Name: bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink
Uploaded: 2016-04-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink at JoVE.com

המחברים בתודה להכיר במימון הסוכנות הפחתת האיום הביטחון (DTRA) תחת שטח וחיל הים Warfare מערכות מרכז השקט (PACIFIC SSC) חוזה מס N6601-13-C-2027. פרסום חומר זה אינו מהווה אישור על ידי הממשלה של ממצאים או מסקנות בזאת.

1. פורמולציות Bioink הידרוג&#39;ל והכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לספק פרופילים ביוכימיות רקמות ספציפיות, להכין רקמות ספציפיות ECM לעכל פתרונות כפי שתוארו לעיל עבור כבד. 20 הערה: באופן כללי, זה ECM לעכל יהוו 40% מנפח bioink הידרוג&#39;ל הסופי כי הוא מועסק. כמה מאות מיליליטרים של פתרון ECM לעכל יכול להיות מוכן, aliquoted, קפוא ב -80 ° C לשימוש עתידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הידרוג&#39;ל ניסוח, להמיס photoinitiator, 2-הידרוקסי-4 &#39;- (2-hydroxyethoxy) -2-methylpropiophenone, במים ברמה של 0.1% w / v. הערה: כרכים בטווח 50-100 מ&quot;ל ניתן להכין מראש ולאחסן מוגן מפני אור על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור bioinks הידרוג&#39;ל, ראשון לפרק את מרכיבי חומר בסיס מן החומצה ההיאלורונית הערכות הידרוג&#39;ל (HA) בפתרון המים photoinitiator. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את הג&#39;לטין HA ו thiolated thiolated בנפרד במים-pפתרון hotoinitiator (שלב 1.2) לעשות 2% w / פתרונות v. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים diacrylate פוליאתילן גליקול (PEGDA), את crosslinker ב ערכות הידרוג&#39;ל, בתמיסה במים photoinitiator (שלב 1.2) כדי להפוך פתרון 8% w / v. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממסי פוליאתילן גליקול (PEG) אלקין 8-Arm (10 kDa MW) בתמיסת מי photoinitiator (שלב 1.2) כדי להפוך פתרון 8% w / v. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן כללי, ליצור הידרוג באמצעות הסכימה הבאה, אם כי התאמה אישית נוספת אפשרית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 4 חלקים 2% thiolated HA, 4 חלקים ג&#39;לטין 2% thiolated, 1 חלק crosslinker 1, 1 חלק crosslinker 2 עם פתרון ECM 8 חלקים רקמות התקשורת והתרבות 2 חלקים hepatocyte (HCM) (או 10 חלקים מים כמו-רקמות שאינן גנריות הידרוג&#39;ל -specific). הערה: נוסף ללא שינוי HA או ג&#39;לטין ניתן להוסיף כדי להפוך את extrude bioink בצורה חלקה יותר. זה מתואר להלן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס את התערובת וכתוצאה מכך על גבוהה (מהירות 10 מתוך 10) במשך 10 שניות כדי לערבב לפני השימוש. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש הידרוג&#39;ל bioink <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור שחול או בדיקות bioprinting, להעביר את התערובת לתוך מחסנית מזרק או מדפסת ולאפשר לו crosslink ספונטני למשך 30 דקות (crosslinking שלב 1) על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מדידות rheological, להעביר את התערובת לתוך צלחת פטרי 35 מ&quot;מ ולאפשר לו crosslink למשך 30 דקות. הערה: התערובת מייד מתחילה crosslink דרך היווצרות קשר תיאול-acrylate תתחיל להגדיל צמיגות. התערובת צריכה להיות מועברת מזרק, מחסנית הדפסה, או מיקום היעד בתוך 10 דקות כדי למנוע סתימת פיפטה או מזרק במהלך העברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר crosslinking המשנית (שלב 2) היא רצויה, מקרין את הבמה 1-crosslinked הג&#39;לי עם אור אולטרה סגול (365 ננומטר, 18 W / 2 סנטימטר) ליזום תגובת פילמור אלקין-תיאול. הערה: משך ההקרנה תלוי שטח הפנים של החומר. באופן כללי, סנטימטר מרובע של חומר רק דורש 12 שניות של חשיפה UV בהספק UV זה. </li></ol></li></ol> 2. בדיקת תאימות מדפסת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני בדיקות אינטגרציה עם מכשירי bioprinting, מאפייני שחול מבחן על ספסל המעבדה עם בדיקות שחול פשוטות באמצעות מזרקים סטנדרטיים טיפי מחט מד קטנים (20-30 מד). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחוף את bioink באמצעות מזרק סטנדרטי להשיג חוטים מעוקמים בצורה חלקה של הידרוג&#39;ל עם מעט או ללא בליטות. לשיחול של קווים או דפוסים פשוטים מספיק כדי לקבוע את מידת ההצלחה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשילוב bioprinter, לטעון bioink ההכנות ידי pipetting אותם לתוך דיו למדפסת, ולאפשר 30 דקות עבור bioink לעבור crosslinking שלב 1 ספונטנית בתוך המחסנית. הערה: נפח של bioink תלוי ביישום הספציפי צריך להיקבע על ידי המשתמש. מחסניות מדפסת עשויות להיות דומות או להיות מזרקים התואמים את מכשיר bioprinter. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת תאימות שחולעבור bioprinting ידי הדפסת דפוס פשוט באמצעות bioink. לדוגמה, להדפיס דפוס 7 x 7 מ&quot;מ המורכב של קווים מקבילים. החל הלחץ (למשל, 20 kPa לחץ פנאומטי) ואילו ראש ההדפסה זז במישור XY במהירות של כ 300 מ&quot;מ / דקה. הערה: בקטרי זרבובית ראש הדפסה בגדלים שונים ניתן להשתמש, אך חרירי חרוטים עם פתחים בקוטר 400-500 מיקרומטר הם אופטימליים עבור הדפסת spheroids בטווח 250-350 מיקרומטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם החומרים מעוקמים הם גבשושיים או לא סדירים, ראה שלב 2.4, או להפחית את כמות PEGDA כדי לרכך את חומר crosslinked שלב 1. כראוי ניסוחי bioink מוכנים extrude חלק, המאפשרים בתצהיר מדויק בדפוסים רצויים או ארכיטקטורות. הערה: ההליכים bioprinting והשימוש בו המתוארים מכשיר מותאם אישית 3-D bioprinting נועד בבית במיוחד עבור רקמות לבנות הדפסה 32 כפרמטרים הדפסה כגון, הספציפיים משתנים באופן דרמטי עבור כל סוג של מכשיר ודורשים כיול.g על ידי המשתמש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשפר את תכונות שחול, להשלים ללא שינוי HA ו ג&#39;לטין אל bioinks (1.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו -30 מ&quot;ג / מ&quot;ל, בהתאמה). </li></ol> 3. אימות ידי Bioprinting עם בונה כבדה ראשונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 3-D spheroids הכבד תא ראשוני בתליית שיטות ירידה כמרכיב הסלולר 33 הערה: Bioprinting יכול להתבצע ללא spheroids, אבל במקום עם תאים בודדים המרחפים bioinks הידרוג&#39;ל גם כן. Spheroids מועסקים כאן כדי להאיץ אינטראקציות תאים תאים ולבנות פונקציונליות. מספר spheroids או התאים מועסקים תלוי ביישום הספציפי צריך להיקבע על ידי המשתמש. פעולות אלה אמורות להתבצע בתנאים סטריליים, באמצעות אספקה ​​סטרילית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן HCM על ידי הוספת התוכן המופשר של ערכת רכיב תוספת HCM לתקשורת הבזליים hepatocyte (HBM) וסינון סטרילי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשרת un רכיבי תוספתtil נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את הרכיבים תוספת (חומצה אסקורבית, 0.5 מ&quot;ל; אלבומין בסרום שור [חומצות השומן החופשיות], 10 מ&quot;ל; גנטמיצין B סולפט / amphotericin, 0.5 מ&quot;ל; הידרוקורטיזון 21-hemisuccinate, 0.5 מ&quot;ל; אינסולין, 0.5 מ&quot;ל; גורם הגדילה באפידרמיס אנושי רקומביננטי , 0.5 מ&quot;ל; העברת, 0.5 מ&quot;ל) ל -500 מ&quot;ל HBM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינון סטרילי דרך פילטר מיקרומטר 0.45 מיקרומטר או 0.22 באמצעות יחידת מסנן בקבוק העליונה או מסנן קצה המזרק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את צפיפות התאים של hepatocytes אדם מן המעלה הראשונה, תאים Kupffer, ותאי stellate ידי ספירת על hemocytometer לאחר כל סוג תא הופשר פי הוראות היצרנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב hepatocytes אדם מן המעלה הראשונה, תאים Kupffer, ותאי stellate המאופיינים ביחס 80:10:10 על ידי מספר הסלולרי במדיה HCM כי כבר חימם עד 37 מעלות צלזיוס צינור חרוטי. הערה: היקף בתקשורת לשמש תלוי את מספר הסלולרי הכולל ספציפי לבקשה צריך להיקבע על ידי הדואר אלקטרוני למשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה השעית התא במשך 5 דקות ב 520 XG ב 20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant, משאירים מאחור את התא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה בתקשורת HCM להניב ההשעיה תא המכיל 1,000 תאים לכל 40 מדיה μl. הנפח הכולל תלוי במספר spheroids שיופק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה תא צלחות Drop Hanging בפורמט 96-היטב. להוסיף סך של כ 1,000 תאים לכל היטב HCM ולשמור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 3 ימים שבמהלכה יוצר spheroids רב-תאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף spheroids הכבד מהצלחת Drop Hanging באמצעות pipettor. מעבירים צינור חרוטי 15 מ&quot;ל סטרילי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> spheroids הכבד Bioprint ב bioink הידרוג&#39;ל הכבד ספציפי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן גיבוש bioink הידרוג&#39;ל ECM המכיל כבד כמתואר שלב 1, העסקת 8% PEGDA ו -8% 8-Arm אלקין PEG כפי crosslinkers. השתמש השילוב הזה עבור היכולת שלה resulting בתוך הידרוג&#39;ל קרוב מודולוס אלסטיות גזירת רקמת כבד ילידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן spheroids ליישב לתחתית של צינור החרוטים שבו הם הונחו שלב 3.1.7. זה משתנה בהתאם לגודל וצפיפות אליפטית, אך בדרך כלל מתרחש בתוך 1-2 דקות. הסר את כל התקשורת על ידי aspirating או עם pipettor בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את העוצמה הרצויה של פתרון הידרוג&#39;ל bioink מוכן טרי אל צינור חרוטי המכיל את spheroids. באופן כללי, נפח מתאים הוא 10% -25% יותר מאשר הנפח של לבנות 3-D המיועד להדפסה. בזהירות פיפטה מעלה ומטה כדי resuspend הספרואידים בפתרון הידרוג&#39;ל bioink. מעבירים מחסנית bioprinter באמצעות pipettor או פיפטה סרולוגיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך המחסנית bioprinter, לאפשר הפתרון לעבור לשלב crosslinking הראשון (התגובה תיאול-acrylate) למשך 30 דקות. הערה: בהתאם לגודל אליפטית, המחסנית ייתכן שתהיה צורך לאט לסובב או התוכן ייתכן שיהיה צורך מהולמרית סטרילי כדי לשמור על spheroids מופצים ברחבי bioink במהלך crosslinking שלב 1. זהו פחות של הכרח bioinks מוכן עם תאים מושעים במקום spheroids. הערה: בעקבות crosslinking שלב 1, למשתמשים יש חלון הפעלה של כמה שעות. עם זאת, מומלץ לבצע את תהליך bioprinting במהירות כדי לשפר את כדאיות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות crosslinking שלב 1, השתמש בהתקן bioprinting ליצור מבנים הידרוג&#39;ל רצויים המכילים את spheroids הכבד הראשוני (או תאים אחרים). הערה: טכנולוגיה זו מספקת מערכת biofabricating מגוון רחב של מבנים. פרמטרים כגון נפח הכולל, מספר התאים או spheroids, גיאומטרית המבנה המודפסת, ואת מצע שעליו בונה מודפסות הם תלויים במידה רבה על המטרות של המשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בתצהיר לתוך התצורה המבוקשת, לנהל אור UV למשך 2-4 שניות כדי להפעיל את מנגנון crosslinking המשני, ייצוב השיתוףnstructs וקשיחות הגדלה לרמה הרצויה. הערה: ריכוז-אלקין PEG, ובכך צפיפות crosslinking הסופית הכוללת, בעיקר שולטת קשיחות המבנה הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 3.2.4 ו 3.2.5 כדי ליצור מבנים רבים-שכבתיים. </li></ol></li></ol>

המחברים אין לחשוף.

ישנם מספר מרכיבים חיוניים שכדאי להביא בחשבון כאשר מנסים biofabricate בונה רקמות 3-D, לשימוש עתידי בבני אדם או עבור יישומים ההקרנה חוץ גופית. העסקת מרכיבים תאיים המתאים קובע את הפונקציונליות הפוטנציאל בסופו של דבר, כאשר המכשיר biofabrication עצמו קובע את המתודולוגיה הכללית לה...

בשנים האחרונות, במגוון טכנולוגיות הפך זמין מתייחס לצורך המקורות חלופיים של איברים ורקמות תפקודיים על ידי המבקש לייצר, או biofabricate, אותם. Bioprinting התפתחה כאחד המבטיחים ביותר של טכנולוגיות אלה. Bioprinting יכול להיחשב כסוג של ייצור כתוסף רובוטית של חלקים ביולוגי, שניתן להשתמש בהם כדי לבנות או מבנים איבר דמוי או מרקמה דמוית דפוס קיימא ב 3 מימדים. 1 ברוב המקרים, bioprinting מעסיקה 3-ממדי (3 -D) תקן ההדפסה כי היא נוהלה על ידי מחשב להפקיד תאים וחומרים ביולוגיים לעמדות מדויקות, ובכך משחזרים ארכיטקטורות פיסיולוגיות-מחק אנטומית. 2 התקנים אלה להדפיס &quot;bioink&quot;, אשר יכול ללבוש הצורה של אגרגטים תא, תאים גלומים הידרוג או ונוזלים צמיגים, או microcarriers תא זרע, כמו גם פולימרים ללא תאים המספקים מבנה מכאני או לפעול PLA תא ללאceholders. 3,4 בעקבות תהליך bioprinting, המבנה וכתוצאה מכך ניתן התבגר לתוך מבנים רקמה או איבר פונקציונלי, ומשמש ליישום הסוף המיועד. 5,6 עד כה, איבר אנושי בגודל תפקודי מלא לגמרי לא הודפס, אבל זה נשאר המטרה ארוכת הטווח העיקרית של bioprinting מחקר ופיתוח. 2 עם זאת, בקנה מידה קטן &quot;organoid&quot; בונה רקמות מיושמים כיום מספר יישומים, כולל מודלים פתולוגיה, פיתוח תרופות, והקרנת טוקסיקולוגיה. אחד המכשולים העיקריים כי חוקרים נתקלו ביישום טכנולוגית bioprinting הוא כי חומרים מעטים פותחו לצורך bioprinting המפורש. כדי להצליח ביעילות bioprinting, ביולוגי חייבים לעמוד 4 דרישות בסיסיות. ביולוגי צריך להיות 1) תכונות מכניות שראוי לאפשר בתצהיר (אם זה שחול דרך נחיר כג&#39;ל או אניnkjet כמו טיפה), 2) את היכולת להחזיק את צורתו כמרכיב של מבנה 3-D לאחר בתצהיר, 3) את היכולת למשתמש שליטה של ​​2 המאפיינים המוקדמים, ו 4) סביבה ידידותית ותומכת תא בכלל שלבי הליך bioprinting. 7 הסטוריים, bioprinting עבודה ניסו לעתים קרובות להעסיק biomaterials המסורתי קיים במכשירי bioprinting ללא תמורה עבור התאימות שלהם, במקום בעיצוב ביולוגי יש את המאפיינים דרושים bioprinting ויישומים שלאחר ההדפסה הבאות. מגוון bioinks פותח לאחרונה ממשק טוב יותר עם החומרה בתצהיר ייצור. מערכות הידרוג&#39;ל תקן מציבות בעיות משמעותיות משום שהם קיימים בדרך כלל כמו גם מבשרים פתרונות נוזלים עם תכונות מכאניות מספיק, או הידרוג&#39;ל polymerized שאם מודפס יכול לסתום פיות או להיות שבור על תהליך שהחול. הצוות שלנו, כמו גם וטיהורrs, בחן ניסוחים הידרוג&#39;ל שונים כדי לטפל בבעיות bioprinting אלה, כולל הדפסת אליפטית תא לתוך מצעים הידרוג&#39;ל, 5,8 תא נימת הידרוג&#39;ל שחל משפופרות microcapillary, 9-11 חומצה היאלורונית extrudable (HA) הידרוג ננו-חלקיקי -gold עם תכונות crosslinking דינמיות , 12 שליטה זמנית של קשיחות הידרוג&#39;ל באמצעות photopolymerizable methacrylated HA ו ג&#39;לטין, 13 crosslinking פיברינוגן מבוסס-תרומבין, 14,15 ג&#39;ל אלגינט-קולגן חליפין יוניים, 16 ואור אולטרה הסגול polymerizing המהירה לאחרונה (UV) crosslinking -initiated, 17 דוגמאות אלה להוכיח את ההיתכנות של חומרים ליצירה שיכולה ידי bioprinted ביעילות. עם זאת, בנוסף לאינטגרציה עם חומרה, כדי ליצור קיימא ופונקציונלי 3-D רקמה בונה בהצלחה, בביו-חומרים חייבים לכלול רמזי ביוכימיים מכנים מסייעות בשמירה הסלולרכדאיות ותפקוד. גורמים נוספים אלה, פרופילי ביוכימיות מכאניים, יכולים להיות השפעה משמעותית על התפקוד המוצלח של מבני רקמות bioprinted. שני התאים ואת תאי מטריקס הילידים (ECM) אחראי הצגת מגוון רחב של מולקולות איתות כגון גורמי גדילה וציטוקינים אחרים לתאים אחרים. השילוב של אותות אלה משתנה בין רקמה לרקמה, אבל יכול להיות מאוד חזק ובעל השפעה בויסות התנהגות תאים ורקמות. 18 העסקת רכיבי ECM ספציפי רקמות מאיברים שונים ויישום בתור הידרוג&#39;ל או כחלק הידרוג&#39;ל נחקר עם הצלחה. 19-21 גישה זו, אשר מורכבת decellularizing רקמה נתון, מפוררת את זה, ואת פירוקה, שניתן להשתמש בהם כדי לייצר אותות ביוכימיים רקמות ספציפיות מכל רקמות ניתן לשלב בונה הידרוג&#39;ל 3-D. 22 בנוסף,שהיא מתועדת בהרחבה כי ורקמות בגוף לכבוש מגוון רחב של stiffnesses. 23 ככזה, את היכולת לכוון את התכונות המכאניות של חומרים ביולוגיים, כגון E מודולוס אלסטיות &#39;או ז מודולוס אלסטיות גזירה&#39;, הוא כלי שימושי בהנדסת רקמות . כפי שתואר לעיל, שליטה על תכונות מכאניות bioink מאפשרת biofabrication שחול מבוסס באמצעות ג&#39;ל רך, אז מה שיכול להשפיע עוד יותר על ידי crosslinking המשנית בשלב מאוחר יותר, שבו רמות מודולוס אלסטיות ניתן להשיג שתואמות מן סוג איבר המטרה. לדוגמא, חומרים ביולוגיים יכולים להיות מותאמים אישית כדי להתאים נוקשות של 5-10 kPa כמו כבד ילידים, 23 או להתאים נוקשות של 10-15 kPa כמו ברקמת לב ילידים, 24,25 בתאורית הגדלת היכולת של organoids אלה לתפקד באופן דומה עמיתיהם רקמות מולדתם. ההשפעה של קשיחות הסביבה על פנוטיפ התא כבר explored בשנים האחרונות, במיוחד ביחס לתאי גזע. אנגלר et al. מפגין גמישות המצע כי סייעה נהיגה בתאי גזע mesenchymal (MSC) כלפי שושלות עם גמישות רקמת ההתאמה של המצע. 25 רעיון זה נחקר נוסף לבידול לתוך שריר, תפקוד לב, פנוטיפ הכבד, התפשטות תאי גזע hematopoietic , ותחזוקה של פוטנציאל הטיפולי של תאי גזע. 24,26-29 יכולת לכוון הידרוג&#39;ל כדי moduli אלסטי השונה היא תכונה חשובה של ביולוגי אשר ישמש כדי biofabricate בונה רקמות. 30 כאן אנו מתארים פרוטוקול מייצג גישה תכליתית המשמשת במעבדה שלנו לגבש מערכת הידרוג&#39;ל שניתן שחול bioprinted, והוא מותאם אישית כדי 1) מכיל את הפרופיל הביוכימי של סוג רקמה מסוים ו -2) לחקות את מודולוס האלסטיות מסוג זה רקמה . על ידי טיפול בדרישות אלה, אנו שואפים provide חומר שיכול לשחזר את מאפייני physiochemical וביולוגיים של in vivo רקמה. 31 המערכת מרוכבי הידרוג&#39;ל מודולרית המתוארת כאן מנצלת בגישה רבה-crosslinking להניב bioinks extrudable, ומאפשרת crosslinking משני לייצב ומגבירה את הנוקשות של מוצרי קצה להתאים מגוון של סוגי רקמות. התאמה אישית ביוכימיים מתקיימת באמצעות רכיבי ECM רקמות ספציפיות. כמו הפגנה, אנו מעסיקים מגוון כבד ספציפית של מערכת הידרוג&#39;ל זה bioprint בונה organoid כבד פונקציונלי. הפרוטוקול המתואר משתמש במכשיר bioprinting מותאם אישית 3-D. באופן כללי, פרוטוקול זה ניתן להתאים רוב המדפסות מבוססות שחול, פרמטרי הדפסה ספציפיים להשתנות באופן דראמטי עבור כל סוג של מכשיר ודורשים בדיקה על ידי המשתמש.

<table><tbody><tr><td>Hyaluronic acid</td><td>Sigma</td><td>53747</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G6144</td><td></td></tr><tr><td>2-Hydroxy-4&amp;prime;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td><td>Sigma</td><td>410896</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP)</td><td>ESI-BIO</td><td>GS315</td><td>Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA)</td></tr><tr><td>PEG 8-Arm Alkyne, 10&amp;nbsp;kDa</td><td>Creative PEGWorks</td><td>PSB-887</td><td></td></tr><tr><td>Primary human hepatocytes</td><td>Triangle Research Labs</td><td>HUCPM6</td><td></td></tr><tr><td>Primary human liver stellate cells</td><td>ScienCell</td><td>5300</td><td></td></tr><tr><td>Primary human Kupffer cells</td><td>Life Technologies</td><td>HUKCCS</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Basal Media (HBM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3199</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Media Supplement Kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3198</td><td>HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5&amp;nbsp;ml; bovine serum albumin [fatty acid free], 10&amp;nbsp;ml; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5&amp;nbsp;ml; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5&amp;nbsp;ml; insulin, 0.5&amp;nbsp;ml; human recombinant epidermal growth factor, 0.5&amp;nbsp;ml; transferring, 0.5&amp;nbsp;ml)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Other manufacturers are ok.</td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide</td><td>Fischer Scientific</td><td>A669</td><td>Other manufacturers are ok.</td></tr><tr><td>Fresh porcine cadaver tissue</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Freezer mill</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Bioprinter</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials.</td></tr><tr><td>Hanging drop cell culture plate</td><td>InSphero</td><td>CS-06-001</td><td>InSphero GravityPlus 3D Culture Platform</td></tr></tbody></table>

bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

כאשר ההליכים המתוארים לעיל הוא אחריו בצורה נכונה, הידרוג צריך להכיל פרופיל ביוכימיים ספציפי לסוג רקמת היעד, 20 לאפשר רמה גבוהה של שליטה על bioprinting מודולוס אלסטיות סופי, 34 ולתמוך תאים פונקציונליים קיימא בונת רקמות. <p class="jove_content" fo:keep-together.w...

Watch this Scientific Journal Video about Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink at JoVE.com

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized בונה בעזרת רקמות ספציפיות הידרוג&#39;ל Bioink

אנו מתארים קבוצה של פרוטוקולים שמאפשרים bioink הידרוג&#39;ל המחקים רקמות שבה פונקציונלי קיימא בונה רקמות 3-D ניתן bioprinted לשימוש ביישומי הקרנה במבחנה.

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

bioprinting-cellularized-constructs-using-tissue-specific-hydrogel

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.7K Views.  Wake Forest Univeristy Health Sciences.  אנו מתארים קבוצה של פרוטוקולים שמאפשרים bioink הידרוג'ל המחקים רקמות שבה פונקציונלי קיימא בונה רקמות 3-D ניתן bioprinted לשימוש ביישומי הקרנה במבחנה. 

Video: Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture

Bioprinting is an emerging technology that has its origins in the rapid prototyping industry. The different printing processes can be divided into contact bioprinting1-4 (extrusion, dip pen and soft lithography), contactless bioprinting5-7 (laser forward transfer, ink-jet deposition) and laser based techniques such as two photon photopolymerization8. It can be used for many applications such as tissue engineering9-13, biosensor microfabrication14-16 and as a tool to answer basic biological questions such as influences of co-culturing of different cell types17. Unlike common photolithographic or soft-lithographic methods, extrusion bioprinting has the advantage that it does not require a separate mask or stamp. Using CAD software, the design of the structure can quickly be changed and adjusted according to the requirements of the operator. This makes bioprinting more flexible than lithography-based approaches.
Here we demonstrate the printing of a sacrificial mold to create a multi-material 3D structure using an array of pillars within a hydrogel as an example. These pillars could represent hollow structures for a vascular network or the tubes within a nerve guide conduit. The material chosen for the sacrificial mold was poloxamer 407, a thermoresponsive polymer with excellent printing properties which is liquid at 4 &deg;C and a solid above its gelation temperature ~20 &deg;C for 24.5% w/v solutions18. This property allows the poloxamer-based sacrificial mold to be eluted on demand and has advantages over the slow dissolution of a solid material especially for narrow geometries. Poloxamer was printed on microscope glass slides to create the sacrificial mold. Agarose was pipetted into the mold and cooled until gelation. After elution of the poloxamer in ice cold water, the voids in the agarose mold were filled with alginate methacrylate spiked with FITC labeled fibrinogen. The filled voids were then cross-linked with UV and the construct was imaged with an epi-fluorescence microscope.

A bioprinter was used to create patterned hydrogels based on a sacrificial mold. The poloxamer mold was backfilled with a second hydrogel and then eluted, leaving voids which were filled with a third hydrogel. This method uses fast elution and good printability of poloxamer to generate complex architectures from biopolymers.

הדפסת תבניות היפוך Thermoresponsive ליצירת בדוגמת הידרוג דו רכיבים-תרבות תאי 3D

Bioprinting is an emerging technology that has its origins in the rapid prototyping industry. The different printing processes can be divided into contact ...

Immunology and Infection

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

כדאיות של מבנים ניידים Bioprinted באמצעות מדפסת הקרטזיאני Dispenser שלוש

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using an automated robotic dispensing system. The particular bioink was selected as it allows cells to sediment towards and sense the features. The dispensing system bioprints viable cells in hydrogel bioinks using a backpressure assisted print head. However, by replacing the print head with a sharpened stylus or scalpel, the dispensing system can also be employed to create topographical cues through surface etching. The stylus movement can be programmed in steps of 10 &#181;m in the X, Y and Z directions. The patterned grooves were able to orientate mesenchymal stem cells, influencing them to adopt an elongated morphology in alignment with the grooves&#39; direction. The patterning could be designed using plotting software in straight lines, concentric circles, and sinusoidal waves. In a subsequent procedure, fibroblasts and mesenchymal stem cells were suspended in a 2% gelatin bioink, for bioprinting in a backpressure driven extrusion printhead. The cell bearing bioink was then printed using the same programmed coordinates used for the etching. The bioprinted cells were able to sense and react to the etched features as demonstrated by their elongated orientation along the direction of the etched grooves.

This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

טכניקת Dispensing רובוטיות אוטומטית להכוון משטחים Bioprinting של תאים

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

Vascularized Microfluidic Bioprinting עבור הנדסת רקמות, Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting של הסחוס, תחליפי רקמת העור ניצול פסיבים הרומן ערבוב טכניקה יחידה עבור Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell lines using conventional two-dimensional (2D) cell culture. These challenges can be overcome by using bioprinting techniques to build heterogeneous three-dimensional (3D) tumor models whereby different types of cells are embedded. Alginate and gelatin are two of the most common biomaterials employed in bioprinting due to their biocompatibility, biomimicry, and mechanical properties. By combining the two polymers, we achieved a bioprintable composite hydrogel with similarities to the microscopic architecture of a native tumor stroma. We studied the printability of the composite hydrogel via rheology and obtained the optimal printing window. Breast cancer cells and fibroblasts were embedded in the hydrogels and printed to form a 3D model mimicking the in vivo microenvironment. The bioprinted heterogeneous model achieves a high viability for long-term cell culture (&#62; 30 days) and promotes the self-assembly of breast cancer cells into multicellular tumor spheroids (MCTS). We observed the migration and interaction of the cancer-associated fibroblast cells (CAFs) with the MCTS in this model. By using bioprinted cell culture platforms as co-culture systems, it offers a unique tool to study the dependence of tumorigenesis on the stroma composition. This technique features a high-throughput, low cost, and high reproducibility, and it can also provide an alternative model to conventional cell monolayer cultures and animal tumor models to study cancer biology.

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

We developed a heterogeneous breast cancer model consisting of immortalized tumor and fibroblast cells embedded in a bioprintable alginate/gelatin bioink. The model recapitulates the in vivo tumor microenvironment and facilitates the formation of multicellular tumor spheroids, yielding insight into the mechanisms driving tumorigenesis.

Bioprintable Alginate/ג'לטין הידרוג 3D במבחנה דגם מערכות זירוז היווצרות ספרואיד תא

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed from mammal collagen. Thus, the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequences and target motifs of matrix metalloproteinase (MMP) remain on the molecular chains, which help achieve cell attachment and degradation. Furthermore, formation properties of GelMA are versatile. The methacrylamide groups allow a material to become rapidly crosslinked under light irradiation in the presence of a photoinitiator. Therefore, it makes great sense to establish suitable methods for synthesizing three-dimensional (3D) structures with this promising material. However, its low viscosity restricts GelMA's printability. Presented here are methods to carry out 3D bioprinting of GelMA hydrogels, namely the fabrication of GelMA microspheres, GelMA fibers, GelMA complex structures, and GelMA-based microfluidic chips. The resulting structures and biocompatibility of the materials as well as the printing methods are discussed. It is believed that this protocol may serve as a bridge between previously applied biomaterials and GelMA as well as contribute to the establishment of GelMA-based 3D architectures for biomedical applications.

Presented here is a method for the 3D bioprinting of gelatin methacryloyl.

פרוטוקולים של 3D ביוריטינג ג'לטין הידרוג'ל מבוסס-דיו

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by shear stress and improve the survival of the encapsulated cells. However, rapid gravity-driven cell sedimentation in the reservoir could lead to an inhomogeneous cell distribution in bioprinted structures and therefore hinder the application of liquid-like bioinks. Here, we developed a novel multilayered modified strategy for liquid-like bioinks (e.g., gelatin methacryloyl with low viscosity) to prevent the sedimentation of encapsulated cells. Multiple liquid interfaces were manipulated in the multilayered bioink to provide interfacial retention. Consequently, the cell sedimentation action going across adjacent layers in the multilayered system was retarded in the bioink reservoir. It was found that the interfacial retention was much higher than the sedimental pull of cells, demonstrating a critical role of the interfacial retention in preventing cell sedimentation and promoting a more homogeneous dispersion of cells in the multilayered bioink.

Here, we developed a novel multilayered modified strategy for liquid-like bioinks (gelatin methacryloyl with low viscosity) to prevent the sedimentation of encapsulated cells.

שימוש בביודיו מרובה שכבות ביוריטינג תלת מימדי להפצת תאים הומוגניות

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by ...

Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture

Three-dimensional (3D) bioprinting utilizes hydrogel-based composites (or biomaterial inks) that are deposited in a pattern, forming a substrate onto which cells are deposited. Because many biomaterial inks can be potentially cytotoxic to primary cells, it is necessary to determine the biocompatibility of these hydrogel composites prior to their utilization in costly 3D tissue engineering processes. Some 3D culture methods, including bioprinting, require that cells be embedded into a 3D matrix, making it difficult to extract and analyze the cells for changes in viability and biomarker expression without eliciting mechanical damage. This protocol describes as proof of concept, a method to assess the biocompatibility of a crystalline nanocellulose (CNC) embedded agarose composite, fabricated into a 24-well culture system, with mouse bone marrow-derived mast cells (BMMCs) using flow cytometric assays for cell viability and biomarker expression.
After 18 h of exposure to the CNC/agarose/D-mannitol matrix, BMMC viability was unaltered as measured by propidium iodide (PI) permeability. However, BMMCs cultured on the CNC/agarose/D-mannitol substrate appeared to slightly increase their expression of the high-affinity IgE receptor (Fc&#949;RI) and the stem cell factor receptor (Kit; CD117), although this does not appear to be dependent on the amount of CNC in the bioink composite. The viability of BMMCs was also assessed following a time course exposure to hydrogel scaffolds that were fabricated from a commercial biomaterial ink composed of fibrillar nanocellulose (FNC) and sodium alginate using a 3D extrusion bioprinter. Over a period of 6-48 h, the FNC/alginate substrates did not adversely affect the viability of the BMMCs as determined by flow cytometry and microtiter assays (XTT and lactate dehydrogenase). This protocol describes an efficient method to rapidly screen the biochemical compatibility of candidate biomaterial inks for their utility as 3D scaffolds for post-print seeding with mast cells.

This protocol highlights a method to rapidly assess the biocompatibility of a crystalline nanocellulose (CNC)/agarose composite hydrogel biomaterial ink with mouse bone marrow-derived mast cells in terms of cell viability and phenotypic expression of the cell surface receptors, Kit (CD117) and high-affinity IgE receptor (Fc&#949;RI).

ייצור של דיו ביו-חומרים אגרוז משובץ ננו-תאית לגבישית

Three-dimensional (3D) bioprinting utilizes hydrogel-based composites (or biomaterial inks) that are deposited in a pattern, forming a substrate onto ...

Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized matrix. This organization is challenging to replicate due to the heterogeneous environment of bone. Ceramic omnidirectional bioprinting in cell-suspensions (COBICS) is a microgel-based bioprinting technique that uniquely replicates the mineral and cellular structure of bone. COBICS prints complex, biologically relevant constructs without the need for sacrificial support materials or harsh postprocessing steps (e.g., radiation and high-temperature sintering), which are two of the biggest challenges in the additive manufacturing of bone mimetic constructs. This technique is enabled via the freeform extrusion of a novel calcium phosphate-based ink within a gelatin-based microgel suspension. The yield-stress properties of the suspension allow deposition and support the printed bone structure. UV crosslinking and nanoprecipitation then "lock" it in place. The ability to print nanostructured bone-mimetic ceramics within cell-laden biomaterials provides spatiotemporal control over macro- and micro-architecture and facilitates the real-time fabrication of complex bone constructs in clinical settings.

This protocol describes a 3D printing technique to fabricate bone-like structures by depositing a calcium phosphate ink in a gelatin-based granular support. Printed bone analogs are deposited in freeform, with flexibility for direct harvesting of the print or crosslinking within a living cell matrix for multiphasic constructs.

הדפסה ביולוגית רב-כיוונית קרמית במתלים עמוסי תאים ליצירת אנלוגים לעצם

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized ...

Bioprinting Cellularized בונה בעזרת רקמות ספציפיות הידרוג'ל Bioink

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video