פרוטוקול זה מציע גישה קלה ומהירה לסנן דיו ביו-חומרים מועמד להשפעות ציטוטוקסיות פוטנציאליות נגד תאים ראשיים ומערכת החיסון רגישים לפני ניסויים מורכבים בהדפסה ביולוגית תלת-ממדית. לאחר הדגירה של תאי החיסון על מבני הדיו הביו-חומרים, ניתן לאחזר בקלות את התאים מהמבנים על ידי כביסה עדינה כדי לבצע ציטוקסיה במורד הזרם או ניתוחי סמנים ביולוגיים. פרוטוקול זה רלוונטי ישירות להנדסת רקמות שבהן יש לבנות רקמות ביו-מודפסות המיועדות להשתלה מתאים ראשוניים ודיו ביו-חומרי תואם ביולוגי.
כדי להתחיל, הכין מחסנית דיו ביולוגית להתקנה על הביו-הדפסה ה- INKREDIBLE+3D. ראשית, הסר את כובעי הקצה הכחולים ממחסנית הדיו הביו-חומרית של שלושה מיליליטר והדביק זרבובית ביו-הדפסה חרוט סטרילית של 22 מד לקצה מנעול הלואר של מחסנית דיו ביו. חבר את צינורות אספקת לחץ האוויר עבור ראש ההדפסה אחד או PH1 לקצה הנגדי של המחסנית והכנס את המחסנית עם זרבובית הביו-הדפסה החרוטית המצורפת שלה לחריץ האנכי של PH1.
לאחר מכן, הושבו היטב את המחסנית ב-PH1 עם זרבובית ביו-הדפסה חרוטית המשתרעת מתחת לראש ההדפסה. הדק את הבורג ב- PH1 בכיוון השעון עד שהאצבע הדוקה כדי לנעול את מחסנית הדיו הביולוגית במקומה. שים לב כי ביוהדפסה 3D יכול להתבצע עם PH2 נשאר ריק.
הפעל את הביו-הדפסה והפעל את תוכנת הביו-הדפסה במחשב המחובר להדפסה הביולוגית תלת-ממדית באמצעות כבל USB 2.0. בתוכנה, לחץ על לחצן החיבור כדי לסנכרן אותו עם הביו-הדפסה בתלת-ממד. שים לב לשלוש אפשרויות בתפריט הבקרה הראשי של הביו-הדפסה בתלת-ממד.
ראשית, להכין ביו-הדפסה. שנית, תפריט כלי שירות. ושלישית, מסך מצב.
בחרו באפשרות 'הכנת ביו-הדפסה' ולאחר מכן גלול מטה ובחרו באפשרות 'צירים ביתיים'. לאחר כיול מוצלח של צירי XYZ, גובה מיטת ההדפסה ייפחת מעט וראשי ההדפסה יעברו מעל נקודת המרכז של מיטת ההדפסה. כדי להמשיך עם כיול נקודת ההתחלה להדפסה ביולוגית בלוחות 24-well, הסר צלחת תרבות סטרילית של 24 בארות מעטיפת הפלסטיק האטומה שלה וסמן נקודה בנקודת המרכז של באר D1 בחלק התחתון של הצלחת עם סמן קבוע.
הסר את כיסוי הצלחת ומניחים את צלחת התרבות 24-well על מיטת ההדפסה עם D1 היטב הממוקם בפינה השמאלית הקדמית של המיטה ההדפסה. בתפריט הבקרה הראשי, בחר תפריט כלי שירות ולאחר מכן הזז ציר. הזז את ראשי ההדפסה במרווחים של מילימטר אחד לאורך צירי X ו- Y עד שזרבובית ההדפסה הביולוגית החרוטית של PH1 נמצאת ישירות מעל הנקודה המסומנת תחת באר D1. במידת הצורך, כוונן את מיקום הזרבובית הביו-הדפסה החרוטית מעל הנקודה על-ידי הזזת ראשי ההדפסה במרווחים של 0.1 מ"מ.
הקלט את הקואורדינטות X ו- Y של זרבובית ההדפסות החרוטיות כאשר ישירות מעל מרכז ה- Well D1 כפי שצוין במסך לוח הבקרה של הביו-הדפסה בתלת-ממד וסמן את הקואורדינטות. לאחר מכן, הרימו את מיטת ההדפסה במרווחים של מילימטר אחד עד שתחתית הבאר D1 כמעט נוגעת בזרבובית הביו-הדפסה החרוטית המותקנת בראש ההדפסה. כוונן את התנועה של מיטת ההדפסה במרווחים של 0.1 מ"מ במידת הצורך.
מתפריט כלי השירות, בחר באפשרות כיול ציר Z ובחר ואישר עוד יותר את אפשרות הכיול Z של חנות. חזור לתפריט הראשי ובחר באפשרות הכנת ביו-הדפסה. גלול מטה ובחר באפשרות Z המכויל.
עדכן את הקוד הגיאומטרי או את קוד ה- G של לוח 24 הבאר בקואורדינטות נקודת ההתחלה הנכונות. פתח את קובץ קוד G שסופק 24-well על תוכנת ביו-הדפסה. עדכן את הקואורדינטות X ו- Y בשורה הראשונה עם הערכים שהושגו בשלבים הקודמים ושמור את הקובץ תחת שם חדש.
ודא שהמשאבה הפנאומטית מחוברת היטב ליציאת צריכת האוויר האחורית של הביו-הדפסה ה-INKREDIBLE+3D והדליק אותה. שלפו את ידית הבקרה הקדמית הממוקמת בצד ימין של הביו-הדפסה ה-INKREDIBLE+3D. ודא כי מד הלחץ הדיגיטלי עבור PH1 ו- PH2 הממוקם בחזית הביו-הדפסה כל לקרוא קרוב לאפס קילופסקל.
סובב לאט את ידית הבקרה הקדמית בכיוון השעון עד שהלחץ המצוין במד השמאלי עבור PH1 יגיע ל-12 קילופסקל. מניחים נייר טישו מקופל או חתיכת סרט איטום עמיד למים מתחת לזרבובית ההדפסה של המחסנית המותקנת, ונזהרים שלא לגעת בזרבובית ההדפסה. מתפריט הבקרה הראשי בהדפסה הביולוגית תלת-ממדית, בחרו 'הכינו ביו-הדפסה'.
נווט אל ההפעלה PH1 ובחר אותו. שים לב שהדיו הביולוגי מתחיל להלל מהזרבובית ההדפסה. במידת הצורך, להגביר את לחץ השחול על ידית השליטה בכיוון השעון עד הדיו הביולוגי הוא בלרוד חוט רציף ולתעד את הגדרת הלחץ החדשה.
בחר בטל את PH1 כדי להפסיק את שחול הדיו הביולוגי. הסר נייר טישו או סרט המכיל את הדיו הביולוגי המובלט ממיטת ההדפסה וסגור את דלת הביו-הדפסה. כדי לבצע הדפסה ביולוגית תלת-ממדית של מצעים הידרוג'לים רקטלינאריים בתבנית של 24 בארות, בחר את תפריט כלי השירות מתפריט הבקרה הראשי ולאחר מכן בחר להשבית הדפסת SD שתאפשר לתוכנת הביו-הדפסה לשדר קבצי קוד G להדפסה של ביו-הדפסה תלת-ממדית.
לחץ על כפתור העומס בתוכנת הביו-הדפסה ובחר את קובץ קוד G המעודכן של לוחית 24 טוב. בלוח הבקרה הימני בתוכנה, בחר בכרטיסייה הצגה לפני הדפסה ולחץ על לחצן ההדפסה כדי להתחיל בהדפסה ביולוגית ב- D1. עם השלמת הדפסה ביולוגית של המבנים המשעשעים, לכסות את צלחת 24 באר עם המכסה שלה ולהעביר אותו לארון בטיחות ביולוגית Class II. לטבול כל מבנה rectilinear בשתי טיפות של תמיסת סידן כלורי סטרילי 50 מילימולר ודגור בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.
שאפו בזהירות את תמיסת הסידן כלורי מכל מבנה טוב ושטפו פעם במיליליטר אחד של 1X PBS כדי להסיר עודף סידן כלורי. כדי למנוע התייבשות של מבני הידרוג'ל מודפסים ביולוגית, לשמור על מבנים רקטליניאריים 3D מודפס ב PBS טרי עד תאי התורן נגזר מח העצם מוכנים לזרוע על המבנים. בהתבסס על הפרמטרים של פיזור קדימה וצד של BMMCs שנותחו על ידי cytometry זרימה, נצפתה כי מצע הידרוג'ל עם ריכוז CNC הגבוה ביותר לא שינה את הגודל המקורי או פירוט של BMMCs לעומת BMMCs תרבות בהיעדר CNC agarose D-mannitol הידרוג'ל מצעים.
ניתוח ציטומטרי זרימה של החפירות של BMMCs propidium יודיד הראה כי אף אחד ריכוזי CNC שנבדקו לא עורר כל השפעה שלילית על הכדאיות BMMC. מצע אגרוז CNC הגדיל את הביטוי של סמנים ביולוגיים של תא התורן בריכוזים CNC גדול או שווה ל 2.5%עם זאת, רמות הביטוי של קולטנים אלה נותרו עקביים יחסית בין 2.5% ל 12.5% CNC אשר מציע השפעה שאינה תלויה בריכוז של CNC. בדיקת XTT הוכיחה כי הפעילות המטבולית של BMMCs בתרבית על פיגומי הידרוג'ל מודפסים 3D נשאר עקבי יחסית על כ 100% על פני כל נקודות הזמן שנבדקו.
באופן דומה, בדיקות ההחרגה של שחרור LDH וההדרה של צבע PI לא חשפו שינויים משמעותיים בכדאיות של ה- BMMCs. תשומת לב זהירה לבחירת מד הזרבובית ההדפסה, כיול צירי הביו-הדפסה התלת-ממדית והגדרת לחץ ההבלטה יבטיחו הדפסה ניתנת לשחזור של מבנים תלת-ממדיים באיכות גבוהה. הקלות שבה ניתן לאחזר את תאי התורן מאפשרת להם להיחקר על ידי מגוון רחב של בדיקות ביולוגיות כדי להמשיך לחקור כל היבט של התפקודים התאיים שלהם.
