in Schritt 1.4 beschrieben, sorgfältig sammeln die Buffy-Coat-Schicht unter Verwendung eines sterilen Plastiktransferpipette. Sammeln der buffy coat sollte etwa 20 ml Zellsuspension und Plasma aus jedem Röhrchen zu ergeben. Vermeiden Sie die Übertragung der Dichtegradienten-Medium. </li><li> Verdünnen Sie die mononukleäre Zellsuspension 1: 1 in DPBS und invertieren zu mischen. Zentrifuge bei RT für 20 min bei 300 xg mit Bremse und Gaspedal bei max. </li><li> Nach der Zentrifugation den Überstand aspirieren und resuspendieren Zellen, die durch Zugabe von 1 ml Generation mittel BOEC zu jedem Pellet und Auf-und Abpipettieren mehrmals. Pool Zellsuspensionen eind nachfüllen Gesamtvolumen auf 10 ml mit dem restlichen Medium. </li><li> Um eine Schätzung der Gesamtzellzahl, Probe 10 ul Zellsuspension zu erhalten und zu verdünnen 50x mit 490 ul der Türken Lösung, die roten Blutkörperchen zu lysieren wird. Gehören eine 10 ul Probe des verdünnten Zellsuspension unter Verwendung eines Hämozytometers. HINWEIS: 60 ml Blut sollte etwa 100-150 x 10 6 weißen Blutkörperchen für die Beschichtung zu erhalten. </li><li> Platte gesamte Zellsuspension in einer einzigen, mit Kollagen beschichteten T-75-Kolben, top-up Mittelvolumen auf 15 ml / Kolben und die Kultur bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2. Zellen zu diesem Zeitpunkt überzogen darstellen Gang 0. Anmerkung: Es ist möglich, die isolierten PBMNC vor BOEC Isolierung um die BOECs zu einem späteren Zeitpunkt oder um die PBMNC in ein anderes Labor, in dem die BOECs erzeugt werden transportieren abzuleiten einzufrieren. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass das Einfrieren PBMNCs könnte die Effizienz BOEC Isolierung reduzieren. See Abschnitt 8 unten Methode. </li></ol> 4. Langfristige Zellkultur <ol><li> Ändern Medium alle 2 Tage durch Zugabe von 15 ml frischem BOEC Erzeugungsmedium (5: 1-Mischung von endothelialen Zellwachstumsmedium und definierte FBS). Für Wochenenden können Medium Änderungen alle 3 Tage verzögert werden. HINWEIS: Outgrowth Kolonien sollte zwischen 7 und 14 Tagen der Kultur angezeigt. </li><li> Überwachen die BOEC Kulturflasche an den Tagen 7-14 für das Auftreten der Folge Kolonien. Identifizieren Kolonien als kreisförmige Gruppen von Zellen, die einen klassischen endothelialen Kopfsteinpflastermorphologie. </li><li> Nachdem eine Kolonie oder mehreren Kolonien werden in den Kolben identifiziert, mit mittleren Veränderungen weiter und lassen Sie Kolonien auf etwa 1000 bis 2000 Zellen pro Kolonie vor Passagieren wachsen. Bestimmen Sie die Zellzahl pro Volk durch eine schwierige visuelle Schätzung. ANMERKUNG: Als Richtlinie üblich, Durchgang Anfangs Auswuchs Kolonien eine Woche nach der Identifizierung des ersten Auswuchs Kolonie ist es. </li> &lt;li&gt; Passage Zellen durch Spülen Kolben zweimal mit 10 ml DPBS. 5 ml 1X Trypsin-EDTA und Inkubation in einem Inkubator bei 37ºC für 5 min. Nach 5 min, zu neutralisieren Trypsin mit 10 ml Medium (enthaltend FBS) und bringen Zellen in Suspension mit wiederholten Pipettieren. </li><li> Zentrifuge Suspension bei 300 xg für 5 min, resuspendieren in 15 ml frischem BOEC Erzeugungsmedium und der Platte gesamte Zellsuspension in einen neuen T-75-Kolben (entspricht Passage 1, P1). Keine Kollagenbeschichtung erforderlich. </li><li> Weiterhin Mediums ändert, wie oben beschrieben, bis die Zellen konfluent (ungefähr 3-5 x 10 6 Zellen pro Kolben). Sobald konfluent, Passage-Zellen, wie in Schritt 4.3 beschrieben. HINWEIS: Von Durchgang 2 ab, Zellen nicht mehr benötigen Generation mittel BOEC und kann in endothelialen Zellwachstumsmedium und 10% Standard-hitzeinaktiviertem FBS kultiviert werden. Collagen Beschichtung kann als ein optionaler Schritt für die Zukunft genutzt werden, denn es gibt Hinweise darauf, dass die Anwesenheit von Kollagen kann BOEC prolifer verbessernation Raten. </li><li> Für die weitere Passage, Platte nicht weniger als 750.000 Zellen pro T-75-Kolben so niedrig Zelldichten kann dazu führen, die BOECs zu stoppen vermehren. </li></ol> 5. Einfrieren und Auftauen BOEC Kulturen <ol><li> Trypsinize Zellen, wie in Abschnitt 4.3 und Zentrifuge bei 300 xg für 5 min beschrieben. Saugt den Überstand und resuspendiere in 10 ml Medium. Dies erfordert nicht endothelialen Zellwachstumsmedium; DMEM mit 10% FBS-Standard genügt. Sammeln eine 10 ul-Probe der Zellsuspension, um eine manuelle Zellzählung unter Verwendung eines Hämozytometers durchzuführen. </li><li> Zentrifuge wieder und resuspendieren in 2x10 6 Zellen / ml in eiskaltem Kryokonservierung Medium (40% DMEM mit 50% FBS und 10% DMSO). 0,5 ml (10 6 Zellen) zu jedem Gefäß, place Fläschchen in einer eiskalten Isopropanol Kryokonservierung Gefäß entnommen und in einen -80 ° C im Gefriergerät für mindestens 2 h vor der Übertragung an flüssigem Stickstoff. Lassen Sie keine Zellen bei -80 ° C für mehr als 24 Stunden. </li&gt; <li> Zum Auftauen Zellen, 10 ml vorgewärmten Medium zu einem 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen. HINWEIS: Wenn Auftauen Passage 1-Zellen aufgetaut, in endothelialen Zellwachstumsmedium mit definiertem FBS für die ersten 2 Tage nach dem Auftauen 20% ergänzt wird. Dies führt zu einer stabileren Zellisolierung für die Zukunft. </li><li> Zellen, die aus flüssigem Stickstoff und Auftauen in einem 37 ° C Wasserbad unter leichtem Rühren zu entfernen, bis nur ein kleiner Eiskristalle in der Durchstechflasche. Geben Sie den Inhalt des Fläschchens tropfenweise zu der konischen Zentrifugenröhrchen und Spin bei 300 g nach unten für 5 Minuten. </li><li> Überstand wird abgesaugt und resuspendieren Zellpellet in 10 ml EGM-2MV + 10% FBS. In den T-75-Kolben und Top-up-Medium auf 15 ml. </li></ol> 6. Charakterisierung der BOECs durchflusszytometrisch <ol><li> Sobald die in Abschnitt 4 beschrieben BOEC Kolonien erlaubt worden, zu erweitern, trypsinize Zellen, wie in Abschnitt 4.4 und resuspendieren in einer Konzentration von 10 6 Zellen pro ml in Färbepuffer beschrieben (DPBS with 2% FBS und 2 mM EDTA). </li><li> Kombinieren Sie 10 5 Zellen mit einem Fluorochrom konjugierte Antikörper gegen CD45, CD14, CD34, CD31 (Nutzung aller bei 1:20 Verdünnung) oder VEGFR2 (verdünnen 1:10) gerichtet (siehe Tabelle 1 für weitere Informationen). Inkubation für 30 min bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Zellen mit 1 ml Färbung Puffer und Zentrifuge bei 300 xg für 5 min waschen. Überstand wird abgesaugt und resuspendieren in 400 &amp; mgr; l Färbepuffer für die Analyse. Halten Zellen bei 4 ° C und vor Licht vor der Analyse geschützt. </li><li> Zuführen zytometrische Analyse auf einem Durchflusszytometer ausgestattet, um die Fluoreszenz-konjugierte Antikörper in dem Assay verwendet detektieren. </li><li> Verwenden einen ungefärbten BOEC Probe, um die Zellpopulation am Zytometer durch Einstellen Vorwärts- und Seitenstreuspannungen sowie die Spannungen für die FITC und APC-Kanäle zu identifizieren. </li><li> Bestimmen Sie Gating Schwellen mit Isotyps gefärbten Zellen für jedes Fluorochrom. Beurteilen Positivität für jeden Zelloberflächenmarker auf der Grundlage der Presence einer Spitzenverschiebung der Fluoreszenz-Intensität gegen die Isotyp-Kontrolle für die Fluorochrom analysiert. </li></ol> 7. Charakterisierung BOECs durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie <ol><li> Platte BOECs in einer 24-Well-Flachboden-Gewebekulturplatte ohne Deckgläser in einer Dichte von 5 × 10 4 Zellen in 500 ul endothelialen Zellwachstumsmedium + 10% hitzeinaktiviertem FBS pro Vertiefung und lassen Sie sich an und wachsen bei 37 ° C, 5% CO 2, bis die Zellen umfasst mindestens 70-80% der Oberfläche von jeder Vertiefung (Schätzung Konfluenz durch visuelle Untersuchung unter einem Lichtmikroskop). </li><li> Wash-Zellen in jeder Vertiefung für 5 Minuten mit 1 ml DPBS. </li><li> Fixieren Zellen O / N bei 4 ° C mit 500 ul 4% Paraformaldehydlösung in DPBS. </li><li> Wash-Zellen für 3 x 5 min mit 1 ml DPBS pro Vertiefung. Hinzufügen und entfernen Sie die DPBS mit einer Pipette und eine Wasserstrahlpumpe verbunden. </li><li> Permeabilisieren Zellen für 3 x 10 min mit 0,2% Polysorbat 20 in DPBS. </li&gt; <li> Inkubieren Zellen für 1 h bei RT in Blocking-Puffer, enthaltend 10% FBS in DPBS. </li><li> Fleckzellen bei 4 ° CO / N in 300 ul Antikörperverdünnungspuffer (0,1% Rinderserumalbumin in DPBS) mit primären Antikörpern gegen CD34 (10 ug / ml), CD144 gerichtet ist (1: 300) oder vWF (1: 250) . Siehe Tabelle 1 für weitere Informationen. </li><li> Abwaschen ungebundenen primären Antikörpern für 5 x 10 min mit DPBS. </li><li> Inkubieren Zellen für 1 h bei RT mit dem entsprechenden fluoreszenz-markierten Sekundärantikörper, wie in Tabelle 1 (alle bei einer 1: 200) beschrieben. </li><li> Abwaschen ungebundenen Sekundärantikörper für 5 x 10 min mit DPBS. </li><li> Inkubieren Zellen mit 1 &amp; mgr; g / ml 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in DPBS für 10 min bei RT. </li><li> Wasche die Zellen mit DPBS weitere 3 x 5 min. </li><li> Bildzellen bei 100-facher Vergrößerung mit einem inversen Mikroskop mit einer externen Lichtquelle für die Fluoreszenzanregung ausgestattet, und die Aufnahmen mit einem befestigened Digitalkamera zur nachfolgenden Analyse offline. </li></ol> 8. Einfrieren und Auftauen PBMNCs <ol><li> Am Ende der Stufe 3.2, wird nach der Zentrifugation absaugen Medium und das Zellpellet bei wiederholter Auf- und Abpipettieren mit einer P1000 Pipettenspitze manuell unterbrechen. 1 ml Gefriermedium, 90% Serum und 10% DMSO, achten Sie darauf, vorsichtig mischen, um eine Zellsuspension herzustellen. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine Kryoröhrchen und Einfrieren und Auftauen, wie in Abschnitt 5 beschrieben. </li></ol>

<ol>
	<li>Yancopoulos, G. D., Klagsbrun, M., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenesis,+angiogenesis,+and+growth+factors:+ephrins+enter+the+fray+at+the+border.">Vasculogenesis, angiogenesis, and growth factors: ephrins enter the fray at the border.</a> Cell. 93, 661-664 (1998).</li><li>Flamme, I., Fr&#246;lich, T., Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+vasculogenesis+and+embryonic+angiogenesis.">Molecular mechanisms of vasculogenesis and embryonic angiogenesis.</a> J Cell Physiol. 173, 206-210 (1997).</li><li>Asahara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+putative+progenitor+endothelial+cells+for+angiogenesis.">Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.</a> Science. 275, 964-967 (1997).</li><li>Shi, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+circulating+bone+marrow-derived+endothelial+cells.">Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells.</a> Blood. 92, 362-367 (1998).</li><li>Ormiston, M. L., Deng, Y., Stewart, D. J., Courtman, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+in+the+therapeutic+actions+of+endothelial+progenitor+cells+in+pulmonary+hypertension.">Innate immunity in the therapeutic actions of endothelial progenitor cells in pulmonary hypertension.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 546-554 (2010).</li><li>Hur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+two+types+of+endothelial+progenitor+cells+and+their+different+contributions+to+neovasculogenesis.">Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 288-293 (2004).</li><li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood.">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> J Clin Invest. 105, 71-77 (2000).</li><li>Yoder, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem/progenitor+cell+principals.">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li><li>Toshner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+analysis+reveals+a+specific+HOX+signature+associated+with+positional+identity+of+human+endothelial+cells.">Transcript analysis reveals a specific HOX signature associated with positional identity of human endothelial cells.</a> PLOS ONE. 9, e91334 (2014).</li><li>Toshner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+dysfunction+of+endothelial+progenitors+in+pulmonary+arterial+hypertension.">Evidence of dysfunction of endothelial progenitors in pulmonary arterial hypertension.</a> Am J Respir Crit Care Med. 180, 780-787 (2009).</li><li>Wang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+storage+and+secretion+of+von+Willebrand+factor+in+blood+outgrowth+endothelial+cells+derived+from+patients+with+von+Willebrand+disease.">Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease.</a> Blood. 121, 2762-2772 (2013).</li><li>O'Neill, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+revascularisation+of+ischaemic+tissue:+the+opportunities+and+challenges+for+therapy+using+vascular+stem/progenitor+cells.">Therapeutic revascularisation of ischaemic tissue: the opportunities and challenges for therapy using vascular stem/progenitor cells.</a> Stem Cell Res &amp; Ther. 3, 31 (2012).</li><li>Geti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Practical+and+Efficient+Cellular+Substrate+for+the+Generation+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adults:+Blood-Derived+Endothelial+Progenitor+Cells.">A Practical and Efficient Cellular Substrate for the Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Adults: Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells.</a> Stem Cells TM. 1, 855-865 (2012).</li><li>Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+characterization+of+endothelial+colony+forming+cells+derived+from+human+umbilical+cord+blood.">Phenotypic and functional characterization of endothelial colony forming cells derived from human umbilical cord blood.</a> Journal of Vis Exp: JoVE. , (2012).</li><li>Martin-Ramirez, J., Hofman, M., van den Biggelaar, M., Hebbel, R. P., Voorberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+outgrowth+endothelial+cells+from+peripheral+blood.">Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood.</a> Nat Prot. 7, 1709-1715 (2012).</li><li>Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+large+scale+expansion+of+adult+human+endothelial+colony+forming+progenitor+cells.">Isolation and large scale expansion of adult human endothelial colony forming progenitor cells.</a> Journal of Vis Exp: JoVE. , (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

We present a detailed protocol that allows for the robust and efficient derivation of BOECs from adult peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs). Our protocol includes two important refinements that represent advances on previous methods of BOEC isolation.14-16 These include the absence of heparin in the initial PBMNC culture medium and the use of defined, embryonic stem cell-qualified serum. This latter refinement is of particular importance. Embryonic stem cell (ESC)-qualified serum is a more consistent grade of serum and, although it is not known yet what component(s) are enriched in the serum that benefit BOEC isolation, the impact of this defined serum on the efficiency of BOEC generation is clear in our hands. In addition, we have also had success in isolating BOECs using human serum, thereby allowing for the generation of BOECs for clinical translation. In our hands, this refined protocol results in the successful isolation of stable BOEC cultures from greater than 90% of donors, making it one of the most reliable BOEC generation methods reported thus far. Although the use of particular sera is critical to BOEC generation, it also represents a primary limitation of the current protocol. Future improvements to the technique could include the generation of these cells in serum-free, defined culture conditions.
Critical Steps in the protocol include processing blood samples as soon as possible after collection, complete harvesting of the buffy coat cells after density gradient centrifugation and the timely passaging of initial colonies from P0 to P1. This passaging step is critical to establishment of a stable isolation. Like other endothelial cells, BOECs appear to be very sensitive to plating density. If the plating density after passaging is too low, the BOECs will not proliferate. Conversely, if the colonies are allowed to become overconfluent before passaging, the cells will also cease to proliferate and have the tendency to convert into an elongated, mesenchymal cell phenotype. If few colonies appear from days 7 to 14, or if the colonies are small in size, troubleshooting can include increasing cell density by passaging P0 colonies into a T-25 flask instead of a T-75.
Once the technique is mastered, the resultant BOECs can be used in several applications, including in vitro studies of endothelial cell biology, disease modeling and drug screening, as well as in vivo cell transplantation therapies. An important consideration for the development of any cell therapy process is to use cells that are free from pathogenic mutations. We have previously shown that BOECs isolated using our protocol possess genomes that are free from copy number variations and are thus representative of the individual from which they were collected. In addition, we have also demonstrated that the majority of BOEC-derived iPSC lines are free from copy number variations.13 This contrasts with previous reports of copy number variation in fibroblast-derived iPSCs. To date, these cells remain the only iPSCs for which this degree of genomic fidelity has been reported. This feature is important for the field of iPSC biology and the use of iPSCs in disease modeling, drug screening and future cell transplantation therapies.

Bis vor kurzem wurde die postnatale Generation von neuen Blutgefäßen vermutlich ausschließlich durch einen Prozess bekannt als Angiogenese, definiert als das Sprießen neuer Schiffe von den Endothelzellen der bereits bestehenden Gefäßen auftreten. 1 Dieses Verfahren steht im Gegensatz aus der Vaskulogenese oder die de novo Bildung von Blutgefäßen von endothelialen Vorläuferzellen, die gedacht wurde, um während der Embryogenese ausschließlich auftreten. 2 Allerdings haben neuere Studien identifiziert und isoliert zirkulierenden endothelialen Vorläuferzellen (EPCs) im peripheren Blut von Erwachsenen. Diese Zellen besitzen die Fähigkeit, in der Kultur zu reifen Endothelzellen differenzieren und sind vermutlich in der postnatalen Vaskulogenese zu beteiligen. 3,4 Protokolle für die Isolierung und Expansion dieser EPCs beinhalten üblicherweise die Kultur von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMNC) in Medien, die endotheliale Wachstumsfaktoren, einschließlich vascular endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2. 5-8 EPC Kulturen produzieren eine Vielzahl von stark unterschiedlichen Zelltypen. Anfängliche Kulturen (&lt;7 Tage) sind durch eine Monozyten-Zelltyp, in der Literatur als &quot;früh&quot; EPCs bekannt dominiert. Trotz ihres Namens exprimieren diese Zellen des Monozyten-Marker CD14, negativ für die Vorläufermarker CD34 und exprimieren nur geringe Niveaus der klassischen endotheliale CD31 und VEGF-Rezeptor-2 (VEGFR2). 5 Fortsetzung Kultur führt zu einer sekundären Population von Zellen, erst Auswuchs EPCs oder Blut Auswuchs Endothelzellen (BOECs), die als diskrete Kolonien von Endothel-ähnlichen Zellen erscheinen bekannt. Im Gegensatz zu den monozytären frühen EPCs, BOECs, die auch endotheliale Kolonie-bildenden Zellen (ECFCs), Auswuchs Endothelzellen oder spät Auswuchs Endothelzellen aufgerufen haben, zeigen Sie die Kopfsteinpflastermorphologie, die typisch für endotheliale Zellmonoschichten ist und in Oberflächenmarker sehr ähnlich5 und Genexpression 9 bis Endothelzellen reifen. Die Erzeugung von Endothel-ähnlichen Zellen aus peripherem Blut bietet mehrere Vorteile, insbesondere für die Untersuchung der Endothelzelldysfunktion mit vaskulären Erkrankungen, wie pulmonaler arterieller Hypertonie (PAH) 10 oder von Willebrand-Krankheit. 11 Vor der Verfügbarkeit von BOECs, Endothelzellen assoziiert Zellen konnte nur von verpflanzten Organen zum Zeitpunkt des Todes oder der Organtransplantation oder isolierte aus der Nabelschnurvene Geburts ableiten. Dies reduziert die Verfügbarkeit eine ernsthafte Beschränkung auf das Verständnis der Biologie von endothelialen Zellen von Patienten mit Herzkreislauferkrankungen, sowie die Wechselwirkungen zwischen Endothelzellen und entweder Blutzellen oder Wandzellen. Ferner das Isolieren und Kultivieren einer reinen Population von Endothelzellen aus diesen Quellen ist technisch anspruchsvoll, und die Zellen mit diesen Verfahren abgeleitet zeigen nur eine limited proliferative Kapazität. BOECs bieten daher einen wertvollen Ersatz für die Isolierung und Kultivierung von Patienten stammende primäre Endothelzellen. Zusätzlich zu ihrer in-vitro-Anwendungen sind BOECs potentiell auch in autologe Zelltransplantationstherapien nützlich. Diese Anwendungen sind sowohl Endothelzelltransplantation zur Gefäßneubildung (siehe 12 und Referenzen darin) zu fördern, sowie die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen). 13 BOEC stamm iPSCs können für Krankheit Modellierung verwendet werden und bieten ein enormes Potenzial als Ausgangs Material für die autologe Zelltherapien. BOECs umprogrammieren schneller und mit einem höheren Wirkungsgrad als Haut-Fibroblasten. Außerdem BOECs auch für die Erzeugung von iPS-Zellen, die frei von karyotypischen Anomalien, die ein wesentliches Merkmal jeder Technologie, die sich für translationale Anwendungen sein wird, ist es zu ermöglichen. Die Fähigkeit, iPSCs von einem Patienten eine Blutprobe zu erzeugenlso eliminiert die Notwendigkeit für ein Hautbiopsie und die Erzeugung von Hautfibroblasten, wodurch die Erzeugung von Zellen zur Erleichterung von Patienten mit Wundheilungsstörungen oder sehr jungen. Die unten beschriebenen Protokoll durch genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des National Research Ethics Service Committee (East of England) durchgeführt wird, bietet eine einfache und zuverlässige Methode für die Erzeugung von BOECs mit mehr als 90% Wirkungsgrad aus einem relativ kleinen Volumen (60 ml) aus dem peripheren Blut. Diese Zellen sind stark proliferative und kann wiederholt agiert werden, was zur Erzeugung von Hunderten von Millionen von Zellen aus einer einzelnen Blutprobe.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">For blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL syringe with luer-lok tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19G Surflo Winged Infusion Set</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SV-19BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>E1450</td>
			<td>2 per donor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Martindale Pharmaceuticals</td>
			<td>270541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">For buffy coat isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile wrapped plastic transfer pipettes</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>KC231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turk&#8217;s Solution</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.093E+09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">For cell culture, passaging and freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 Collagen (derived from rat tail)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>35-4236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.02M Acetic Acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td>prepared in reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Medium-2MV 
			(containing Bullet Kit, but not serum)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3202</td>
			<td>Note: It is essential that the medium does not contain heparin.&#160;&#160; 
			Do not use EGM-2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (U.S.), Defined</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>T4174</td>
			<td>Dilute to 1x in PBS prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">For flow cytometric characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated mouse anti-human CD14</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555397</td>
			<td>Mouse IgG1k, Clone: WM59 
			Dilution: 1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated mouse anti-human CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555445</td>
			<td>Mouse IgG1k, Clone: WM59 
			Dilution: 1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse anti-human CD34</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555824</td>
			<td>Mouse IgG1k, Clone: 581/CD34 
			Dilution: 1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated mouse anti-human CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560976</td>
			<td>Mouse IgG1k, Clone: HI30 
			Dilution: 1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;APC-conjugated mouse anti-human VEGFR2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB357A</td>
			<td>Mouse IgG1, Clone: 89106 
			Dilution: 1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated mouse IgG1k isotype control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555748</td>
			<td>Clone: MOPC-21 
			Dilution: 1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse IgG1k isotype control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555751</td>
			<td>Clone: MOPC-21 
			Dilution: 1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse IgG1k isotype control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC002A 
			Dilution: 1:10</td>
			<td>Clone: 11711</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">For immunofluorescent microscopy&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 24-well tissue culture plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-human CD34 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB72271</td>
			<td>Clone 756510, IgG1, use at 10 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal goat anti-human VE-cadherin (CD144)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF938</td>
			<td>Antigen affinity- purified IgG, use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal rabbit anti-human Von Willebrand Factor (vWF)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab154193</td>
			<td>Clone EPSISR15, use at 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Polyclonal, 2 mg/ml, use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>Polyclonal, 2 mg/ml, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-10042</td>
			<td>Polyclonal,&#160; 2 mg/ml, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>use at 1 &#956;g/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

Isolierung von Leukozytenmanschette mononuklearen Zellen von 60 ml Blut in der Regel ergibt 100-150x10 6 Gesamtzahl der weißen Blutkörperchen. Wenn sie in einer einzigen T-75-Kolben ausplattiert, die große Anzahl von Zellen in der nicht-lysierten Zellsuspension macht es schwierig, einzelne anhaftende Zellen zu lösen unter Verwendung von Hellfeldmikroskopie. Wiederholte Medium Veränderungen resultieren im Abstand von nicht-adhärenten Zellen und ermöglichen die Visualisierung der adhärenten Population von monozytären &quot;frühen&quot; EPCs. Am Tag 7 werden die T-75 etwa 7x10 6 dieser länglichen adhärenten Zellen. Von Tag 7 bis 14 sollten Kolonien BOECs innerhalb des Kolbens (2A) angezeigt. Colonies ersten erscheinen als 3 bis 5 benachbarten Zellen. Auswuchs Koloniezahl kann von 1 bis 10 Kolonien pro 60 ml Blut variieren. Allgemeiner jüngeren Spendern (dh 20-25 Jahre alt) dazu neigen, eine größere Anzahl von Auswuchs Kolonien, die auch weiter oben in Kultur erscheinen zu erzeugen.BOECs vermehren sich von diesem zentralen Gruppe von Zellen, um kreisförmige Kolonien, bestehend aus mehreren hundert Zellen zu bilden. Zellen innerhalb dieser Kolonien weisen eine klassische endothelialen Kopfsteinpflastermorphologie. Es ist bevorzugt, um den Durchgang Anfangs Kolonien, wenn sie etwa 1000 Zellen pro Kolonie enthalten. Auswuchs Kolonien zu erreichen in der Regel diese Größe, 7 Tage nachdem ihr ursprüngliches Aussehen in der Kultur. Sobald die ursprünglichen Kolonien werden in einen neuen T-75-Kolben agiert, sollten sie sich vermehren, um eine konfluente Monoschicht (3-5x10 &amp; sup6; Zellen pro Flasche) innerhalb von 5 Tagen oder weniger (2B) zu bilden. In einem kleinen Prozentsatz der Isolierungen (&lt;10%), Auswuchs Kolonien ausbleiben, oder nicht ausreichend nach dieser ersten Passage Schritt vermehren. BOECs, die niedrige Proliferation nach der ersten Passage aufweisen gehen selten auf eine stabile BOEC Isolierungen werden und oft anhalten wuchernden innerhalb von zwei bis drei Passagen. Die Monozyten-EPCs früh innerhalb der BOEC Kulturen enthielten nicht-proliferative und werden typischerweise aus den Kulturen in 1-2 Durchgängen gelöscht wird. Clearance dieser frühen Zellen aufgrund Zelltod, Versagen der frühen Zellen erneut haften nach Passagierung und Verdünnung der nicht-proliferative frühen EPCs mit wiederholte Passagen. Passage 1 Zellen können entweder weiter in Kultur agiert oder unten für eine spätere Verwendung eingefroren werden. Nachdem eine stabile Isolierung erzeugt wird, können die Zellen mit einer Geschwindigkeit von 1 konfluente Kolben auf 3-5 neue T-75-Kolben bis zum Durchgang 8 oder 9, bevor er Ruheagiert werden. Auch hier ist die Zelldichte im gesamten Kultur kritisch. Nach unserer Erfahrung sollte nicht weniger als 750.000 Zellen in einer T-75-Kolben plattiert werden, da niedrigere Zelldichten können Wachstumsstillstand verursachen. Trotz der hohen proliferative Potenzial von BOECs sollten die Zellen auch nicht gestattet, overconfluent werden (dh.,&gt; 5x10 6 Zellen pro Kolben), da dies dazu führen convers<html> Ion BOECs zu einem nicht-proliferativen Phänotyp. Wir schlagen vor, dass jede Zelle markiert als BOEC sollten geeignete Zelloberfläche und die intrazelluläre Färbung für endotheliale Marker angezeigt. Charakterisierung BOECs durch Durchflusszytometrie (Figur 3) oder Fluoreszenzmikroskopie (Figur 4) erzielt werden, nach Anfärbung für typische Endothelzellmarkern. BOECs sind positiv für die endotheliale Oberflächenmarker CD31 und VEGFR2 und negativ für die Monozyten-Marker CD14 und dem pan-Leukozytenmarker CD45. BOECs posess auch Weibel-Palade-Körperchen und damit zum Ausdruck bringen Willebrand-Faktor (vWF) als diskrete, punktförmige zytoplasmatische Färbung. Im Gegensatz zu anderen reifen Endothelzellen-Typen, wie Lungenarterie oder Aorta-Endothelzellen, BOECs auch Ausdruck der Stammvater und Aktivierungsmarker CD34 auf ihrer Oberfläche. ftp_upload / 53.384 / 53384fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1 Schematische Darstellung der BOEC Erzeugungsprotokoll. Periphere mononukleäre Blutzellen werden aus Venenblut durch Dichtegradienten-Zentrifugation isoliert und kultiviert auf Kollagen-beschichteten Platten in endothelialen Wachstumsmedium definiert FBS. BOEC Kolonien innerhalb von 7-14 Tagen der Kultur angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53384/53384fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53384/53384fig2.jpg" /> Abbildung 2. Hellfeldbilder des Vertreters BOEC Kulturen. (A) Outgrowth Kolonien erscheinen in Kulturen zwischen den Tagen 7 und 14 Kolonien als Sammlungen von Endothel-ähnlichen Zellen, die in einer gepflasterten Monolage angeordnet sind und sich vermehren radial von einer zentralen Stelle vorhanden ist. Rund um das Auswachsen Kolonien sind die adhärenten Monocytic Zellen, die in frühen Kulturen machen die überwiegende Mehrheit der Zellen. Diese Zellen, die zuvor als &quot;frühe&quot; endothelialen Vorläuferzellen, haben eine spindelförmige Morphologie und exprimieren das Monozyten-Marker CD14. (B) Im Anschluss an Passagieren, die hoch proliferative BOECs über Kulturen zu nehmen, da die nicht-proliferative Monocytenzellen entweder absterben oder nicht wieder anzubringen, nachdem Passagieren. Maßstabsleiste 250 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53384/53384fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53384/53384fig3.jpg" /> Abbildung 3. Charakterisierung BOECs mittels Durchflusszytometrie. BOECs wurden trypsinisiert und mit Fluoreszenz-konjugierten Isotypkontrolle Antikörper (grau gefüllte Spitze) oder Antikörper gegen spezifische Oberflächenmarker (rote Linie) gerichtete gefärbt. Oberflächenmarker für cytometric Charakterisierungumfassen die hämatopoetischen Marker CD45 und CD14, die endotheliale Marker CD31 und VEGFR2 und die progentior und Endothelzellen Aktivierungsmarker CD34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53384/53384fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53384/53384fig4.jpg" /> Abbildung 4. Immunfluoreszenzfärbung von BOECs für Endothelzellmarkern. Repräsentative Immunfluoreszenzbilder von BOECs immunhistochemisch mit Antikörpern gegen endothelialen Zelloberflächenmarker CD144 gerichtet (VE-Cadherin, oben rechts) und das Blut Glykoprotein von-Willebrand-Faktor (vWF, unten rechts) . Entsprechende Tafeln mit DAPI-Färbung Kern werden links angezeigt. Maßstabsleiste 50 um. für CD144. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53384/53384fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier ein, um zu vergrößern</a>Version dieser Figur.

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood at JoVE.com

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

Generation und Kultur der Blut Outgrowth Endothelzellen aus menschlichen peripheren Blut-

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

generation-culture-blood-outgrowth-endothelial-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Biology

18.9K Aufrufe.  University of Cambridge. This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

Serie: Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

Anreicherung von NK-Zellen aus menschlichem Blut mit der RosetteSep Kit von StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

Forschung

Biologie

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolierung und Kultivierung von pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) were first identified in adult human peripheral blood by Asahara et al. in 1997 2 bringing an infusion of new hypotheses and strategies for vascular regeneration and repair. EPCs are rare but normal components of circulating blood that home to sites of blood vessel formation or vascular remodeling, and facilitate either postnatal vasculogenesis, angiogenesis, or arteriogenesis largely via paracrine stimulation of existing vessel wall derived cells3. No specific marker to identify an EPC has been identified, and at present the state of the field is to understand that numerous cell types including proangiogenic hematopoietic stem and progenitor cells, circulating angiogenic cells, Tie2+ monocytes, myeloid progenitor cells, tumor associated macrophages, and M2 activated macrophages participate in stimulating the angiogenic process in a variety of preclinical animal model systems and in human subjects in numerous disease states4, 5. Endothelial colony forming cells (ECFCs) are rare circulating viable endothelial cells characterized by robust clonal proliferative potential, secondary and tertiary colony forming ability upon replating, and ability to form intrinsic in vivo vessels upon transplantation into immunodeficient mice6-8. While ECFCs have been successfully isolated from the peripheral blood of healthy adult subjects, umbilical cord blood (CB) of healthy newborn infants, and vessel wall of numerous human arterial and venous vessels 6-9, CB possesses the highest frequency of ECFCs7 that display the most robust clonal proliferative potential and form durable and functional blood vessels in vivo8, 10-13. While the derivation of ECFC from adult peripheral blood has been presented14, 15, here we describe the methodologies for the derivation, cloning, expansion, and in vitro as well as in vivo characterization of ECFCs from the human umbilical CB.

Endothelial colony forming cells (ECFCs) are circulating endothelial cells with robust clonal proliferative potential that display intrinsic in vivo vessel forming ability. Phenotypic and functional characterization of outgrowth endothelial cells derived from CB are important to identify and isolate bona fide ECFCs for potential clinical application in repairing damaged tissues.

Phänotypische und funktionelle Charakterisierung von Endothelial Kolonie-bildenden Zellen aus humanem Nabelschnurblut

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

Generation of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit dem STEMCCA Lentivirusvektor

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs are protected from degradation by sequestration in small vesicles called exosomes. Exosomes can fuse with the plasma membrane resulting in the transfer of RNA and proteins to the target cell. Their biological functions include immune response, antigen presentation, and intracellular communication. Delivery of miRNAs that can regulate gene expression in the recipient cells via blood has opened novel avenues for target intervention. In addition to offering a strategy for delivery of drugs or RNA therapeutic agents, exosomal contents can serve as biomarkers that can aid in diagnosis, determining treatment options and prognosis.	Here we will describe the procedure for quantitatively analyzing miRNAs and messenger RNAs (mRNA) from exosomes secreted in blood and cell culture media. Purified exosomes will be characterized using western blot analysis for exosomal markers and PCR for mRNAs of interest. Transmission electron microscopy (TEM) and immunogold labeling will be used to validate exosomal morphology and integrity. Total RNA will be purified from these exosomes to ensure that we can study both mRNA and miRNA from the same sample. After validating RNA integrity by Bioanalyzer, we will perform a medium throughput quantitative real time PCR (qPCR) to identify the exosomal miRNA using Taqman Low Density Array (TLDA) cards and gene expression studies for transcripts of interest.	
 These protocols can be used to quantify changes in exosomal miRNAs in patients, rodent models and cell culture media before and after pharmacological intervention. Exosomal contents vary due to the source of origin and the physiological conditions of cells that secrete exosomes. These variations can provide insight on how cells and systems cope with stress or physiological perturbations. Our representative data show variations in miRNAs present in exosomes purified from mouse blood, human blood and human cell culture media.	
 Here we will describe the procedure for quantitatively analyzing miRNAs and messenger RNAs (mRNA) from exosomes secreted in blood and cell culture media. Purified exosomes will be characterized using western blot analysis for exosomal markers and PCR for mRNAs of interest. Transmission electron microscopy (TEM) and immunogold labeling will be used to validate exosomal morphology and integrity. Total RNA will be purified from these exosomes to ensure that we can study both mRNA and miRNA from the same sample. After validating RNA integrity by Bioanalyzer, we will perform a medium throughput quantitative real time PCR (qPCR) to identify the exosomal miRNA using Taqman Low Density Array (TLDA) cards and gene expression studies for transcripts of interest.
 These protocols can be used to quantify changes in exosomal miRNAs in patients, rodent models and cell culture media before and after pharmacological intervention. Exosomal contents vary due to the source of origin and the physiological conditions of cells that secrete exosomes. These variations can provide insight on how cells and systems cope with stress or physiological perturbations. Our representative data show variations in miRNAs present in exosomes purified from mouse blood, human blood and human cell culture media

The presence of stable microRNAs (miRNAs) in exosomes has generated immense interest as a novel mode of intercellular communication, for their potential utility as biomarkers and as a route for therapeutic intervention. Here we demonstrate exosome purification from blood and culture media followed by quantitative PCR to identify miRNAs being transported.

Reinigung und microRNA Profiling von Exosomen aus Blut und Kultur Medien Abgeleitet

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs  are protected from degradation by sequestration in small vesicles called  ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

Effiziente iPS Zellgeneration aus Blut Mit Episomen und HDAC-Inhibitoren

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Zwei-Photonen-Imaging von intrazellulären Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Transport- und Stickoxid-Produktion in Endothelzellen und glatte Muskelzellen eines isolierten Rattenaorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

Immunofluoreszenz-Analyse von endogener und exogener Zentromer-Proteine ​​kinetochore

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived microvesicles (MVs, diameter &#62; 100 nm) is a fundamental cellular process that occurs in all living cells. These vesicles transport proteins, lipids and nucleic acids specific for their cell of origin and in vitro studies have highlighted their importance as mediators of intercellular communication. EVs have been successfully isolated from various body fluids and especially EVs in blood have been identified as promising biomarkers for cancer or infectious diseases. In order to allow the study of MV subpopulations in blood, we present a protocol for the standardized isolation and characterization of MVs from peripheral blood samples. MVs are pelleted from EDTA-anticoagulated plasma samples by differential centrifugation and typically possess a diameter of 100 - 600 nm. Due to their larger size, they can easily be studied by flow cytometry, a technique that is routinely used in clinical diagnostics and available in most laboratories. Several examples for quality control assays of the isolated MVs will be given and markers that can be used for the discrimination of different MV subpopulations in blood will be presented.

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

Isolierung und Charakterisierung von Mikrovesikeln aus peripherem Blut

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like pressure or mechanical perturbations. Mechanoreceptors detect their stimuli and transmit signals via a great diversity of mechanisms. Some of the most common roles for mechanoreceptors are in neuronal responses, like touch and pain, or hair cells which function in balance and hearing. Mechanosensation is also important for cell types which are regularly exposed to shear stress such as endothelial cells, which line blood vessels, or blood cells which experience shear in normal circulation. Viscometers are devices that detect the viscosity of fluids. Rotational viscometers may also be used to apply a known shear force to fluids. The ability of these instruments to introduce uniform shear to fluids has been exploited to study many biological fluids including blood and plasma. Viscometry may also be used to apply shear to the cells in a solution, and to test the effects of shear on specific ligand-receptor pairs. Here, we utilize cone-plate viscometry to test the effects of endogenous levels of shear stress on platelets treated with antibodies against the platelet mechanosensory receptor complex GPIb-IX.

We describe an in-solution method to apply uniform shear to platelet surface receptors using cone-plate viscometry. This method may also be used more broadly to apply shear to other cell types and cell-fragments and need not target a specific ligand-receptor pair.

Ein Uniform Shear Assay für menschliche Platelets und Zelloberflächen per Cone-plate Viscometry

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like ...