ברצוננו להודות תמיכת תכנית תמיכת תשתית התפעולית של הממשלה ויקטוריאני, בתכנית פרויקטי הצמדת המועצה למחקר האוסטרלית (עם Agilent Technologies), המועצה למחקר רפואית והבריאות הלאומיות של אוסטרליה, בנק המוח ויקטוריאני, מרכז המחקר השיתופי לבריאות נפש ואת Neuroproteomics מִתקָן.

1. הכנת מאגרי דוגמאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 500 מ&quot;ל של חיץ, 200 מ&quot;מ אמוניום חנקתי pH 7.6 - 7.8 (pH מותאם עם אמוניום הידרוקסיד (NH 4 OH)) צסיום (Cs) האנטינומיה (SB) הוסיף לריכוז סופי של 10 ppb. השתמש צסיום ו האנטינומיה כמו סטנדרטים פנימיים כדי לפקח על כל להיסחף בתגובת ICP-MS. חיץ מסנן לפני השימוש דרך פילטר 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן מדגם בהתאם לסוג של מדגם: נוזל, רקמה או תרבית תאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת דוגמיות הדורשים הומוגניזציה (למשל, רקמה או תאים), להבטיח כי הם לא מכילים חומר ניקוי. השתמש מאגרים טריס להכנת מדגם. לחלופין, להשתמש מאגרים פוספט אבל הם יכולים להשפיע לרעה על metalloproteome לאורך זמן או עם מחזורי הפשרה להקפיא 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize דגימות רקמה או תאים תרבות ידי dounce או sonication ידני 5 דקות באמצעות טריס שנאגרו מלוחים (50 8.0 מ&quot;מ טריס pH, 150 נתרן כלורי מ&quot;מ(NaCl) + חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) מעכבי פרוטאז חינם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבהיר homogenates על ידי צנטריפוגה ב XG 16,000 במשך 5 דקות. איסוף supernatant שהתקבל. שמור דגימות ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: כל הדגימות יש centrifuged לפני הטעינה לתוך כרומטוגרפיה הנוזלית ביצועים גבוהים (HPLC) בקבוקונים למנוע מחלקיקי חסימת כרומטוגרפיה הדרת גודל העמודה (SEC). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את הסכום הכולל של חלבון נטען על העמודה ברחבי הדגימות. לקבוע ריכוזי חלבון ב 280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר UV נפח מיקרו 13. טען בין חלבון מיקרוגרם 20 ל -150. השתמש כרכי הזרקת טיפוסי הנעים בין 2 - 80 μl תלוי בריכוז המדגם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את זרוע מדגם של ספקטרופוטומטר UV נפח מיקרו עם מים מזוקקים לפני הטעינה המדגם. זרוע מדגם המקום שבו דגימות החלבון נטענות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המכשיר בלנק נגד 2 μl של החיץ מדגם דואר. לאחר מכן, עומס 2 μl של כל דגימה על הזרוע ולמדוד את הספיגה ב 280 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת הריכוזים. לקבלת דוגמיות חלבון גולמי, השתמש מקדם הכחדה של 1 Abs = 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל. כדי לקבוע את הריכוז של חלבון בדגימות, השתמש חוק בר-למברט, A = ε xlxc, כאשר A הוא ספיגת, ε הוא מקדם הכחדה, L הוא אורך הנתיב בסנטימטרים c הוא ריכוז. </li></ol></li></ol> 2. ניתוח גורף תקני מטאלופרוטאין שימוש פלזמה מצמידה אינדוקטיבי - ספקטרומטריית מסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חימום לכוון את המכשיר תוך שימוש בפרוטוקולים של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע המכשיר התחמם מכוון, לבצע בתפזורת ICP-MS. הערה: פתרונות מניות של מטאלופרוטאין המטוהר בדרך כלל צריכים להיות דלילים לפני המדידה. ריכוז המתכת של התקן ניתן לאמוד מתוך החלבון הידוע: stochiometries מתכת ואת Concentra החלבון המוערךtion. מידע זה יכול לשמש כדי לקבוע את דילול שתהלום ליפול בטווח של עקומת סטנדרט שנוצר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל סטנדרטים מטאלופרוטאין, thyroglobulin, פריטין, ceruloplasmin, Cu / Zn SOD וויטמין B 12, כדי להבטיח שהם נמצאים בטווח של 0 - 500 מיקרוגרם / L, באמצעות חומצה 1% חנקתית. כדי להשיג סטנדרטים בטווח זה, אין להשתמש דילולים עולים על 1 ב 20. בצעו דילולים סדרו במים לדלל את המניות לפני זה אם נדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת סדר הזריקות. ראשית, לנתח שבע רמות הכיול, בריכוזים הנעים בין 0 - 500 מיקרוגרם / L, ואחריו בסטנדרטי מטאלופרוטאין. השבע רמות הכיול הן 0, 1, 5, 10, 50, 100 ו -500 מיקרוגרם / ליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אלמנטים של עניין. הנה, להשתמש Fe, Cu, Zn, Co ואני, כפי שהם האלמנטים שסטנדרטי החלבון מאוגדים. בחר את רכיבי שיטת הרכישה על ידי פתיחת הלשונית הבוררת אלמנט והוספת eleme<html> nts והמוני איזוטופ שלהם כי הם להיות מנותח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח מדגם עם המכשיר ואת תוכנת הכלי יוצרת באופן אוטומטי את עקומות הכיול עבור כל האלמנטים להיות מנותחות. עקומות הכיול נוצרות על ידי התוכנה על ידי התוויית הספירות / sec של המתכת המזוהית כנגד הסכום של מתכת כי ההתקן נועד להכיל, ב מיקרוגרם / ליטר. השתמש עקומות הכיול כדי לקבוע את הריכוז של מתכת הדגימות הידועות. הערה: שימוש עקומת הכיול, התוכנה קובעת את הריכוז של מתכת בכל אחד סטנדרטי מטאלופרוטאין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתוצאות הניתוח בתפזורת, ליצור סטנדרטים מטאלופרוטאין הכוללים שלושת יסודות הקורט הנפוצים ביותר ברקמות יונקות באמצעות תערובת של Cu, סופראוקסיד דיסמוטאז Zn (SOD) מדולל ל 200 מיקרוגרם / ליטר של נחושת ואבץ ו פריטין (FTN) בכל סופי ריכוז של 2,000 מיקרוגרם / ליטר של ברזל. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 3. הגדרת מערכת HPLC ו איזון טור כרומטוגרפיה הדרה גודל הערה: סעיף זה צריך להתבצע במקביל הקודם, שכן שניהם נדרשים כ -1 - 1.5 שעות כדי להשלים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טהר HPLC משאבות עם חיץ עשה צעד 1.1 ולטהר המשאבות למשך 5 דקות בקצב הזרימה של 5 מ&quot;ל / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמערכת היא מטוהר, להגדיר את קצב הזרימה ב 0.1 מ&quot;ל / דקה ולחבר את העמודה הדרה גודל (4.6 x 300 מ&quot;מ, 3 מיקרומטר, 150 א). הערה: חיבור רטוב בין הצינורות והטור נמנע מכל בועות אוויר להילכד במהלך חיבור של הטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את הקצה השני של עמודת גלאי UV להגדיר למדוד ספיגה ב 280 ננומטר באמצעות צינורות צצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהדרגה להגדיל את קצב הזרימה של העמודה במרווחים של 0.05 - 0.1 מ&quot;ל / דקה עד קצב הזרימה הסופי של 0.4 מ&quot;ל / דקה הוא הגיע. אמנם זה מתרחש, בדוק את חיבורי צינורות לעמודה עבור כל הדלפות. לפקח על לחץשל המערכת כדי לוודא שהוא אינו עולה על דרישות הטור ידי התבוננות עקבות לחץ על הכרומתוגרמה בתוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את העמודה כדי לאזן את קצב הזרימה הנדרשת מעל 5 - 10 כרכי טור. אחרי זה הוא equilibrated, לחבר את המכשירים כדי לאפשר ניתוח מדגם להתרחש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את שיטת HPLC עד לשאוב חיץ לאורך טור ב 0.4 מ&quot;ל / דקה במשך 15 דקות. </li></ol> 4. הקמת והפעלת הדרה גודל - מצמידים אינדוקטיבי פלזמה - ספקטרומטריית מסה הערה: נהלי עבודה עשויים להשתנות בין מכשירים ודגמים. לצור קשר עם המומחה הטכני המכשיר כדי ללמוד עוד על איך להגדיר את בשימוש ICP-MS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את ICP - MS למצב המתנה לפני שינוי הגדרת חומרה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אתה במצב מתנה, לכבות את התקשורת עבור סמפלר האוטומטי ולשנות את המבוא המדגם &quot;אחר&quot;. הערה: בהתאם לתוכנה וקשהכלי תצורה ובחירה &quot;HPLC&quot; כמקור מבוא מדגם יכול לשמש. לצור קשר עם המומחה הטכני המכשיר ללמוד אם אפשרות זו זמינה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש צינורות צצים (מזהה 0.13 מ&quot;מ) כדי לחבר את הזרימה מן גלאי UV ישירות nebulizer על ICP-MS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוח לגבות את ICP - MS ולאפשר המכשיר להתחמם במשך 10 - 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפלזמה הציתה, חבר את הכבל המרוחק מן ICP - MS לחלק האחורי של autosampler HPLC. האם זו פעם הפלזמה הציתה; אחרת מערכת HPLC תכובה באופן אוטומטי מאז ICP - MS זה לא לעניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי שיטת ICP-MS לאסוף נתונים עבור MS-LC-ICP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את שיטת הרכישה מתוך ספקטרום לרכישת נחישות זמן (TRA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את היסודות להיות מנותחים, Fe, Cu, Zn, Co, אני וכן כל מרכיבים אחרים של עניין, ופעמי אינטגרציה להגדיר (בדרך כלל בין 0.05 - 0.3 שניות). לאחר האלמנטים של ענייןמחדש הנבחר, להתאים את זמן הרכישה כדי להתאים את זמן הריצה עבור כרומטוגרפיה (למשל, 900 שניות לריצה כרומטוגרפיה 15 דק &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני לכוון את ICP - MS הליום תא רגיש התנגשות (הוא) ספיקות גז עם למאגר כרומטוגרפיה זורם באמצעות Cs ו Sb כלול במאגר. ספיקות הוא בדרך כלל ~ 1 מ&quot;ל / דקה פחות מאלה ששימשו לניתוח בתפזורת. לאחר ספירת יון המתכת התייצבה וסטיית תקן יחסית (RSD) ערכים הם מתחת ל -5%, המערכת מוכנה לשימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות רשימות מדגם להצגה היא בחלוקת HPLC ותוכנות ICP-MS. המדגם בטווח הרשימה מכילה את הסדר שבו כל אחת מהדגימות הוא להיות מוזרק כמו גם השם שבו הנתונים יישמרו. בדוק כי המספר הכולל של דגימות במשחק הרשימה בין שתי התוכניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחלה יצוות המדגם עבור ICP-MS לפני HPLC, כמו ההזרקה של המדגם על ידי HPLC יפעיל את ICP - MS להתחיל לאסוףנתונים. אם זה לא נעשה בסדר הנכון זה יביא נתונים חסרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור נקודות עקומת כיול על ידי הזרקת כמויות משתנות של SOD ורמת מעורבות FTN מ 200 מיקרוגרם / ליטר ל -6,000 מיקרוגרם / ליטר מוזרק על עמודה עבור Cu &amp; Zn ו -2,000 מיקרוגרם / ליטר עד 60,000 מיקרוגרם / ליטר עבור Fe. כרכי הזרקה נעים בין 1 ל 30 μl. הערה: טווחי ריכוז אלה להקיף את ריכוזי Fe, Cu ו Zn בדרך כלל שנצפו homogenates המורכב. לקבלת דוגמיות המכילים חלבונים מטוהרים רק הטווח המקסימאלי של העקומה צריך להיות בהתאם. ככל שכמות מתכת הקשורים החלבון עשוי לדרוש מגוון קטן או גדול מאז יש זיהום פחות במדגם מגורמים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח כל רקמת דגימות הידועות, תרבות הפלזמה או תא. </li></ol> 5. ניתוח נתונים, מניפולציה ויזואליזציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הנתונים ערכים מופרדים בפסיקים (CSV) פורמט הקובץ ולטעון in כדי תוכנות עיבוד כנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לשלוט על נדידת מכשיר, לחלק את הספירה לשנייה עבור כל רכיב על ידי הספירה לשנייה לאף Cs או SB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור עקומות כיול עבור כל האלמנטים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את השטח מתחת לשיא המתכת התואם את מטאלופרוטאין כי הוא חייב לכל אחת הזריקות על ידי ביצוע אינטגרצית שיא תוכנת ניתוח נתונים המועדף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש את השטח מתחת לשיא מתכת כנגד הסכום הכולל של המתכת שהוזרק על הטור בכל ריצה, 200 - 6,000 מיקרוגרם / ליטר עבור Cu ו Zn ו -2,000 - 60,000 מיקרוגרם / ליטר עבור Fe. ביצוע ניתוח רגרסיה ליניארית על פי פרוטוקול התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוצאות המדרון מניתוח רגרסיה ליניארית כגורם להמיר ספירה לשנייה כדי pg / sec. מחלקים כל של ספירה לכל נקודות נתונים שניות ברחבי הכרומתוגרמה ידי השיפוע של ערך הקו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שרטט את הנתוניםpg / sec נגד הזמן הכרומתוגרמה. לקבוע את האזור תחת הפסגות של עניין. השטח מתחת לשיא מייצג את הסכום הכולל של מתכת כי החלבון מאוגד, ב pg. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור כיול לפי המשקל המולקולרי של מטאלופרוטאין הידוע לבין המועד שבו הם elute. השתמש באפשרות זו כדי להעריך את גודל פסגות חלבון בדגימות מורכבות. </li></ol>

<ol>
	<li>Holm, R. H., Kennepohl, P., Solomon, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+Functional+Aspects+of+Metal+Sites+in+Biology.">Structural and Functional Aspects of Metal Sites in Biology.</a> Chem Rev. 96, 2239-2314 (1996).</li><li>Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G., Thornton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+ions+in+biological+catalysis:+from+enzyme+databases+to+general+principles.">Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles.</a> J Biol Inorg Chem. 13, 1205-1218 (2008).</li><li>Roberts, B. R., Ryan, T. M., Bush, A. I., Masters, C. L., Duce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+metallobiology+and+amyloid-beta+peptides+in+Alzheimer's+disease.">The role of metallobiology and amyloid-beta peptides in Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 120 (Suppl 1), 149-166 (2012).</li><li>Roberts, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Treatment+with+CuII+(atsm)+Increases+Mutant+SOD1+In+Vivo+but+Protects+Motor+Neurons+and+Improves+the+Phenotype+of+a+Transgenic+Mouse+Model+of+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Oral Treatment with CuII (atsm) Increases Mutant SOD1 In Vivo but Protects Motor Neurons and Improves the Phenotype of a Transgenic Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> J Neurosci. 34, 8021-8031 (2014).</li><li>Hare, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+plasma+iron+in+Alzheimer's+disease+is+due+to+transferrin+desaturation.">Decreased plasma iron in Alzheimer's disease is due to transferrin desaturation.</a> ACS CHEM NEUROSCI. , (2015).</li><li>Cvetkovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+metalloproteomes+are+largely+uncharacterized.">Microbial metalloproteomes are largely uncharacterized.</a> Nature. 466, 779-782 (2010).</li><li>Barnett, J., Scanlan, D., Blindauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+fractionation+and+detection+for+metalloproteomics:+challenges+and+approaches.">Protein fractionation and detection for metalloproteomics: challenges and approaches.</a> Anal Bioanal Chem. 402, 3311-3322 (2012).</li><li>Fernandez Sanchez, L., Szpunar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speciation+analysis+for+iodine+in+milk+by+size-exclusion+chromatography+with+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometric+detection(SEC-ICP+MS).">Speciation analysis for iodine in milk by size-exclusion chromatography with inductively coupled plasma mass spectrometric detection(SEC-ICP MS).</a> J. Anal. At. Spectrom. 14, 1697-1702 (1999).</li><li>Manley, S., Byrns, S., Lyon, A., Brown, P., Gailer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Cu-,+Fe-,+and+Zn-specific+detection+of+metalloproteins+contained+in+rabbit+plasma+by+size-exclusion+chromatography-inductively+coupled+plasma+atomic+emission+spectroscopy.">Simultaneous Cu-, Fe-, and Zn-specific detection of metalloproteins contained in rabbit plasma by size-exclusion chromatography-inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy.</a> J Biol Inorg Chem. 14, 61-74 (2009).</li><li>Richarz, A. N., Br&#228;tter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speciation+analysis+of+trace+elements+in+the+brains+of+individuals+with+Alzheimer's+disease+with+special+emphasis+on+metallothioneins.">Speciation analysis of trace elements in the brains of individuals with Alzheimer's disease with special emphasis on metallothioneins.</a> Anal Bioanal Chem. 372, 412-417 (2002).</li><li>Hare, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+iron,+copper+and+zinc+content+in+primary+neuron+and+astrocyte+cultures+by+rapid+online+quantitative+size+exclusion+chromatography-inductively+coupled+plasma-mass+spectrometry.">Profiling the iron, copper and zinc content in primary neuron and astrocyte cultures by rapid online quantitative size exclusion chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry.</a> Metallomics. 5, 1656-1662 (2013).</li><li>Balkhi, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Plasma+Copper+Proteins+Speciation+by+Size+Exclusion+Chromatography+Coupled+to+Inductively+Coupled+Plasma+Mass+Spectrometry.+Solutions+for+Columns+Calibration+by+Sulfur+Detection.">Human Plasma Copper Proteins Speciation by Size Exclusion Chromatography Coupled to Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Solutions for Columns Calibration by Sulfur Detection.</a> Anal Chem. 82, 6904-6910 (2010).</li><li>Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvolume+Protein+Concentration+Determination+using+the+NanoDrop+2000c+Spectrophotometer.">Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer.</a> J Vis Exp. , e1610 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

הבטיח למצב הטבעי של החלבון אומר תשומת לב מיוחדת המאגרים בשימוש ואחסון של המדגם יש צורך. לא כל טכניקות כרומטוגרפיה או טכניקות הכנת מדגם יכולות להיות מועסקות. חשוב כי המאגרים בשימוש בכל רחבי הכנת מדגם כרומטוגרפיה הם נטולים chelators מתכת מאגרי שימוש מחקי ריכוזי pH ו מלח פיסיולוגיים. מצבים אחרים שעדיף להימנע מהם כוללים חימום המדגם או תוספת של denaturants חלבון (למשל, אוריאה). זה קריטי כדי למזער את מספר מחזורי הפשרת הקפאה. היכולת של למאגר נבחר כדי לאגד מתכות divalent כן, חשובה ומהווה סיבה כי מאגרים חנקו טריס או אמוניום נבחרים על מאגרים מבוססים פוספט. הרזולוציה הנמוכה וקיבולת שיא של קרוב משפחה כרומטוגרפיה הדרה גודל לצורות אחרות של כרומטוגרפיה הוא המגבלה העיקרית של הטכניקה הזו. עם זאת, האופי העדין של chromatogra הדרת הגודלPHY חשוב לשמור על מדינת יליד החלבון ובכך לשמר את אג&quot;ח מתכת-חלבון החלש יחסית. הדרישה לשמור על מצב יליד החלבונים דורשת תשומת לב מיוחדת לטיפול הדגימות כולל הגבלת מספר מחזורי הפשרת הקפאה, הימנעות chelators מתכת (למשל, EDTA) או מלחים chaotropic ודטרגנטים. ברזולוציה נמוכה זו של שפעות הטכניקה הזו את היכולת לכמת את כמות מתכת קשורה חלבון מסוים אם הוא נמצא מדגם מורכב כמו הפסגות לראות יכיל יותר חלבון אחד. לפיכך, הסכום של מתכת נקבע באמצעות שילוב השיא יהיה אינדיקציה מהסכום הכולל של מתכת קשורה כל החלבונים משחרר בנקודה זו בזמן ולא רק חלבון אחד ספציפי. על מנת להתגבר על מגבלה זו החלבון של עניין יצטרך להיות מטוהרים נוספים בתנאי ילידים. זה היה מאפשר כימותהמתכת קשורה חלבון זה תדווח עם רמה גבוהה יותר של certainity. מגבלה נוספת פוטנציאל של טכניקה זו תהיה אובדן החלבון עקב אי הפיך מחייבים לעמודה. על מנת לקבוע אם זה קורה ניסוי התאוששות צריכה להתבצע לפיה כמות החלבון משחרר את הטור מנותחת כדי לקבוע אם זו תואמת את הכמות המוזרקת. אותו הדבר ניתן לעשות זאת על ידי מדידת תוכן המתכת של חומר elution ואת החומר המוצא ידי בתפזורת ICP-MS. התאוששות טור יכולה להשתנות בהתאם לתנאי בשימוש, אבל זה הוכח כי התאוששות מלאה של חלבונים מעמודת הדרה גודל אפשרית 9. לכן חשוב לבדוק אם יש או אין כל אובדן בתנאי ההפעלה שבשימוש. שינויים בפרוטוקול יכולים להיות קשורים בסטנדרטי מטאלופרוטאין המשמשים כמו גם האלמנטים מנותחים. סוג לסטנדרטים מטאלופרוטאין לנוed ישתנו בהתאם האלמנטים שיש בהם עניין. עבור אלמנטים כגון Cu, Fe וחלבונים Zn, SOD ו- פריטין מועסקים. כל מטאלופרוטאין אחר שיש להם ידוע stoichometries יכול לשמש גם וכמה דוגמאות הוכחו כאן. סיבוך חמור אחד שיכול לנבוע באמצעות טכניקה זו היא הצטברות של גבישי מלח ב הלפיד של ICP-MS. כדי למנוע הצטברות של גבישי מלח, הלפיד הוא נשטף עם מים מזוקקים לאחר כל 500 - 1,000 מ&quot;ל של חיץ כי כבר עבר דרך מערכת או כאשר הוא נקבע על ידי בדיקה ויזואלית כי לפיד יש לשטוף. בעיה נוספת שיכול להתעורר היא ירידה מהירה יותר מניקיון קונוסים המדגם והפקה. אלה יש לנקות באות הפרוטוקולים של היצרן על בסיס קבוע. הכנת המדגם הראשונית היא השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול. אם יש שינויים כלשהם לחלבון - מתכת מורכבת information שנוצר לא יהיה תקף. זוהי אחת המגבלות העיקריות של הטכניקה; בנוסף לשימוש ברזולוציה הנמוכה, עמודת הדרת הגודל מניב תצוגה מפורטת מוגבלת של המורכבות האמיתית של מטאלופרוטאין בביולוגיה. הטכניקה המתוארת כאן מאפשרת הרחבת הידע של metalloproteome של אורגניזם. ניתוח גורף רק נותן אינדיקציה גסה של שינויים בסכום של מתכת בתוך מדגם. מלבד השיקולים הכלליים שצריכים להילקח בחשבון, שיטה זו מספקת כלי שיכול לשמש כדי לכמת את כמות מתכת קשורה חלבונים כמו גם זיהוי מטאלופרוטאין שונה על ידי השוואת העקבות שהתקבלו. השימוש בטכניקה זו יכול להיות מועסק על מנת לזהות הבדלים בין מצבי מחלה. מטאלופרוטאין המזוהה אז יכול להיחקר נוסף כדי לסייע לקבוע את התפקיד שהם ממלאים תהליכי מחלה. היישום של ICP-MS למקף יש גידולבעתיד כדי לקבוע את התפקיד של תרופות שיש להן heteroatom כגון פלטינה, יוד או נחושת כמו ICP-MS יכול לשמש כדי לזהות את החלבונים כי התרופה נקשרה.

מתכות חיוניות לשחק תפקיד חיוני פונקציות ביולוגיות נורמליות, כוללים מסלולי שליח משניים, שבילים מטבוליזם ופונקציות אברון. 30% מכלל החלבונים נחשבים מטאלופרוטאין 1 ו -50% מכלל האנזימים 2. מטאלו להשתמש במתכות אלה עקבות כמו קו-פקטורים לזרז תגובות כימיות, לייצב את מבנה החלבון, ועל התפקידים רגולטוריות כגון שליחים משניים. חלק יסודות קורט הנחקרים ביותר לגבי ניווניות של מערכת העצבים הם נחושת, ברזל ואבץ 3. הם חשבו להיות מעורבים מסלולים רבים מחלה שבה ידי dyshomeostasis יכול להשפיע לרעה. לדוגמא מעמד המתכת של סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD) משפיעה באופן ישיר על תוחלת החיים ואת הפנוטיפ של מודלים בעכברים טרנסגניים מסוג המשפחתי של טרשת לרוחב amyotrophic (ALS) 4. במחלת האלצהיימר, טכניקות metalloproteomics שימשו לגלות ירידה במעמד מתכת של transferrin ב plasma 5. מחקרים אלה מדגישים את מטאלופרוטאין התפקיד החשוב יכול לשחק מחלה. המחקר של מטאלופרוטאין ישירות רקמות ביולוגיות הוא תחום מתפתח. למרות שחלק מטאלו מתאפיינים, הרוב עדיין להישאר uncharacterized או לא ידוע 6. אחד האתגרים הגדולים מטאלופרוטאין מדידה היא הדרישה לשמור על מצב יליד החלבון 7. טכניקות proteomic מלמטה למעלה קלסיים להסתמך על העיכול של החלבונים לתוך פפטידים. תהליך זה משבש את האינטראקציה הלא קוולנטיים של מתכות והחלבונים שלהם. לכן, אין מידע על מצב המתכת של חלבון הוא זכה. אחת הדרכים להתגבר על בעיה זו היא באמצעות כרומטוגרפיה הדרה גודל באמצעות זיווג עם פלזמה מצמידים אינדוקטיבי - 8,9 ספקטרומטריית מסה (SEC-ICP-MS). זה מייצר מידע אודות בגודל המשוער של החלבון וכן כל מתכות כי הם associated עם זה 10. יתר על כן, הדרת גודל היא טכניקה chromatographic עדינה שיכול לשמר את מדינת יליד תסביך אנזים או חלבון-חלבון. אחד היתרונות של שימוש פלזמה מצמידים אינדוקטיבי - ספקטרומטריית מסה (ICP-MS) היא טבע כמותי של הטכנולוגיה. באמצעות סט של סטנדרטים מטאלופרוטאין אפשר לספק quantitation המוחלט של מטאלופרוטאין מ דגימות ביולוגיות 9,11. זו מושגת על ידי יצירת עקומת סטנדרט ידי הזרקת מטאלופרוטאין הידוע על פני טווח של ריכוזי מתכות. פרוטוקול זה מציג דוגמה כיצד ניתן להשיג זאת על פי מגוון מדדים מטאלופרוטאין. במאמר זה אנו שואפים ליצור עקומות סטנדרטיות עבור מתכות כי נחקרות בעיקר בתחומים ביולוגיים כוללים ברזל (Fe), נחושת (Cu), אבץ (Zn), יוד (I), קובלט (Co).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Binary Pump</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Autosampler</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4226A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1330B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1314E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 7700 ICP-MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G3282A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ammonium hydroxide trace metal basis&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>338818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ammonium nitrate&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>256064</td>
			<td>Make fresh 200mM solution on day of experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Antinomy&#160;</td>
			<td>Choice analytical&#160;</td>
			<td>10002-3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ceruloplasmin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cesium&#160;</td>
			<td>Choice analytical&#160;</td>
			<td>100011-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Complete, EDTA free protease inhibitors&#160;&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Conalbumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cu, Zn Superoxide dismutase&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ferritin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;ICP-MS multielemental calibration standards&#160;</td>
			<td>AccuStandard</td>
			<td></td>
			<td>Made up to required concentrations in 1% nitric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microvolume UV spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;65% Nitric acid&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>100441</td>
			<td>Diluted to 1% for use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Peek tubing&#160;&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5042-6461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6x300mm, 3&#956;m, 150&#197;&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-2508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sodium Chloride&#160;</td>
			<td>Chem Supply</td>
			<td>SA046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Tris Hydrochloride&#160;</td>
			<td>ICN Biomedicals inc.&#160;</td>
			<td>103130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Thyroglobulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Vitamin B12&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V2876</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standards for quantitative metalloproteomic analysis using size exclusion icp-ms

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer's and Parkinson's disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma - mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.

השימוש בסטנדרטים מטאלופרוטאין מאפשר כיול של הטור הדרה גודל. איור 1 א מציג את הפרופיל elution עבור thyroglobulin סטנדרטים, פריטין, ceruloplasmin, Cu / Zn SOD וויטמין B 12 מבוסס על המתכת כי הם קשרו (Fe, Co, Cu, Zn ואני). איור 1B מציג את עקומת הכיול עבור עמודת ההדרה גודל לפי המשקל המולקולרי של סטנדרטי חלבון וזמן elution שלהם, הציגה במתכונת של נפח elution (Ve) מחולקת בנפח החלל של עמודה (וו). החלבונים השתמשו כדי ליצור עקומת סטנדרט זה concanavalin A, conalbumin, ceruloplasmin, פריטין, SOD ו- thyroglobulin. איור 2 א מראה את elution של פריטין על פני טווח של 2,000 - 60,000 pg של Fe מוזרק על עמודה ואיור 2D היא ניתוח רגרסיה בוצעה באמצעות peak באזור. איורים 2B ו 2C הם פרופילים elution עבור Cu / Zn SOD עבור Cu ו Zn ו 2E ו 2F הם הרגרסיה ניתוחי שנוצר באמצעות אזורים שיא. התוצאות של ניתוח רגרסיה משמשות כדי להמיר את הנתונים הגולמיים בספירה / sec כדי pg / sec כך כמות מתכת קשורה החלבון ניתן לקבוע באופן כמותי. ההמרה נעשית על ידי חלוקת ספירות / sec ידי שיפוע רגרסיה ליניארית (למשל, 334.6 (ספירות / sec x) (שניות / pg) של נחושת). כאמור, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לזהות מטאלופרוטאין בדגימות ביולוגיות מורכבות. מוח פלזמת אדם שהיה נתון הטכניקה הזו ומספרים 3 ו -4 בהתאמה, להראות את התוצאות שהתקבלו. המוח האנושי המופרד SEC-ICP-MS מוצג ציורי A3-3C, שכל אחד מהם מייצג מתכת שונה של<html> ריבית (Cu, Zn או Fe). דמויות 4A-4C להראות את עקבות המתקבלות כאשר מפלסמה אנושית נתונה הטכניקה הזו. המורכבות והשפע של המדגם ישפיעו על מספר הפסגות, כי הם ראו. כפי הפלזמה צפויה הוא נשלט על ידי כמה מטאלופרוטאין כולל ceruloplasmin ו transferrin. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig1.jpg" /> כיול באיור 1. של כרומטוגרפיה הדרה גודל - מצמידים אינדוקטיבי פלזמה - ספקטרומטריית מסה באמצעות ידוע מטאלופרוטאין (א) פרופיל Elution לתקנים מטאלופרוטאין המבוססים על מתכות המיוחסים להם.. (ב) עקומת כיול משקל מולקולרי עבור thyroglobulin סטנדרטים חלבון (i), פריטין (ii), ceruloplasmin (iii), conalbumin (iv), Cu / Zn SOD (v) concanavalin A (vi).<html> &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig2.jpg" /> השתמש באיור 2. של פריטין ו- Cu / Zn SOD כתקנים מטאלופרוטאין כדי לקבוע את סכום Cu, Fe או Zn הקשורים מטאלופרוטאין בדגימת ביולוגיות מורכבות (א) פרופיל Elution עבור פריטין מעל טווח זריקה 2,000 -. 60,000 מיקרוגרם / ליטר של ברזל. (ב) ו- (ג) פרופיל Elution עבור SOD Cu / Zn פני טווח זריקה של 200 - 6,000 מיקרוגרם / ליטר של נחושת ואבץ, בהתאמה. (ד), (ה) ו- (ו) להראות את התוצאות ניתוח רגרסיה עבור ברזל מתכות, נחושת ואבץ, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> &quot;Jove_content&quot; FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig3.jpg" /> איור 3. Cu, Fe ו Zn Metalloproteome של המוח האנושי. (א) זכר נחושת (B) הברזל קורט (C) אבץ עקבות. Elution של סטנדרטי חלבון לכל מתכת מוצג על ידי הזכר השחור עם המשקל המולקולרי שלהם הצביע מתחת לתרשים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig4.jpg" /> איור 4. Cu, Fe ו Zn Metalloproteome עבור אדם פלזמה. (א) זכר נחושת (B) ברזל קורט (C) אבץ עקבות. Elution של סטנדרטי חלבון לכל מתכת מוצג על ידי הזכר השחור עם המשקל המולקולרי שלהםdicated מתחת לתרשים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS at JoVE.com

Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.

התקנים עבור כמותי Metalloproteomic ניתוח באמצעות גודל הרחקת ICP-MS

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of ...

standards-for-quantitative-metalloproteomic-analysis-using-size

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Chemistry

Unit 1

Atomic Spectroscopy

SCIENTISTS IN ACTION

15.0K Views.  The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health. Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins. 

Video: Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between samples using mass spectrometry. ReDi labeling is performed using either regular (light) or deuterated (heavy) forms of formaldehyde and sodium cyanoborohydride to add two methyl groups to each free amine. Here we demonstrate a robust protocol for ReDi labeling and quantitative comparison of complex protein mixtures. Protein samples for comparison are digested into peptides, labeled to carry either light or heavy methyl tags, mixed, and co-analyzed by LC-MS/MS. Relative protein abundances are quantified by comparing the ion chromatogram peak areas of heavy and light labeled versions of the constituent peptide extracted from the full MS spectra. The method described here includes sample preparation by reversed-phase solid phase extraction, on-column ReDi labeling of peptides, peptide fractionation by basic pH reversed-phase (BPRP) chromatography, and StageTip peptide purification. We discuss advantages and limitations of ReDi labeling with respect to other methods for stable isotope incorporation. We highlight novel applications using ReDi labeling as a fast, inexpensive, and accurate method to compare protein abundances in nearly any type of sample.

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a rapid, inexpensive strategy for accurate mass spectrometry-based quantitative proteomics. Here we demonstrate a robust method for preparation and analysis of protein mixtures using the ReDi approach that can be applied to nearly any sample type.

פרוטאומיקה כמותית באמצעות Reductive Dimethylation לתיוג איזוטופ יציב

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

בחינה כמותית ואיכותי של אינטראקציות חלקיקי חלקיקים באמצעות קולואיד Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These biomolecules arrange in paracrystalline two-dimensional arrays on surfaces, bind metals, and are thus interesting for several biotechnical applications, such as biosorptive materials for the removal or recovery of different elements from the environment and industrial processes. The deposition of Au(0) nanoparticles on S-layers, either by S-layer directed synthesis 1 or adsorption of nanoparticles, opens new possibilities for diverse sensory applications. Although numerous studies have described the biosorptive properties of S-layers 2-5, a deeper understanding of protein-protein and protein-metal interaction still remains challenging. In the following study, inductively coupled mass spectrometry (ICP-MS) was used for the detection of metal sorption by suspended S-layers. This was correlated to measurements of quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D), which allows the online detection of proteinaceous monolayer formation and metal deposition, and thus, a more detailed understanding on metal binding.
The ICP-MS results indicated that the binding of Au(III) to the suspended S-layer polymers is pH dependent. The maximum binding of Au(III) was obtained at pH 4.0. The QCM-D investigations enabled the detection of Au(III) sorption as well as the deposition of Au(0)-NPs in real-time during the in situ experiments. Further, this method allowed studying the influence of metal binding on the protein lattice stability of Slp1. Structural properties and protein layer stability could be visualized directly after QCM-D experiment using atomic force microscopy (AFM). In conclusion, the combination of these different methods provides a deeper understanding of metal binding by bacterial S-layer proteins in suspension or as monolayers on either bacterial cells or recrystallized surfaces.

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

To obtain basic information on the sorption and recycling of gold from aqueous systems the interaction of Au(III) and Au(0) nanoparticles on S-layer proteins were investigated. The sorption of protein polymers was investigated by ICP-MS and that of proteinaceous monolayers by QCM-D. Subsequent AFM enables the imaging of the nanostructures.

Au-אינטראקציה של הפולימרים Slp1 וחד שכבתי מ<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, ICP-MS וAFM ככלים לbiomolecule-מתכת לימודים

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic acids containing three to six carbons), such as malate and citrate, are critical to the proper functioning of many biological systems, where they function in cellular respiration and can serve as indicators of cell health. In foods, organic acid content can have significant impact on taste, with increased SCCA levels resulting in a sour or &#34;acid&#34; taste. Because of this, methods for the rapid analysis of organic acid levels are of particular interest to the food and beverage industries. Unfortunately, however, most methods used for SCCA quantification are dependent on time-consuming protocols requiring the derivatization of samples with hazardous reagents, followed by costly chromatographic and/or mass spectrometric analyses. This method details an alternate method for the detection and quantification of organic acids from plant material and food samples using free zonal capillary electrophoresis (CZE), sometimes simply referred to as capillary electrophoresis (CE). CZE provides a cost-effective method for measuring SCCAs with a low limit of detection (0.005 mg/ml). This article details the extraction and quantification of SCCAs from plant samples. While the method provided focuses on measurement of SCCAs from coffee beans, the method provided can be applied to multiple plant-based food materials.

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

This article presents a method for the detection and quantification of organic acids from plant material using free zonal capillary electrophoresis. An example of the potential application of this method, determining the effects of a secondary fermentation on organic acid levels in coffee seeds, is provided.

באמצעות אלקטרופורזה נימים לכמת חומצות אורגניות מרקמות צמח: מקרה מבחן בחינה<em&gt; קפה ערביקה</em&gt; זרעים

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a technique used to measure the size distribution of polymer solutions or colloidal particles. Although this technique is widely used for the assessment of polymer solutions, it is difficult to measure the particle size in concentrated solutions due to the multiple scattering effect or strong light absorption. Therefore, the concentrated solutions should be diluted before measurement. Implementation of the confocal optical component in a dynamic light scattering microscope1 helps to overcome this barrier. Using such a microscopic system, both transparent and turbid systems can be analyzed under the same experimental setup without a dilution. As a representative example, a size distribution measurement of a temperature-responsive polymer solution was performed. The sizes of the polymer chains in an aqueous solution were several tens of nanometers at a temperature below the lower critical solution temperature (LCST). In contrast, the sizes increased to more than 1.0 &#181;m when above the LCST. This result is consistent with the observation that the solution turned turbid above the LCST.

A protocol for the direct measurement of particle size distribution in concentrated solutions using dynamic light scattering microscopy is presented.

מדידת הפצת החלקיקים גודל פתרונות דלוחים ידי Dynamic Light פיזור מיקרוסקופי

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being leveraged for developing sophisticated photonic sensors. Silicon photonic sensors seek to exploit the strong confinement of light in nano-waveguides to transduce changes in physical state to changes in resonance frequency. In the case of thermometry, the thermo-optic coefficient, i.e., changes in refractive index due to temperature, causes the resonant frequency of the photonic device such as a Bragg grating to drift with temperature. We are developing a suite of photonic devices that leverage recent advances in telecom compatible light sources to fabricate cost-effective photonic temperature sensors, which can be deployed in a wide variety of settings ranging from controlled laboratory conditions, to the noisy environment of a factory floor or a residence. In this manuscript, we detail our protocol for the fabrication and testing of photonic thermometers.

We describe the process of fabrication and testing of photonic thermometers.

ייצור ובדיקה של מדי חום פוטוני

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Nanosponge Tunability in Size and Crosslinking Density

We describe a protocol for the synthesis of linear polyesters containing pendant epoxide functionality and their incorporation into a nanosponge with controlled dimensions. This approach begins with synthesis of a functionalized lactone which is key to the pendant functionalization of the resulting polymer. Valerolactone (VL) and allyl-valerolactone (AVL) are then copolymerized using ring-opening polymerization. Post-polymerization modification is then used to install an epoxide moiety on some or all of the pendant allyl groups. Epoxy-amine chemistry is employed to form nanoparticles in a dilute solution of both polymer and small molecule diamine crosslinker based on the desired nanosponge size and crosslinking density. Nanosponge sizes can be characterized by transmission electron microscopy (TEM) imaging to determine the dimension and distribution. This method provides a pathway by which highly tunable polyesters can create tunable nanoparticles, which can be used for small molecule drug encapsulation. Due to the nature of the backbone, these particles are hydrolytically and enzymatically degradable for a controlled release of a wide range of hydrophobic small molecules.

This article describes a process for tuning the size and crosslinking density of covalently crosslinked nanoparticles from linear polyesters containing pendant functionality. By tailoring synthesis parameters (polymer molecular weight, pendant functionality incorporation, and crosslinker equivalents), a desired nanoparticle size and crosslinking density can be achieved for drug delivery applications.

Nanosponge Tunability ב גודל וצפיפות Crosslinking

We describe a protocol for the synthesis of linear polyesters containing pendant epoxide functionality and their incorporation into a nanosponge with ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to diversify the fiber choices in the United States body armor market, copolymer fibers based on the combination of 5-amino-2-(p-aminophenyl) benzimidazole (PBIA) and the more conventional PPTA were introduced. Little is known regarding the long-term stability of these fibers, but as condensation polymers, they are expected to have potential sensitivity to moisture and humidity. Therefore, characterizing the strength of the materials and understanding their vulnerability to environmental conditions is important for evaluating their use lifetime in safety applications. Ballistic resistance and other critical structural properties of these fibers are predicated on their strength. To accurately determine the strength of the individual fibers, it is necessary to disentangle them from the yarn without introducing any damage. Three aramid-based copolymer fibers were selected for the study. The fibers were washed with acetone followed by methanol to remove an organic coating that held the individual fibers in each yarn bundle together. This coating makes it difficult to separate single fibers from the yarn bundle for mechanical testing without damaging the fibers and affecting their strength. After washing, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy was performed on both washed and unwashed samples and the results were compared. This experiment has shown that there are no significant variations in the spectra of poly(p-phenylene-benzimidazole-terephthalamide-co-p-phenylene terephthalamide) (PBIA-co-PPTA1) and PBIA-co-PPTA3 after washing, and only a small variation in intensity for PBIA. This indicates that the acetone and methanol rinses are not adversely affecting the fibers and causing chemical degradation. Additionally, single fiber tensile testing was performed on the washed fibers to characterize their initial tensile strength and strain to failure, and compare those to other reported values. Iterative procedural development was necessary to find a successful method for performing tensile testing on these fibers.

The primary goal of the study is to develop a protocol to prepare consistent specimens for accurate mechanical testing of high strength copolymer aramid fibers, by removing a coating and disentangling the individual fiber strands without introducing significant chemical or physical degradation.

Disentangling חוזק גבוה קופולימר ארמיד סיבים כדי לאפשר קביעת תכונות מכניות שלהם

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

Application of Voltage in Dynamic Light Scattering Particle Size Analysis

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. Modern instrumentation permits measurement of particle size as a function of time and/or temperature, but currently there is no simple method for performing DLS particle size distribution measurements in the presence of applied voltage. The ability to perform such measurements would be useful in the development of electroactive, stimuli-responsive polymers for applications such as sensing, soft robotics, and energy storage. Here, a technique using applied voltage coupled with DLS and a temperature ramp to observe changes in aggregation and particle size in thermoresponsive polymers with and without electroactive monomers is presented. The changes in aggregation behavior observed in these experiments were only possible through the combined application of voltage and temperature control. To obtain these results, a potentiostat was connected to a modified cuvette in order to apply voltage to a solution. Changes in polymer particle size were monitored using DLS in the presence of constant voltage. Simultaneously, current data were produced, which could be compared with particle size data, to understand the relationship between current and particle behavior. The polymer poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAM) served as a test polymer for this technique, as pNIPAM's response to temperature is well-studied. Changes in the lower-critical solution temperature (LCST) aggregation behavior of pNIPAM and poly(N-isopropylacrylamide)-block-poly(ferrocenylmethyl methacrylate), an electrochemically active block-copolymer, in the presence of applied voltage are observed. Understanding the mechanisms behind such changes will be important when trying to achieve reversible polymer structures in the presence of applied voltage.

Here, a protocol to apply voltage to solution during dynamic light scattering particle size measurements with the intent to explore the effect of voltage and temperature changes on polymer aggregation is presented.

יישום מתח בניתוח מידת החלקיקים של פיזור אור דינמי

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. ...

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative conditions. Excessive iron results in free redox-active Fe(II) and can cause devastating effects within the cell like oxidative stress (OS) and death by lipid peroxidation known as ferroptosis (FPT). Therefore, quantitative measurements of ferrous (Fe(II)) and ferric (Fe(III)) iron rather than total Fe-determination is the key for closer insight into these detrimental processes. Since Fe(II)/(III) determinations can be hampered by fast redox-state shifts and low concentrations in relevant samples, like cerebrospinal fluid (CSF), methods should be available that analyze quickly and provide low limits of quantification (LOQ). Capillary electrophoresis (CE) offers the advantage of fast Fe(II)/Fe(III) separation and works without a stationary phase, which could interfere with the redox balance or cause analyte sticking. CE combined with inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) as a detector offers further improvement of detection sensitivity and selectivity. The presented method uses 20 mM HCl as a background electrolyte and a voltage of +25 kV. Peak shapes and concentration detection limits are improved by conductivity-pH-stacking. For reduction of 56[ArO]+, ICP-MS was operated in the dynamic reaction cell (DRC) mode with NH3 as a reaction gas. The method achieves a limit of detection (LOD) of 3 &#181;g/L. Due to stacking, higher injection volumes were possible without hampering separation but improving LOD. Calibrations related to peak area were linear up to 150 &#181;g/L. Measurement precision was 2.2% (Fe(III)) to 3.5% (Fe(II)). Migration time precision was &#60;3% for both species, determined in 1:2 diluted lysates of human neuroblastoma (SH-SY5Y) cells. Recovery experiments with standard addition revealed accuracy of 97% Fe(III) and 105 % Fe(II). In real-life bio-samples like CSF, migration time can vary according to varying conductivity (i.e., salinity). Thus, peak identification is confirmed by standard addition.

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

This iron redox speciation method is based on capillary electrophoresis-inductively coupled plasma mass spectrometry with sample stacking combined with short analysis in one run. The method quickly analyzes and provides low limits of quantification for iron redox species across a diverse range of tissues and biofluid samples.

התקנה של ספקטרומטריה של מסת פלזמה (CE-ICP-MS) לכמת את מיני ברזל רדוקס (Fe(II), Fe(III)

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...