This work was supported by the Institute National du Cancer (INCa-DGOS-4664).

1. בידוד נויטרופילים ושיתוף תרבות עם תאים leukemic ראשוניים הערה: פרוצדורות נערכו בכפוף לאישור של ועדת האתיקה ליון החולים עם כל החולים חתימת הסכמה מדעת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של תאים leukemic ראשוניים נויטרופילים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף צינורות דם היקפי על EDTA (1.8 מ&quot;ג EDTA למיליליטר דם) מן החולים שאובחנו עם לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כל 15 מ&quot;ל של דם אל צינור 50 מ&quot;ל סטרילי לדלל עם 15 מ&quot;ל RPMI (דילול 1: 1), אז בזהירות ולאט לאט להוסיף 15 מ&quot;ל של תמיסת שיפוע צפיפות לתחתית הצינור ללא ערבוב בשלבים. ודא כי פתרון שיפוע הצפיפות הוא ב RT לעריכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 300 במשך 35 דקות ב RT וללא בלמים. הדם צריך להפריד לארבעה שלבים ברורים כפי שמוצג באיור 1 א &#39;, מלמעלה למטה: טסיות ופלסמה, תאים mononuclear (wהייט טבעת), פתרון שיפוע צפיפות, גרנולוציטים ו אריתרוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את הטבעת לבן המייצג את התאים leukemic ראשוניים עם טפטפת פלסטיק פסטר והעברת צינור חדש 50 מ&quot;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את הצינור עם PBS (מכיל סידן ומגנזיום) עד 50 מ&quot;ל בסך הכל צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה עם 5 מ&quot;ל PBS ולאחר מכן להוסיף PBS עד 50 מ&quot;ל בסך הכל צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה עם המדיום RPMI שלם (RPMI 1640 בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS), 2 מ&quot;מ גלוטמין, 100 U / פניצילין מ&quot;ל ו 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין) לספירת באמצעות הדלפק כדאיות התא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את השלבים העליונים עוזב את השלב גרנולוציטים ו אריתרוציטים ולהוסיף PBS עד 25 מ&quot;ל ולאחר מכן להוסיף dextran 3% ב 0.9% NaClup 50 מיליליטר בסך הכל. מערבבים את צינורות 10 פעמים ולשמור אותם במשך 30 דקות ב RT ללא ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את שכבת נויטרופילים RBC-עניים העליוןd ולהכניס אותם לתוך צינור נקי סטרילי 50 מ&quot;ל ו צנטריפוגות צינורות ב 300 גרם במשך 10 דקות ב RT. Resuspend כל גלולה עם 5 מ&quot;ל PBS ולאחר מכן להוסיף למאגר תמוגה התא אדום עד 50 מ&quot;ל בסך הכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הצינורות בחושך במשך 15 דקות ב RT אז צנטריפוגות ב 500 גרם במשך 10 דקות ב RT. לשטוף את הכדורים עם PBS (להוסיף PBS עד 50 מיליליטר בסך הכל) ולאחר מכן צנטריפוגות ב 500 גרם במשך 10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדורים עם מדיום RPMI מלא ל לספור באמצעות דלפק כדאי תא. שמור 3 x 10 5 של כל סוג תא ב 50 μl PBS-FBS (4%) צינורות פלסטיק 5 מ&quot;ל כדי לקבוע את טוהר הבידוד שלהם באמצעות cytometry הזרימה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח ההופעות מורפולוגי של אוכלוסיות תאים המבודדות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשם כך, resuspend כל 3 x 10 4 נויטרופילים 3 x 10 4 תאים mononuclear ב 150 μl שלם בינוני RPMI. הרכיבו את שקופיות זכוכית, כרטיסי מסנן, ותאי מדגם בצנטריפוגה cytospin, להבטיח כי לאהוא צנטריפוגות מאוזן היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל סוג תא אל תא מדגם צנטריפוגות ציטומגלווירוס ב 750 XG במשך 10 דקות ב RT הסר את השקופיות, כרטיסי מסנן, ותאי מדגם מתוך צנטריפוגה. לפרק בזהירות, כדי לא לגרום נזק לתאים בשקופית. בטל כרטיסי מסנן ותא מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם התאים באמצעות ערכת מכתים Giemsa ולשמור את השקופיות עבור השעה 1 לייבוש. בדוק את התאים על ידי מיקרוסקופ עם הגדלה 100x. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הטוהר של תאים מבודדים על ידי FACS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התווית תאי leukemic ראשוני המבודדים עם נוגדני CD19 אנטי אנושיים מצומדות כדי APC (5 μl / 10 6 תאים). לייבל נויטרופילים מטוהרים עם תערובת של נוגדנים אנטי אנושי המפורטים בטבלה 1 (5 μl / 10 6 תאים). דגירת התאים בחושך במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם 500 μl PBS-FBS (4%) בצנטריפוגה צינורות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">Resuspend כל גלולה ב 200 μl PBS-FBS (4%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח על cytometer זרימה באמצעות התצורה האופטית הבאה: 488 ננומטר ליזר: FSC-A (488 ננומטר), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PerCP-Cy5.5 (695/40 BP ), PE (575/26 BP); 633 ננומטר לייזר: APC (660/20 BP), APC-Cy7 (780/60 BP). ודא פיצוי הצבע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coculture של תאים leukemic ראשוניים עם נויטרופילים עצמיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Seed 2 x 10 5 תאים / מ&quot;ל של תאים leukemic ראשוניים לבד או עם נויטרופילים עצמיים בשעה 1:10 יחס במדיום RPMI להשלים. לשם כך, להתאים מספרים סלולריים על ידי המתלים תא דילול ולהוסיף 2 x 10 5 תאים / מ&quot;ל של תאים leukemic ראשוניים עד 2 x 10 6 תאים / מ&quot;ל נויטרופילים. מערבבים בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 מיקרומטר של טירוזין קינאז של ברוטון (BTK) מעכב (ibrutinib) אל התאים. דגירה של 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תא ניתוח FACS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> collect התאים צינורות פלסטיק 5 מ&quot;ל לניתוח צנטריפוגות FACS צינורות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. לשטוף את כדורי עם 1 מ&quot;ל PBS-FBS (4%) ולאחר מכן צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדורי Resuspend ב Annexin V ו- PI באמצעות ערכה מסחרית ו דגירת התאים בחושך במשך 10 דקות ב RT. לנתח על cytometer זרימה באמצעות אסטרטגית gating של איור 2 א ו בתצורה האופטית הבאה: ליזר 488 ננומטר: FSC-A (488 ננומטר), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP). ודא פיצוי הצבע. </li></ol></li></ol> בידול 2. של תאים HL60 לאורך נתיב granulocytic ו Coculture שלהם עם תאים RL לימפומה B ב 3D דגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיפרנציאציה של פרומיילוציטית האדם (HL60) תאים לתוך תאים נויטרופילים דמוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם מספר הסלולרי HL60 עד 3 x 10 5 תאים / מ&quot;ל ולאחר מכן להוסיף 1 מיקרומטר החומצה הרטינואית (RA) ו -1.25% DMSO להשרות התמיינות שלהם. כל זרע 3 x 10 5 </sעד&gt; תאי HL60 לכל היטב צלחת 48 היטב ואז דגירה במשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאוחר יותר, לאסוף את התאים צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. Resuspend תאים עם מדיום RPMI מלא ל לספור באמצעות דלפק כדאי תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז לדלל ההשעיה תא בינוני RPMI מלאה, ומשנה את מספר הנייד HL60 עד 3 x 10 5 תאים / מ&quot;ל ולגרום שוב הבידול שלהם על ידי הוספת 1 ​​מיקרומטר החומצה הרטינואית (RA) ו -1.25% DMSO. כל זרע 3 x 10 5 HL60 תאים לכל היטב צלחת 48-היטב דגירה במשך 48 אחר שעה על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח של בידול HL60 (הבדל HL60) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוספים את התאים צנטריפוגות צינורות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. Resuspend גלול עם מדיום RPMI מלא ל לספור באמצעות דלפק כדאי תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את השינויים בביטוי סמנים על פני קרום התא על ידי cytometry הזרימה. מניחים כל 3 x 10 5 </sup&gt; תאים שלא עברו התמיינות HL60 (מ תרבית תאים) ו -3 x 10 5 HL60 תאים diff צינורות פלסטיק 5 מ&quot;ל לניתוח FACS ו צנטריפוגות צינורות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדורים ב 50 μl PBS-FBS (4%). לייבל את התאים עם אנטי אנושי CD11b מצומדות כדי AF700 או CD38 אנטי אנושי מצומדות כדי APC (5 μl / 10 6 תאים). דגירת התאים בחושך במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם 500 μl PBS-FBS (4%) ולאחר מכן צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. Resuspend את הכדורים ב 200 μl PBS-FBS (4%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח על cytometer זרימה באמצעות אסטרטגיה gating של איור 3A ואת התצורה האופטית הבאים: 488 ננומטר לייזר: FSC-A (488 ננומטר), SSC-A (488 / 10BP); לייזר ננומטר 633: APC (660/20 BP), Alexa פלואוריד 700 (730/45 BP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק את השינויים מורפולוגיים diff HL60, לשתק את התאים על גבי שקופיות זכוכית לבדיקה מיקרוסקופית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשם כך, resuspend כל 3 x 10 <sup&gt; 4 תאים שלא עברו התמיינות HL60 (מ תרבית תאים) ו -3 x 10 4 diff HL60 ב 150 μl שלם בינוני RPMI. הרכיבו את שקופיות זכוכית, כרטיסי מסנן, ותאי מדגם בצנטריפוגה cytospin, להבטיח כי צנטריפוגות מאוזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל סוג תא אל תא מדגם צנטריפוגות ציטומגלווירוס ב 1500 סל&quot;ד במשך 10 דקות ב RT. הסר את השקופיות, כרטיסי מסנן, ותאי מדגם מתוך צנטריפוגה. לפרק בזהירות, כדי לא לגרום נזק לתאים בשקופית. בטל כרטיסי מסנן ותא מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם התאים באמצעות ערכת מכתים Giemsa ולשמור את השקופיות עבור השעה 1 לייבוש. בדוק את התאים על ידי מיקרוסקופ עם הגדלה 100x. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3-ממדי (3D) תרבות הערה: ודא כי החומרים המשמשים בניסוי זה הם קרים הניסוי מתקיים על קרח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל 5 x 10 4 תאים RL, לבד או מעורבב עם הבדל HL60 </em&gt; ב יחס RL: diff HL60 1:10, עם 300 μl מטריצה ​​קרום המרתף באמצעות 1 מ&quot;ל קצה פיפטה לחתוך עם מספריים סטרילי כדי להרחיב את הפתח לכ 2 עד 3 מ&quot;מ. הימנע בועות במהלך שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל זרע 300 μl של השעית תא / גם בצלחת 24 גם. הימנע בועות במהלך שלב זה. דגירה את הצלחת למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 ולאחר מכן להוסיף 1 מ&quot;ל להשלים בינוני RPMI לכל היטב דגירה במשך 7 ימים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. שנה את בינונית כל יומיים. הוסף 10 ננומטר vincristine ביום 5. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח FACS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 7 ימים של תרבות, לשאוב את המדיום ולשטוף היטב עם כל 1 מ&quot;ל קר כקרח PBS פעמיים. הוסף 3 מ&quot;ל / היטב קר כקרח PBS-EDTA (5 מ&quot;מ). לנתק את ג&#39;ל מתחתית הבאר על ידי גירוד באמצעות בתחתית 200 קצה פיפטה μl. לנער את הצלחת בעדינות על קרח למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את ההשעיה התא לתוך צינור 15 מ&quot;ל סטרילי ולנער את צינורות בעדינות על icדואר למשך 30 דקות אחרות. בדקו את המראה של השעית תא הומוגנית. (אם זה לא המקרה, אז לנער את התאים במשך זמן ארוך יותר או להוסיף עוד PBS-EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה צינורות ב XG 300 במשך 10 דקות ב RT. לשטוף את הכדורים עם PBS אז צנטריפוגות ב XG 300 במשך 10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend עם PBS-FBS (4%) ו תווית עם נוגדנים CD19 אנטי אנושי מצומדות כדי PE-Cy7 ו נוגדן CD38 אנטי אנושי מצומדות כדי APC (5 μl / 10 6 תאים). דגירה בחושך במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם 500 μl PBS-FBS (4%) ולאחר מכן צינורות צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. Resuspend תאים עם Annexin V ו- PI באמצעות ערכה מסחרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח על cytometer זרימה באמצעות אסטרטגית gating של איור 4 א ו בתצורה האופטית הבאה: 488 ננומטר ליזר: FSC-A (488 ננומטר), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); 633 ננומטר לייזר: APC (660/20 BP). ודא פיצוי הצבע. </li></ol></li&gt; </ol>

<ol>
	<li>Gocheva, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-4+induces+cathepsin+protease+activity+in+tumor-associated+macrophages+to+promote+cancer+growth+and+invasion.">IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion.</a> Genes Dev. 24, 241-255 (2010).</li><li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity,+Inflammation,+and+Cancer.">Immunity, Inflammation, and Cancer.</a> Cell. 140, 883-899 (2010).</li><li>Mitchem, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor-infiltrating+macrophages+decreases+tumor-initiating+cells,+relieves+immunosuppression,+and+improves+chemotherapeutic+responses.">Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses.</a> Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).</li><li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Complexity+Predicts+Breast+Cancer+Survival+and+Functionally+Regulates+Response+to+Chemotherapy.">Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy.</a> Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).</li><li>Di Carlo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intriguing+role+of+polymorphonuclear+neutrophils+in+antitumor+reactions.">The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions.</a> Blood. 97, 339-345 (2001).</li><li>Kumar, V., Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+Cinderella+of+innate+immune+system.">Neutrophils: Cinderella of innate immune system.</a> Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).</li><li>Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+the+activation+and+regulation+of+innate+and+adaptive+immunity.">Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).</li><li>Kelbaek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+isolation+of+polymorphonuclear+leukocytes+from+large+blood+volumes.">Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes.</a> J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. F&#252;rKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).</li><li>Aynaud, M. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Tribbles+3+protects+nuclear+DNA+from+cytidine+deamination+by+APOBEC3A.">Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A.</a> J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).</li><li>Zi&#242;&#322;kowska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+three-dimensional+cell+culture+and+anticancer+drug+activity+evaluation+in+a+microfluidic+chip.">Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip.</a> Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).</li><li>Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+method+for+the+isolation+of+neutrophils+in+high+yield+without+the+use+of+dextran+or+density+gradient+polymers.">Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers.</a> J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).</li><li>Behnen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+immune+complexes+induce+neutrophil+extracellular+trap+release+by+human+neutrophil+granulocytes+via+Fc&#947;RIIIB+and+Mac-1.">Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via Fc&#947;RIIIB and Mac-1.</a> J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).</li><li>Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+are+not+less+sensitive+than+other+blood+leukocytes+to+the+genomic+effects+of+glucocorticoids.">Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids.</a> PloS One. 7, 44606 (2012).</li><li>Dorward, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+advance:+autofluorescence-based+sorting:+rapid+and+nonperturbing+isolation+of+ultrapure+neutrophils+to+determine+cytokine+production.">Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production.</a> J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).</li><li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Purification+and+Labeling+of+Mouse+Bone+Marrow+Neutrophils+for+Functional+Studies+and+Adoptive+Transfer+Experiments.">Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments.</a> J Vis Exp. , e50586 (2013).</li><li>Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaplasmaphagocytophilum+reduces+neutrophil+apoptosis+in+vivo.">Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo.</a> Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).</li><li>Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+of+neutrophils.">Apoptosis of neutrophils.</a> ActaHaematol. 111, 56-66 (2004).</li><li>Dalton, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HL-60+cell+line+was+derived+from+a+patient+with+FAB-M2+and+not+FAB-M3.">HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3.</a> Blood. 71, 242-247 (1988).</li><li>Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+normal+and+transformed+epithelial+cells:+Their+contributions+to+tumourigenesis.">Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).</li><li>Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissue+cultures:+current+trends+and+beyond.">Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond.</a> Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).</li><li>Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+Neutrophils,+and+Cancer:+A+Double+Edged+Sword.">Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword.</a> New J. Sci. , 271940 (2014).</li><li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessories+to+the+crime:+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment.">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).</li><li>Shojaei, F., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractoriness+to+antivascular+endothelial+growth+factor+treatment:+role+of+myeloid+cells.">Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells.</a> Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).</li><li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+promote+the+malignant+glioma+phenotype+through+S100A4.">Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4.</a> Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).</li><li>Teramukai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+neutrophil+count+as+an+independent+prognostic+factor+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer:+an+analysis+of+Japan+Multinational+Trial+Organisation+LC00-03.">Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03.</a> Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).</li><li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IL-6-STAT3+axis+mediates+a+reciprocal+crosstalk+between+cancer-derived+mesenchymal+stem+cells+and+neutrophils+to+synergistically+prompt+gastric+cancer+progression.">The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression.</a> Cell Death Dis. 5, 1295 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

המתוארת כאן, פרוטוקול יעיל, פשוט, מהיר וזול עבור הבידוד של נויטרופילים מדם אנושי עם טוהר גבוה שימוש בגישת צנטריפוגה שיפוע צפיפות ובתוך אותם תאי mononuclear הצעד מופרדים גם וחלים. אוכלוסיות התאים הבודדות הן ≥90% טהורות. שיטות קיימות מספ?...

<html> תאים חיסוניים מולדים מהווים שיעור מהותי של תאים במיקרו-סביבה של הגידול קושרו עם ממאירות הגידול בחולים ומודלים של בעלי חיים של סרטן 1. לאחרונה, זה הפך להיות יותר מוערך נרחב שתגובות חיסוניות כרוניות תפקיד קריטי בקידום התקדמות גידול, גרורות והתנגדות לכימותרפיה 2. המקרופאגים חשובים תאים חיסוניים מולדים אשר הוכחו להסדיר ישירות בתגובה תאים סרטניים לכימותרפיה 3,4. עם זאת, את התפקיד של נויטרופילים, שחקני מפתח במערכת החיסון המולדת, בוויסות תגובת הגידול לטיפול נגד סרטן אינו ידוע. מטרות הפרוטוקולים הללו הן להשתמש בשיטה מהירה ואמינה להפריד נויטרופילים מדגימים הדם של מטופל CLL וכדי להבדיל תאי HL60 לאורך מסלול granulocytic כדי ללמוד את תפקידם בויסות הרגישות של תאי לימפומה לסוכנים נגד לימפומה. = &quot;jove_content&quot;&gt; נויטרופילים הם מרכיב הסלולר הנפוץ ביותר של מערכת החיסון המולדת בדם 5 ולפעול כקו ההגנה הראשון נגד פולשים מיקרואורגניזמים 6. יש נויטרופילים תפקיד חיוני עולה תגובות חיסון מולדות יעילות בנוסף לפונקציות מפעיל משתנות במצבים פתולוגיים מספר 7. לכן, שיטה מהירה ואמינה כדי לבודד נויטרופילים מתאי דם אחרים, כגון שיטת הפרדת שיפוע צפיפות, נדרשה לבדיקות במבחנה. באמצעות שיטה זו לבידוד נויטרופילים יקל על המשך מחקר פונקציות חיסוניות בתיווך נויטרופילים in vivo לשעבר vivo. היכולת להשיג אוכלוסיות טהורות של נויטרופילים היא צעד ראשון חשוב לחקירת חולים עם מחלות אימונולוגיות 8. שיטת צפיפות הפרדת שיפוע היא טכניקה אידיאלית שבו תשואה גבוהה של תאים מתקבלת. methoד יהיה כרוך בתוספת פתרון שיפוע צפיפות בתחתית צינור המכיל דם אדם מדולל ואחריו צנטריפוגה ב 300 גרם במשך 35 דקות ללא הפסקה. הטבעת של תאי mononuclear מופיעה על הממשק ואת נויטרופילים מתגוררים מתחת לשעבר. יש שיטה זו יתרונות משמעותיים ביחס משיטות אחרות כגון ערכות בידוד נויטרופילים שהן הרבה יותר 9 יקרים. בנוסף, בידוד נויטרופילים מדם אנושי על ידי ערכות מסחריות באמצעות נוגדנים המכוונים סמן משטח ספציפי עבור נויטרופילים אדם, להגביר את הסיכון של הפעלה או התמיינות תאים. שיטת ההפרדה צפיפות שיפוע מאפשר בידוד של נויטרופילים בתוך פרק זמן קצר. בתוך אותו שלב, תאים mononuclear גם מופרדים והחלים. זוהי טכניקה בסיסית שבה תשואה גבוהה של תאים טהורים מתקבלת על מנת להשיג שלמות תפקודית. על מנת לחקות את הגידול microenvironment, ניסויי 3D בוצעו. בהינתן זמן מחצית החיים הקצר של נויטרופילים במבחנה, ניסויי 3D עם נויטרופילים אדם טריים אינם חד משמעיים. מסיבה זו, פרומיילוציטית (HL60) תאים מושרים להתמיין לתאי נויטרופילים דמוי באמצעות מעוררי הבידול sulfoxide דימתיל (DMSO) ו חומצה רטינואית (RA). שימוש בתאי HL60 בדיל (הבדל HL60) ימנע שיש תגובות שונות של נויטרופילים בשל בידוד מתורמים שונים. ב 3D במבחנה מודלים תרבות מייצגים שלב ביניים בין מודלים 2D במבחנה במודלים vivo. בתרבות 2D, התאים להתפשט על פני פלסטיק ויוצרים מצורפים התא טבעי לחלבונים שהופקדו כי הם מפוגל על ​​משטח סינתטי זה. לעומת זאת, התאים מצורפים תאים תאים טבעי טופס תרבות 3D מאז התאים ואת תאי מטריקס הם לסנתז הם חומר טבעי אשר הם מחוברים.מסיבה זו, מודלי שיתוף תרבות 3D, במיוחד בין תאים סרטניים סוגי תאים אחרים, היו מאוד שימושיים המציין תרומתם צמיחת גידול, אנגיוגנזה, וגרורות. כתוצאה מכך, תרבויות 3D להפוך את תרבית תאים לחקות את התנאים הפיזיולוגיים הקיימים vivo 10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1161">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">RPMI 1640&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:156px;">21875-034</td>
			<td style="width:535px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium)</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:156px;">25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin streptomycin (Pen Strep)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bruton&#39;s tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib)&#160;</td>
			<td style="width:157px;">CliniSciences</td>
			<td style="width:156px;">A3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vincristine&#160;</td>
			<td style="width:157px;">EG labo</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">BD Matrigel basement membrane matrix&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354234</td>
			<td>Put at 4 oC overnight before the day of the experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Red cell lysis buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td style="width:156px;">555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll (Pancoll)</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td style="width:156px;">P04-60500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Retinoic acid</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td style="width:535px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Annexing V-FLOUS staining kit&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Roche</td>
			<td>11&#160;988&#160;549&#160;001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit</td>
			<td style="width:157px;">Cosmos Biomedical</td>
			<td style="width:156px;">CB361550-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSRII flow cytometry</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica DMR-XA microscope</td>
			<td style="width:157px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter</td>
			<td style="width:157px;">Nexcelom&#160; Bioscience</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neutrophil isolation and analysis to determine their role in lymphoma cell sensitivity to therapeutic agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

שיטת צפיפות ההפרדה שיפוע המתואר כאן מספק תאים leukemic ראשוניים נויטרופילים unstimulated מבודדים מהדם של חולי CLL איור 1A מייצג את שכבות הדם השונות שהתקבלו לאחר צנטריפוגה שיפוע צפיפות (מלמעלה למטה:. טסיות ופלסמה, טבעת לבן מייצג את התאים mononuclear, צפיפות ש...

Watch this Scientific Journal Video about Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents at JoVE.com

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

neutrophil-isolation-analysis-to-determine-their-role-lymphoma-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.2K Views.  Cancer Research Center in Lyon. Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. 

Video: Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified mice, such as Atm-/- and p53-/- consistently develop thymic lymphoma early in life 1,2, and thus, can serve as a reliable source for derivation of murine T-cell lines. Here we present a detailed protocol for the development of established murine thymic lymphoma T-cell lines without the need to add interleukins as described in previous protocols 1,3. Tumors were harvested from mice aged three to six months, at the earliest indication of visible tumors based on the observation of hunched posture, labored breathing, poor grooming and wasting in a susceptible strain 1,4. We have successfully established several T-cell lines using this protocol and inbred strains ofAtm-/- [FVB/N-Atmtm1Led/J] 2 and p53-/- [129/S6-Trp53tm1Tyj/J] 5 mice. We further demonstrate that more than 90% of the established T-cell population expresses CD3, CD4 and CD8. Consistent with stably established cell lines, the T-cells generated by using the present protocol have been passaged for over a year.

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

In this video we demonstrate a protocol to establish mouse thymic lymphoma cell lines. By following this protocol, we have successfully established several T-cell lines from Atm-/- and p53-/- mice with thymic lymphoma.

גזירת הרתי T-cell לימפומה קווים מ כספומט - / -</sup ו P53 - / -</sup עכברים

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

בידודו של האדם וריד טבורי תאים אנדותל והשימוש בהם לחקר גלגול נשמות נויטרופילים בתנאי זרימה

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

בידוד של אדם מונוציטים ידי זוגי Gradient צנטריפוגה והבידול שלהם להמקרופאגים בתיקי תרבית תאים מצופים טפלון

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

שיטות לעכב קטריאלי Pyomelanin ייצור וקבעו את הגידול המקביל ברגישות לסטרס חמצונים

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

שיטות כדי לחקור את תפקיד הרגולציה של RNA הקטן וריבוזומלי תפוסה של<em&gt; Falciparum Plasmodium</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

הלגיונלה pneumophila החיצון ממברנה שלפוחית: בידוד ניתוח של פוטנציאל פרו-דלקתיים שלהם על המקרופאגים

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by pharmaceutical companies is a market opportunity, but it is also a strategy to increase drug accessibility and reduce therapy-associated costs. The protocols detailed here describe the evaluation of target binding and CDC induction by rituximab in Daudi cells. These two functions require different structural regions of the antibody and are relevant to the clinical effect induced by rituximab. The protocols allow the side-to-side comparison of a reference rituximab and a marketed rituximab biosimilar. The evaluated products showed differences both in target binding and CDC induction, suggesting that there are underlying physicochemical differences and highlighting the need to analyze the impact of those differences in the clinical setting. The methods reported here constitute simple and inexpensive in vitro models for the evaluation of the activity of rituximab biosimilars. Thus, they can be useful during biosimilar development, as well as for quality control in biosimilar production. Furthermore, the presented methods can be extrapolated to other therapeutic mAbs.

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

This protocol describes the in vitro comparison of two key functional characteristics of rituximab: target binding and complement-dependent cytotoxicity (CDC) induction. The methods were employed for a side-to-side comparison between reference rituximab and a rituximab biosimilar. These assays can be employed during biosimilar development or as a quality control in their production.

שיטות ויטרו להשוואת יעד מחייב CDC אינדוקציה בין נוגדנים טיפוליים: יישומים ניתוח Biosimilarity

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Overexpression וטיהור האדם<em&gt; Cis</em&gt; פרנליטרונפרפרז ב<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

הרומן מזין ללא מערכת לייצור המוני של תאים רוצח טבעי מאתר במבחנה

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

גזירת הרתי T-cell לימפומה קווים מ כספומט^{- / - ו P53^{- / - עכברים}}

בידודו של האדם וריד טבורי תאים אנדותל והשימוש בהם לחקר גלגול נשמות נויטרופילים בתנאי זרימה

כמותי

בידוד של אדם מונוציטים ידי זוגי Gradient צנטריפוגה והבידול שלהם להמקרופאגים בתיקי תרבית תאים מצופים טפלון

שיטות לעכב קטריאלי Pyomelanin ייצור וקבעו את הגידול המקביל ברגישות לסטרס חמצונים

שיטות כדי לחקור את תפקיד הרגולציה של RNA הקטן וריבוזומלי תפוסה של

הלגיונלה pneumophila החיצון ממברנה שלפוחית: בידוד ניתוח של פוטנציאל פרו-דלקתיים שלהם על המקרופאגים

שיטות ויטרו להשוואת יעד מחייב CDC אינדוקציה בין נוגדנים טיפוליים: יישומים ניתוח Biosimilarity

Overexpression וטיהור האדם

הרומן מזין ללא מערכת לייצור המוני של תאים רוצח טבעי מאתר במבחנה

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

גזירת הרתי T-cell לימפומה קווים מ כספומט - / - ו P53 - / - עכברים

בידודו של האדם וריד טבורי תאים אנדותל והשימוש בהם לחקר גלגול נשמות נויטרופילים בתנאי זרימה

כמותי

בידוד של אדם מונוציטים ידי זוגי Gradient צנטריפוגה והבידול שלהם להמקרופאגים בתיקי תרבית תאים מצופים טפלון

שיטות לעכב קטריאלי Pyomelanin ייצור וקבעו את הגידול המקביל ברגישות לסטרס חמצונים

שיטות כדי לחקור את תפקיד הרגולציה של RNA הקטן וריבוזומלי תפוסה של

הלגיונלה pneumophila החיצון ממברנה שלפוחית: בידוד ניתוח של פוטנציאל פרו-דלקתיים שלהם על המקרופאגים

שיטות ויטרו להשוואת יעד מחייב CDC אינדוקציה בין נוגדנים טיפוליים: יישומים ניתוח Biosimilarity

Overexpression וטיהור האדם

הרומן מזין ללא מערכת לייצור המוני של תאים רוצח טבעי מאתר במבחנה

גזירת הרתי T-cell לימפומה קווים מ כספומט^{- / - ו P53^{- / - עכברים}}