The authors thank Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) for support and discussion, Ms. Ann Kim for optimizing the B cell isolation protocol, Dr. Joseph Brzostowski for his help with microscopy, and Ms. Mirna Pe&#241;a for maintaining the animals used. This study was supported by the Intramural Research Programs of the National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, and National Heart, Lung, and Blood Institute.

<ol><li>Motz, G. T., Coukos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+and+reversing+tumor+immune+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Deciphering and reversing tumor immune suppression.</a> Immunity. 39 (1), 61-73 (2013).</li>
<li>Akkaya, M., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+pathogens+drive+the+evolution+of+paired+receptors%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">How do pathogens drive the evolution of paired receptors?</a> Eur J Immunol. 43 (2), 303-313 (2013).</li>
<li>Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell activation.</a> Annu Rev Immunol. 27, 591-619 (2009).</li>
<li>Dinarello, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory cytokines.</a> Chest. 118 (2), 503-508 (2000).</li>
<li>Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Memory B cells.</a> Nat Rev Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
<li>Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fueling+immunity%3A+insights+into+metabolism+and+lymphocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function.</a> Science. 342 (6155), 1242454(2013).</li>
<li>Gerriets, V. A., Rathmell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+pathways+in+T+cell+fate+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Metabolic pathways in T cell fate and function.</a> Trends Immunol. 33 (4), 168-173 (2012).</li>
<li>Doughty, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+receptor-mediated+changes+in+glucose+metabolism+in+B+lymphocytes%3A+role+of+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling+in+the+glycolytic+control+of+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Antigen receptor-mediated changes in glucose metabolism in B lymphocytes: role of phosphatidylinositol 3-kinase signaling in the glycolytic control of growth.</a> Blood. 107 (11), 4458-4465 (2006).</li>
<li>Caro-Maldonado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+is+required+for+antibody+production+that+is+suppressed+in+anergic+but+exaggerated+in+chronically+BAFF-exposed+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming is required for antibody production that is suppressed in anergic but exaggerated in chronically BAFF-exposed B cells.</a> J Immunol. 192 (8), 3626-3636 (2014).</li>
<li>Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+flux+analysis+to+monitor+glycolytic+rates+and+mitochondrial+oxygen+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption.</a> Methods Enzymol. 542, 125-149 (2014).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+and+Analysis+of+Extracellular+Acid+Production+to+Determine+Glycolytic+Rate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate.</a> J Vis Exp. (106), e53464(2015).</li>
<li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets%2C+lymphocytes%2C+monocytes%2C+and+neutrophils%2C+and+the+oxidative+burst+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Lab Invest. 93 (6), 690-700 (2013).</li>
<li>Klein, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+different+cell+isolation+techniques+on+lymphocyte+viability+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunoassay+Immunochem%22%5BJournal%5D)">Impact of different cell isolation techniques on lymphocyte viability and function.</a> J Immunoassay Immunochem. 27 (1), 61-76 (2006).</li>
<li>Hsueh, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Characterization+of+Mouse+Splenic+B+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22AfCS+Research+Reports%22%5BJournal%5D)">Purification and Characterization of Mouse Splenic B Lymphocytes.</a> AfCS Research Reports. 1 (1), 1-11 (2012).</li>
<li>Zambrano, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+ex+vivo+expansion+and+differentiation+of+naive+murine+CD43+B+splenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Prolonged ex vivo expansion and differentiation of naive murine CD43 B splenocytes.</a> Biotechnol Prog. , (2016).</li>
<li>Costa, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+rare+populations+of+murine+antigen-specific+T+lymphocytes+by+retroviral+transduction+for+potential+application+in+gene+therapy+for+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Targeting rare populations of murine antigen-specific T lymphocytes by retroviral transduction for potential application in gene therapy for autoimmune disease.</a> J Immunol. 164 (7), 3581-3590 (2000).</li>
<li>Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+characterization+and+isolation+of+rare+memory+B+cells+with+antigen+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers.</a> Blood. 118 (2), 348-357 (2011).</li>
<li>Schneider, D. F., Glenn, C. H., Faunce, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphocyte+subsets+and+their+immunoregulatory+roles+in+burn+injury+and+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Burn+Care+Res%22%5BJournal%5D)">Innate lymphocyte subsets and their immunoregulatory roles in burn injury and sepsis.</a> J Burn Care Res. 28 (3), 365-379 (2007).</li>
<li>Reeves, J. P., Reeves, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Removal of lymphoid organs.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 1, Unit 1 9(2001).</li>
<li>Akkaya, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple%2C+Versatile+Antibody-Based+Barcoding+Method+for+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A Simple, Versatile Antibody-Based Barcoding Method for Flow Cytometry.</a> J Immunol. 197 (5), 2027-2038 (2016).</li>
<li>Traba, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fasting+and+refeeding+differentially+regulate+NLRP3+inflammasome+activation+in+human+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects.</a> J. Clin. Invest. 125 (12), 4592-4600 (2015).</li>
<li>Wick, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+Primary+Metabolic+Block+Produced+by+2-Deoxyglucose%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Localization of the Primary Metabolic Block Produced by 2-Deoxyglucose.</a> J. Biol. Chem. 224 (2), 963-969 (1957).</li>
<li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of the ATP synthetase system.</a> Methods Enzymol. 55, 472-518 (1979).</li>
<li>Terada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncouplers+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Uncouplers of oxidative phosphorylation.</a> Environmental Health Perspectives. 87, 213-218 (1990).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+Maximum+Glycolytic+Capacity+Using+Extracellular+Flux+Measurements%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements.</a> PLOS ONE. 11 (3), e0152016(2016).</li>
<li>Lai, L., Alaverdi, N., Maltais, L., Morse, H. C. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cell+surface+antigens%3A+nomenclature+and+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse cell surface antigens: nomenclature and immunophenotyping.</a> J Immunol. 160 (8), 3861-3868 (1998).</li>
<li>Gerberick, G. F., Cruse, L. W., Miller, C. M., Sikorski, E. E., Ridder, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+modulation+of+T+cell+memory+markers+CD62L+and+CD44+on+murine+draining+lymph+node+cells+following+allergen+and+irritant+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Selective modulation of T cell memory markers CD62L and CD44 on murine draining lymph node cells following allergen and irritant treatment.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 146 (1), 1-10 (1997).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochim. Biophys. Acta - Bioenergetics. 1847 (2), 171-181 (2015).</li>
<li>Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+metabolism+drives+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">T cell metabolism drives immunity.</a> J Exp Med. 212 (9), 1345-1360 (2015).</li>
</ol>

The authors declare that they have no competing financial interests. Open Access fees for this article were provided by Agilent Technologies.

הפרוטוקול שפתחנו מותר בידוד יעיל של תת הלימפוציטים טהורים קיימא, אשר לאחר מכן שמשו בניתוח תאיים שטף בריכוזים שונים כדי להעריך את ההבדלים הגליקוליזה וביצועי נשימה המיטוכונדריאלי. פרוטוקול זה הוא תוכנן במיוחד עבור לימפוציטים ומספקים מענה שיקולים המיוחדים הקשורים סוגי תאים אלה, כגון פעילות חילוף חומרים בסיסית נמוכה, שבריריות, בתדירות נמוכה, וחוסר היכולת שלהם לדבוק צלחות assay. לכן, לעומת פרוטוקולים שפורסמו בעבר 11,12, השיטה שלנו מציע מדריך נוח יותר אופטימיזציה טובה יותר עבור חוקרים העובדים בתחום האימונולוגיה. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה, כולל פעולת כניסת אוכלוסיות תאים טהורות קיימא, ציפוי התאים בנקודת מפגש אופטימלי, סטנדרטיזציה של מדידות assay שטף תאי על ריכוז החלבון בכל טוב. האנימספר nitial התאים המצופים הן יכל להיות דמיינו ידי מיקרוסקופ אור וגם לכמת באמצעות מדידות ריכוז חלבון. המתאם הליניארי בין מספר תא ריכוז חלבון אשר כי ריכוז החלבון אכן יכול לשמש כדרך לתקנן את השפעת השינויים מספרים סלולריים בין בארות שונות. על ידי סטנדרטיזציה את תוצאות ECAR ו- OCR אל ריכוזי החלבון, הראינו כי, למרות מפגש תא תחתון, מספר המצומצם ככל 2.5 x 10 5 תאים / גם יכולים לשמש ברוב המבחנים מבלי להתפשר על איכות הנתונים. עם זאת, הגבול התחתון של תאים שיכולים לשמש נעים בין סוגי תאי מבחנים. לדוגמה, בעוד כמה כמו 1.25 x 10 5 תאים יכול לשמש למדידות B תא OCR, אפילו 2.5 x 10 5 תאים / גם לא היו מספיק כדי להעריך את הביצועים glycolytic מאותו סוג תא. לכן, כל עוד מספר הסלולרי אינו גורם מגביל, ציפוי ביותר מ90% מפגש, מתוכם כ מקביל 5 x 10 5 לימפוציטים / היטב, עדיף. אופטימיזציה נוספת ייתכן שתידרש כאשר תאים בגדלים-כגון שונים כמו מופעל בעבר-הם לימפוציטים בשימוש הבדיל באופן חלקי. בנוסף, בעת שימוש לימפוציטים עיקרי תרבותי בעבר, שאולי יש וריאצית כדאי תא בין תנאי טיפול שונים, אשר תקטין את האמינות של ריכוז חלבון כמדד את המספר הסלולרי מאז מת או תאים מתים יכולים גם לתרום רמות החלבון הנמדדות . במקרים כאלה, זה עשוי להיות מועיל כדי למיין תאי חיים על ידי זרימת cytometry לפני ביצוע מבחני שטף התאי. המבחנים שלנו באמצעות אוכלוסיות לימפוציטים מבודדות טרי מאוד קיימא, השגנו נתונים תפקודיים אמינים עבור שתי מדידות OCR ו ECAR. בעוד כל סוגי התאים התנהגו באופן דומה במבחן הלחץ המיטוכונדריה, הבדלים בולטים בין סוגי התאים היושנצפה מבחן הקיצון הגליקוליזה. למשל, את ביצועי glycolytic של תאי T הנאיביים היו נמוכים בהשוואה splenocytes או תאי B, וזה לא השתנה עם התוספת של oligomycin. תצפית זו עולה בקנה אחד עם מחקרים שפורסמו בעבר 7,30, המאשר את תוקפו של הפרוטוקול שלנו. לסיכום, השיטה שלנו מציעה דרך יעילה ונוחה של בדיקת הפעילות המטבולית של לימפוציטים באמצעות מנתח שטף תאי, וזה יכול להיות שימושי במגוון רחב של מחקרים אימונולוגית לחקור שינויי מטבוליים בתאי מערכת חיסוניים באקטיבציה, התמיינות תאים או בשל פנוטיפים המחלה כגון ממאירות זיהום, אוטואימוניות המטולוגיות.

התגובה החיסונית נגד אנטיגנים איזון הדוק מוסדר בין ההפעלה החיסונית דיכוי המערכת החיסונית. הפעלה חיסונית כונני התפשטות נדידת תאים מהירים, כמו גם ייצור ציטוקינים, הפרשת נוגדנים phagocytosis גדל ו בתגובה את החומר מהגוף, ואילו דיכוי מערכת חיסוני פשוט מעכב את האירועים הללו, ולכן הוא חשוב במניעת 1-6 תגובות חיסוניות מיותרות. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי קיים קשר ישיר בין מצב ההפעלה של תאי מערכת החיסון ופעילות מסלולים מטבוליים שונים 7. תאי חיסון יכולים לעבור בין המדינות ההמנוחות והופעל על ידי מעבר מסלולים להפקת אנרגיה לסירוגין. יתר על כן, היא נצפתה כי סוגי תאים חיסוניים שונים עשויים להשתמש באסטרטגיות מטבוליים שונות כדי לתדלק צרכי האנרגיה המוגברות שלהם במהלך הפעלה. לדוגמא, בעוד הפעלה של לימפוציטים מסוג T מפנה תאים למצב glycolytic כמעט לחלוטין 8 </sup&gt;, לימפוציטים מסוג B מופעל להשתמש איזון של זירחון הגליקוליזה חמצוני 9,10. מחקרים אלה מצביעים על החשיבות של שבדק את ההשפעה של הפעלת תא חיסון על חילוף חומרים תאיים. בזמן אמת, מדידות סימולטני של שיעור צריכת החמצן (OCR) וקצב החמצה תאיים (ECAR), כאינדיקטורים של זרחון חמצוני הגליקוליזה, היא אסטרטגיה נפוצה להתייחס מצבי מסלולים להפקת אנרגיה 11-13. על מנת להשיג זאת, נתח שטף תאי, כגון סוסון הים XF 96, משמש באופן שגרתי. מכשיר כזה יכול להשוות שינויים במהירות OCR ו ECAR פני סוגי תאים או בתנאי גירוי שונים. עד כה, סוגי תאים שונים, כולל תאי חיסון, נחקרו באמצעות התקנים אלה. עם זאת, פרוטוקול אופטימיזציה תוכנן במיוחד עבור תאי מערכת החיסון אינו זמין. תאי מערכת החיסון, במיוחד לימפוציטים, נבדלים otסוגי התאים אותה בכמה דרכים קריטיות. לימפוציטים הם תאי שברירי כי אינם שורדים למשך זמן ארוך בתנאים vivo לשעבר 14-16. זוהי סוגיה גדולה עוד יותר כאשר הם בתרבית תקשורת צמיחה לא טובה חסרת חומרים מזינים חיוניים, כגון אלו המשמשים בניתוח שטף תאי. בניגוד מקרופאגים שורות תאים רבים, לימפוציטים אינם דבקים משטחי פלסטיק; ולכן זה קריטי לצרף אותם לצלחת הניתוח מבלי ליצור מתח. לבסוף, כמה תת-אוכלוסיות לימפוציטים עשויים להיות נדירות מאוד וקציר אותם נדרש, הכמות האופטימלית עשויה להיות מאתגר 17-19. כאן, אנו מספקים פרוטוקול אופטימיזציה כי היא פותחה במיוחד עבור לימפוציטים. שימוש splenocytes, לימפוציטים מסוג B ו לימפוציטים מסוג CD4 + T נאיבי מבודד מן הטחול הלימפה העכבר צמתים 20, אנו מציגים את המאפיינים של זירחון הגליקוליזה חמצוני במצב מנוחה שלהם בידולצפיפות תא t. נתונים היו מנורמלים להסביר את הבדלי המספרים הסלולריים הראשוניים עבור כל טוב על ידי מדידת ריכוזי חלבון lysate תא assay סוף, שהיו ביחס ישר המספרים הסלולריים. הפרוטוקול שלנו לא רק מספק הנחיות הבידוד המהיר של לימפוציטים מעשי עבור מבחני שטף תאיים, אבל זה גם מאפשר לעבודה בריכוזי תא הכי מוצלחים מבלי להתפשר על איכות הנתונים.

<table><tbody><tr><td>PBS (pH 7.2)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>20012-050</td><td>To make MACS buffer</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td>To make MACS buffer</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8</td><td>Quality Biological</td><td>10128-446</td><td>To make MACS buffer</td></tr><tr><td>autoMACS rinsing solution</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>Instead of PBS + EDTA to make MS buffer. Also used in autoMACS Pro Separator.</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11875-093</td><td>Contains phenol red and L-glutamine</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>10437-028</td><td>For heat-inactivation, thaw frozen stock bottle in a 37 &amp;deg;C water bath and then inactivate at 56 &amp;deg;C for 30 min. Aliquot heat-inactivated serum for storage (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, in 50 ml conical tubes) and freeze at -20 &amp;deg;C until needed.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (Pen Strep)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>15140-122</td><td>Combine Pen Strep with L-Glut 1:1 (if making 500 ml media, make a total of 12 ml Pen Strep/L-Glut); keep aliquots at -20 &amp;deg;C until ready to make media.</td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM (L-Glut)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>25030-081</td><td>Component of RF10 and stress test media</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate 100 mM</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11360-070</td><td>Component of RF10 and stress test media</td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>15630-080</td><td>Component of RF10</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11140-050</td><td>Component of RF10</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>21985-023</td><td>Component of RF10</td></tr><tr><td>Falcon 70 &amp;mu;m cell strainer</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>87712</td><td>Used in cell isolation</td></tr><tr><td>Monoject 3 ml Syringe, Luer-Lock Tip</td><td>Covidien</td><td>8881513934</td><td>Used in cell isolation</td></tr><tr><td>Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes&amp;nbsp;</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>Used in cell isolation</td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes&amp;nbsp;</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Used in cell isolation</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>Used in cell isolation</td></tr><tr><td>CellTrics 30 &amp;mu;m cell filter, sterile, single-packed</td><td>Partec CellTrics</td><td>04-004-2326</td><td>Used in cell isolation</td></tr><tr><td>B Cell Isolation Kit, mouse</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-862</td><td>Used in cell isolation</td></tr><tr><td>Na&amp;iuml;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T cell isolation kit, mouse</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-453</td><td>Used in cell isolation</td></tr><tr><td>LS Column</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Used in cell isolation</td></tr><tr><td>MidiMACS separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td>Magnet for separation</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>Holder for magnets</td></tr><tr><td>autoMACS Rinsing Solution</td><td></td><td>130-091-222</td><td>Rinsing solution for autoMACS Pro Separator</td></tr><tr><td>autoMACS Pro Separator Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8375-5G</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>Cell adhesive. Take care to note concentration, as each lot is different (package is 1 mg).</td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D198501</td><td></td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Cocktail</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78429</td><td>Supplied as 100x cocktail, combine with RIPA to form 1x solution for lysis.</td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-115</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td>Follow manufacturer&#039;s instructions</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>101085-004</td><td>Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution.</td></tr><tr><td>Seahorse XF Base Medium</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102353-100</td><td>Used to prepare stress test media</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stericup Sterile Vacuum Filter Units, 0.22 &amp;mu;m</td><td>EMD Millipore-Fisher Scientific</td><td>SCGPU10RE</td><td>Used to sterile filter media.</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>487031</td><td>Dissolved to 0.1 M and used to dilute Cell-Tak.</td></tr></tbody></table>

an optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes

לימפוציטים להגיב למגוון של גירויים באמצעות הפעלת מסלולי איתות תאיים, אשר בתורו מוביל לשגשוג הסלולר המהירה, הגירה והבחנה, וייצור ציטוקינים. כל האירועים הללו הם קשורים באופן הדוק את מצב האנרגיה של התא, ולכן לומד את המסלולים מייצרי אנרגיה עשוי לתת רמזים לגבי הפונקציונליות הכללית של תאים אלה. מנתח השטף התאי הוא מכשיר נפוץ להערכת הביצועים של הגליקוליזה ונשימה המיטוכונדריה סוגי תאים רבים. מערכת זו נעשה שימוש כדי ללמוד תאים חיסוניים כמה דיווחים שפורסמו, עדיין פרוטוקול מקיף מותאם במיוחד עבור לימפוציטים חסר. לימפוציטים הם תאים שברירי ששורדים גרועים בתנאי vivo לשעבר. לעתים קרובות תת הלימפוציטים הם נדירים, ועבודה עם מספרים סלולריים נמוכים היא בלתי נמנעת. לפיכך, אסטרטגיית הניסוי הנותן מענה לקשיים אלה נדרש. כאן, אנו מספקים פרוטוקולהמאפשר בידוד מהיר של לימפוציטים קיימא מרקמות הלימפה, ועל הניתוח של המדינות המטבולית שלהם מנתח השטף התאי. יתר על כן, אנו מספקים תוצאות ניסויים שבהם הפעילויות המטבולית של תת הלימפוציטים כמה בצפיפויות תאים שונים הושוו. מקרים אלה מצביעים כי הפרוטוקול שלנו יכול לשמש כדי להשיג תוצאות עקביות היטב סטנדרטיות גם בריכוזי תא נמוכים, וכך יכולה להיות שהיא כוללת יישומים רחבים במחקרים עתידיים התמקדות באפיון אירועים מטבוליים בתאי מערכת חיסוניים.

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes at JoVE.com

פרוטוקול אופטימלי לניתוח גליקוליזה ונשימה מיטוכונדריאלית בלימפוציטים | אימונולוגיה וזיהום | וִידֵאוֹ

An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes

The study of metabolism is becoming increasingly relevant to immunological research. Here, we present an optimized method for measuring glycolysis and mitochondrial respiration in mouse splenocytes, and T and B lymphocytes.

פרוטוקול אופטימיזציה כדי לנתח הגליקוליזה מיטוכונדריאלי הנשימה לימפוציטים

Lymphocytes respond to a variety of stimuli by activating intracellular signaling pathways, which in turn leads to rapid cellular proliferation, migration ...

an-optimized-protocol-to-analyze-glycolysis-mitochondrial-respiration

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Biology

Immunology and Infection

Cellular Processes

Cellular Respiration

SCIENTISTS IN ACTION

29.6K Views.  National Institutes of Health. The study of metabolism is becoming increasingly relevant to immunological research. Here, we present an optimized method for measuring glycolysis and mitochondrial respiration in mouse splenocytes, and T and B lymphocytes.

Video: An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic pathways is tested in many types of tumors. Thus, characterization of cancer cell metabolic setup is inevitable in order to target the correct pathway to improve the overall outcome of patients. Unfortunately, in a majority of cancers, the malignant cells are quite difficult to obtain in higher numbers and the tissue biopsy is required. Leukemia is an exception, where a sufficient number of leukemic cells can be isolated from the bone marrow. Here, we provide a detailed protocol for the isolation of leukemic cells from leukemia patients bone marrow and subsequent analysis of their metabolic state using extracellular flux analyzer. Leukemic cells are isolated by the density gradient, which does not affect their viability. The next cultivation step helps them to regenerate, thus the metabolic state measured is the state of cells in optimal conditions. This protocol allows achieving consistent, well-standardized results, which could be used for the personalized therapy.

Here we present a protocol for the isolation of leukemic cells from leukemia patients bone marrow and analysis of their metabolic state. Assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells could help to better characterize the demand of primary cells and could lead up to more personalized medicine.

הערכה של פרופיל מטבולי של תאי סרטן ראשוני

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Cancer Research

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a differentiation state to sustain demands of the blood formation. However, it has been difficult to analyze the metabolic status (mitochondrial respiration and glycolysis) of HSPCs due to their limited numbers and lack of optimized protocols for non-adherent, fragile HSPCs. Here, we provide a set of clear, step-by-step instructions to measure metabolic respiration (oxygen consumption rate; OCR) and glycolysis (extracellular acidification rate; ECAR) of murine bone marrow-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. This protocol provides a higher amount of LSK HSPCs from murine bone marrow, improves the viability of HSPCs during incubation, facilitates extracellular flux analyses of non-adherent HSPCs, and provides optimized injection protocols (concentration and time) for drugs targeting oxidative phosphorylation and glycolytic pathways. This method enables the prediction of the metabolic status and the health of HSPCs during blood development and diseases.

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) transition from a quiescent state to a differentiation state due to their metabolic plasticity during blood formation. Here, we present an optimized method for measuring mitochondrial respiration and glycolysis of HSPCs.

ניתוח מטבוליזם התא של גזע המטפאות

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

Developmental Biology

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization. 
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC). 
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage&#8217;s metabolic phenotype and inflammatory status.

Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage&#8217;s metabolism and phenotype.

אפיון חילוף חומרים של מקוטב M1 והמקרופאגים נגזר מח עצם M2 באמצעות ניתוח תאי שטף בזמן אמת

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

<meta charset="utf8"></head><body>מדידת נשימה מיטוכונדריאלית של שמרים תוך שמירה על הקשר תאי

Mitochondrial Respiration Quantification in Yeast Whole Cells

Metabolism is mainly coordinated by cellular energy availability and environmental conditions. Assays for knowing how cells adapt energetic metabolism to different nutritional and environmental conditions give valuable information to elucidate molecular mechanisms. Oxidative phosphorylation is the primary source of ATP in most cells, and mitochondrial respiration activity is a key component of oxidative phosphorylation, maintaining mitochondrial membrane potential for ATP synthesis. Mitochondrial respiration is often studied in isolated mitochondria that are missing the cellular context. Here, we present a method for quantifying mitochondrial respiration in yeast-intact cells. This method applies to any yeast species, although it has been generally used for Saccharomyces cerevisiae cells. First, the yeast growth in specific conditions is tested. Then, cells are washed and resuspended in deionized water with a 1:1 ratio (w/v). Cells are then placed in an oximeter chamber with constant stirring, and a Clark electrode is used to quantify oxygen consumption. Some molecules are sequentially placed into the chamber and selected according to this effect on the electron transport chain or ATP synthesis. ATPase inhibitor oligomycin is first added to measure respiration coupled to ATP synthesis. Afterward, an uncoupler is used to measure the maximal respiratory capacity. Finally, a mix of electron transport chain inhibitors is added to discard oxygen consumption unrelated to mitochondrial respiration. Data are analyzed using a linear regression to obtain the slope, representing the oxygen consumption rate. The advantage of this method is that it is specific for yeast mitochondrial respiration, maintaining the cellular context. It is essential to highlight that inhibitors used in mitochondrial respiration quantification could vary between yeast species.

<meta charset="utf8"></head><body>כימות נשימה מיטוכונדריאלית בתאי שמרים שלמים

Mitochondrial respiration in yeast whole cells is a valuable indicator of cell bioenergetics. Here, we present a protocol to quantify this phenotype applicable to different yeast species.

כימות נשימה מיטוכונדריאלית בתאי שמרים שלמים

Metabolism is mainly coordinated by cellular energy availability and environmental conditions. Assays for knowing how cells adapt energetic metabolism to ...

Biochemistry

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

כימות מבוססי Cytometry זרימה ססגוניות של המיטוכונדריה, Lysosomes בתאי T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to promote survival, cellular proliferation, production of cytokines such as interferon gamma (IFN&#947;) and/or cytotoxicity programs. NK cell activation by cytokine stimulation requires a substantial remodeling of metabolic pathways to support their bioenergetic and biosynthetic requirements. There is a large body of evidence that suggests that impaired NK cell metabolism is associated with a number of chronic diseases including obesity and cancer, which highlights the clinical importance of the availability of a method to determine NK cell metabolism. Here we describe the use of an extracellular flux analyzer, a platform that allows real-time measurements of glycolysis and mitochondrial oxygen consumption, as a tool to monitor changes in the energy metabolism of human NK cells. The method described here also allows for the monitoring of metabolic changes after stimulation of NK cells with cytokines such as IL-15, a system that is currently being investigated in a wide range of clinical trials.

In this paper, we describe a method to measure glycolysis and mitochondrial respiration in primary human Natural Killer (NK) cells isolated from peripheral blood, at rest or following IL15-induced activation. The protocol described could be easily extended to primary human NK cells activated by other cytokines or soluble stimuli.

ניתוח של חילוף החומרים של תאי הרוצח הטבעי האנושי

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to ...

A Comprehensive High-Efficiency Protocol for Isolation, Culture, Polarization, and Glycolytic Characterization of Bone Marrow-Derived Macrophages

Macrophages are among the most important antigen-presenting cells. Many subsets of macrophages have been identified with unique metabolic signatures. Macrophages are commonly classified as M1-like (inflammatory) and M2-like (anti-inflammatory) subtypes. M1-like macrophages are pro-inflammatory macrophages that get activated by LPS and/or pro-inflammatory cytokines such as INF-&#947;, IL-12 &#38; IL-2. M1-like polarized macrophages are involved in various diseases by mediating the host&#39;s defense to a variety of bacteria and viruses. That is very important to study LPS induced M1-like macrophages and their metabolic states in inflammatory diseases. M2-like macrophages are considered anti-inflammatory macrophages, activated by anti-inflammatory cytokines and stimulators. Under the pro-inflammatory state, macrophages show increased glycolysis in glycolytic function. The glycolytic function has been actively investigated in the context of glycolysis, glycolytic capacity, glycolytic reserve, compensatory glycolysis, or non-glycolytic acidification using extracellular flux (XF) analyzers.
This paper demonstrates how to assess the glycolytic states in real-time with easy-to-follow steps when the bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are respiring, consuming, and producing energy. Using specific inhibitors and activators of glycolysis in this protocol, we show how to obtain a systemic and complete view of glycolytic metabolic processes in the cells and provide more accurate and realistic results. To be able to measure multiple glycolytic phenotypes, we provide an easy, sensitive, DNA-based normalization method for polarization assessment of BMDMs. Culturing, activation/polarization and identification of the phenotype and metabolic state of the BMDMs are crucial techniques that can help to investigate many different types of diseases.
In this paper, we polarized the na&#239;ve M0 macrophages to M1-like and M2-like macrophages with LPS and IL4, respectively, and measured a comprehensive set of glycolytic parameters in BMDMs in real-time and longitudinally over time, using extracellular flux analysis and glycolytic activators and inhibitors.

<meta charset="utf8"></head><body>פרוטוקול מקיף בעל יעילות גבוהה לבידוד, תרבית, קיטוב ואפיון גליקוליטי של מקרופאגים שמקורם במח העצם

This protocol provides detailed and comprehensive methods for the isolation, culture, polarization, and measurement of the glycolytic metabolic state of live bone marrow-derived macrophages (BMDMs). This paper provides step-by-step instructions with realistic visual illustrations for workflow and glycolytic assessment of BMDMs in real-time.

פרוטוקול מקיף בעל יעילות גבוהה לבידוד, תרבית, קיטוב ואפיון גליקוליטי של מקרופאגים שמקורם במח העצם

Macrophages are among the most important antigen-presenting cells. Many subsets of macrophages have been identified with unique metabolic signatures. ...

פרוטוקול אופטימיזציה כדי לנתח הגליקוליזה מיטוכונדריאלי הנשימה לימפוציטים

Summary

Explore More Videos

הערכה של פרופיל מטבולי של תאי סרטן ראשוני

ניתוח מטבוליזם התא של גזע המטפאות

אפיון חילוף חומרים של מקוטב M1 והמקרופאגים נגזר מח עצם M2 באמצעות ניתוח תאי שטף בזמן אמת

כימות נשימה מיטוכונדריאלית בתאי שמרים שלמים

כימות נשימה מיטוכונדריאלית בתאי שמרים שלמים

כימות נשימה מיטוכונדריאלית בתאי שמרים שלמים

כימות מבוססי Cytometry זרימה ססגוניות של המיטוכונדריה, Lysosomes בתאי T

ניתוח של חילוף החומרים של תאי הרוצח הטבעי האנושי

פרוטוקול מקיף בעל יעילות גבוהה לבידוד, תרבית, קיטוב ואפיון גליקוליטי של מקרופאגים שמקורם במח העצם

פרוטוקול מקיף בעל יעילות גבוהה לבידוד, תרבית, קיטוב ואפיון גליקוליטי של מקרופאגים שמקורם במח העצם