פיתוח טכניקות כדי לחקור את ההובלה של מקרומולקולס בין הגרעין לבין הציטופלסמה, וזיהוי mislocalization של חלבונים מדכאי הגידול הוא חיוני כדי להשיג הבנה עמוקה יותר של פתוגנזה CLL ולסייע בפיתוח של טיפולים חדשניים. פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה ויעילה ליצירת שברים גרעיניים וציטופלסמיים מתאים ראשוניים של CLL. שברים אלה יכולים לשמש בניסויים במורד הזרם כולל בדיקה של פעילות אנזימים, ניתוח פרוטומי, סופג מערבי.
טכניקה זו תרחיב את הבנתנו כיצד טיפולים ואותות מיקרו-סביבתיים בתוך גידולים משנים את סגירת החלבונים בין הגרעין לציטופלסמה בתאי CLL וייתכן שגם ממאירות תאי B אחרים. שיטה זו יכולה לשמש כדי לקבוע את המיקום של חלבונים ו / או למשוך תנועת חלבון לפי הצורך. בצע שיפוע דטרגנט על כל קו תא בודד שאתה מתכנן להשתמש בו כדי להבטיח את הדור האופטימלי של שברים גרעיניים וציטופלסמיים מועשרים מאוד.
לצד ג'ודי היי ומייקל מולס, הדגימה את ההליך הזה תהיה ג'ניפר קאסלס, טכנאית מהמעבדה שלי. השג דגימות דם היקפיות ממחלות לוקמיה לימפוציטית כרוניות שהוסכמו בעבר בצינורות איסוף הדם של EDTA, בליווי ספירת התאים הלבנים. דגימות דם אנושיות צריכות להיחשב כמסוכנות כפי שהם עשויים להכיל וירוסים המועברים בדם.
אנא ודא כי דגימות אלה מטופלים בקבינט בטיחות ביולוגית מחלקה 2 כי המשתמש לובש חלוק מעבדה וכפפות בכל עת. יש להשליך חומרים מזוהמים בדם בחומרי חיטוי. אם ספירת התאים הלבנים שווה או גדולה מ- 40 מיליון תאים למיליליטר, לדלל את המדגם ביחס של אחד לאחד עם מאגר שטיפת RT CLL.
ואז aliquot RT צפיפות הדרגתית בינוני לתוך צינור צנטריפוגה חרוט בגודל מתאים עבור המדגם. בזהירות שכבת המדגם על גבי המדיום צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 30 דקות ב RT. באמצעות פיפטה פלסטיק פסטר, בעדינות לקצור את השכבה הלבנה של תאים mononuclear שנאספו בממשק של מדיום שיפוע צפיפות במאגר לשטוף CLL. העבר את המונוליאר המבודד הזה לצינור צנטריפוגה חרוטי טרי של 50 מיליליטר.
כדי לשטוף את התאים, להוסיף 40 מיליליטר של מאגר לשטוף CLL זה monolayer וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השלך את העל-טבעי, תלחץ על תחתית הצינור כדי להשעות מחדש את גלולת הכדור, וחזור על שטיפה זו. להשליך את supernatant, להעיף את החלק התחתון של הצינור שוב, ולאחר מכן להשעות מחדש את גלולת התא בנפח מוגדר של מאגר לשטוף CLL בהתאם לגודל של גלולה.
לאחר ספירת התאים ולאחר ציטומטריית זרימה כדי לבדוק את טוהר התא, מניחים את התאים לתוך צלחות תרבות הרקמות בצפיפות התא הנדרשת מוכן לגירוי או טיפול תרופתי. לאחר גירוי ו/או טיפול תרופתי, הדגירה הושלמה. העבר את התאים לתוך מתויגים בנפרד 1.5 מיליליטר צינורות microfuge ו גלולה על ידי צנטריפוגה ב 200 x g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר השלכת supernatant, להשעות מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של PBS קר כקרח עם מעכבי פוספטאז. צנטריפוגה ב 200 x g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את supernatant ולשמור אלה כדורי תמצית תא שלם על הקרח להכנות נוספות.
כדי להכין שברים ציטופלסמיים, בעדינות להשעות את כדורי התא ב 50 microliters של חיץ היפרטוני 1x. כדי לאפשר לתאים להתנפח, דגירה אותם על קרח במשך 15 דקות. לאחר ביצוע שיפוע דטרגנט כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי של חומר ניקוי לשימוש עבור סוג תא מסוים, להוסיף 0.8 כדי 2.5 microliters של חומר ניקוי לתוך כל מדגם ומערבולת על ההגדרה הגבוהה ביותר במשך 10 שניות.
כדי לאמת את תות התא, התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה לפני ואחרי הוספת חומר ניקוי. לכל התאים יש גרעין צפוף וכהה המוקף בציטופלסמה המופיעה כהילה בהירה. לאחר lysed, צנטריפוגה הדגימות ב 14, 000 x g במשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס.
בזהירות, מבלי להפריע גלולה, להעביר את supernatant לתוך צינור microfuge מקורר מראש שכותרתו ולאחסן שבר ציטופלסמי זה ב 80 מעלות צלזיוס עד ניתוח נוסף. להבטיח הסרה מלאה של השבר הציטופלסמי כדי למנוע זיהום של השבר הגרעיני. לכדור הנותר, המכיל את השבר הגרעיני, להוסיף 50 microliters של חיץ תזה מלאה להשעות מחדש על ידי צינור למעלה ולמטה.
כדי לבודד חלבונים הקשורים קרום גרעיני, להוסיף 2.5 microliters של חומר ניקוי, מערבולת על ההגדרה הגבוהה ביותר במשך 10 שניות, דגירה על קרח במשך 30 דקות. וורטקס על ההגדרה הגבוהה ביותר במשך 30 שניות וצנטריפוגה. ואז להעביר את supernatant לתוך צינור microfuge מראש מקורר שכותרתו ולאחסן את החלק הגרעיני הזה ב 80 מעלות צלזיוס עד ניתוח נוסף.
עבור lysates תא שלם, להשעות מחדש את כדורי תמצית התא כולו ב 100 microliters של מאגר תזה מלאה על ידי צינור למעלה ולמטה. כדי להבטיח תות תא מלא, להוסיף חמישה microliters של חומר ניקוי דגירה על הקרח במשך 30 דקות. מערבולת על ההגדרה הגבוהה ביותר במשך 30 שניות ולאחר מכן צנטריפוגה ב 14, 000 x g במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
מעבירים את העל-טבעי לצינור מיקרו-פוגה מקורר מראש ומאחסנים את כל התא הזה ב-80 מעלות צלזיוס עד לניתוח נוסף. כדי לכמת סחר בחלבונים בין שברים גרעיניים וציטופלסמיים, בצע ניתוח כמותי של כתמים מערביים וייבא את התמונות. כדי להציג את התמונה ברצועת הכלים תמונה, לחץ על לחצן בחר בקבוצה תצוגה ולחץ על ערוץ Chemi.
תיבת הדו-שיח בחירת תצוגה תיפתח כדי לאפשר התאמות נוספות במידת הצורך. יש ליישם שיפורים נוספים באמצעות המחוונים הניתנים לכוונון בכרטיסיה של התמונה LUT, כולל בהירות או ניגודיות. השתמשו בכרטיסיה 'עקומות' להתאמות עדין יותר.
עבור ניתוח נתונים, לחץ תחילה על רצועת הכלים ניתוח. לניתוח ערוץ אחד בלבד, בטלו את הבחירה בערוצים שאינם מנותחים על-ידי לחיצה על התמונה הממוזערת 'אל תציג ערוץ' של הערוץ, והותירו רק את הערוץ הרצוי מוצג. לכימות עוצמת האות, לחצו על 'הוסף מלבן' להוספת מלבנים לתמונה.
לחץ על מרכז תכונה כגון רצועת חלבון כדי למקם מלבן סביבו. לאחר הוספת הצורות הרצויות, לחץ על בחר כדי להחזיר את הסמן לכלי הבחירה. כדי להחסיר רעשי רקע, לחצו על הלחצן הראשון בקבוצה 'רקע' ובחרו 'חציון' מהתפריט הנפתח.
הגדר את רוחב הגבול לשלושה בתיבת הדו-שיח רקע ובחר את המקטעים המייצגים בצורה הטובה ביותר את רקע התמונה שישמש לחישוב רקע. כדי לייצא את הנתונים, לחץ על הכרטיסיה צורות מעל הטבלה. עבור צפיפות, ערכים בעמודה אות נדרשים.
אות הוא הסכום של ערכי עוצמת הפיקסל או הסכום הכולל עבור צורה פחות תוצר הרקע באזור. לאחר מכן לחץ על לחצן דוח, לחץ על שמירה בשם או על הפעל גיליון אלקטרוני. כדי לחשב ביטוי מנורמל של חלבון העניין עבור כל מישור או משתנה בתוך הגיליון האלקטרוני שנשמר, חלק את האות המתקבל לחלבון המעניין על ידי האות עבור רצועת בקרת טעינת החלבון המתאימה.
כדי לייצא את התמונה, לחץ על הכרטיסיה תמונות שנמצאה מעל הטבלה ולאחר מכן לחץ על התמונה שיש לייצא. אם אתה משתמש בתמונה עבור מצגת שקופיות או תבניות דיגיטליות אחרות, לחץ על סמל התוכנה, רחף מעל ייצוא, לחץ על תמונה עבור מדיה דיגיטלית ולאחר מכן שמור את התמונה כנדרש. העשרה של תאי CLL עם WCC גדול מ-40 מיליון למיליליטר באמצעות צנטריפוגה בצפיפות מאפשרת התאוששות תאים גבוהה.
ניתוח של המדגם על ידי cytometry זרימה לאחר gating על FSC ו SSC לחשוף את הטוהר של תאי CLL הם יותר מ 95%כפי שצוין על ידי ביטוי פני השטח הכפול של סמני תא CLL, CD19 ו CD5. כאשר כתמי אימונו בוצעו על שברי התוצאה של תא CLL, Mac-1 ותאי CLL ראשוניים, השבר הצביע על כך שרמה הדטרגנט האופטימלית עבור תאי Mac-1 הייתה בדילול של 1 עד 60, לעומת אחד עד 30 עבור תאי CLL ראשיים. כאשר לוקליזציה תת-תאית של FOXO1 בשברים גרעיניים וציטופלסמיים נקבעה בתאי Mac-1 ו- CLL ראשוניים, הדור של שברים מועשרים מאוד הוצג על ידי הביטוי הכמעט בלעדי של למין בשברים הגרעיניים והבטא טובלין בשברים הציטופלסמיים.
ביטוי FOXO1 הופחת בציטופלסמה לאחר טיפול עם AZD 8055, לעומת NDC, מלווה בעלייה של ביטוי FOXO1 בתא הגרעיני, ובכך הפגינו טרנסלוקציה חלבון. לאחר כתמי אימונו בודדים מחמש דגימות CLL עיקריות כימתו בתוך שברים תת-תאיים, AZD 8055 נמצא כדי להפחית את רמות ביטוי FOXO1 בציטופלסמה ולהגדיל את הביטוי בגרעין. BCR הצלבה מוגברת ביטוי FOXO1 ציטופלסמי.
זכור לשמור את כל reagents ודגימות על קרח כדי למנוע השפלה חלבון. שברי תת-תאיים הנוצרים בהליך זה יכולים לשמש גם בבדיקות פעילות אנזימים כגון בדיקת פעילות FOXO, המאפשרת לצייר הקבלות בין המיקום התאי של FOXO1 לבין פעילות כריכת הדנ"א שלו. הפיתוח של טכניקה זו אפשר לנו לטפל בסחר בחלבונים ספציפיים בתוך תאי CLL בתגובה למעכבים סלקטיביים ותומך במחקרי immunofluorescence המקבילים שלנו כדי ליצור ערכת נתונים חזקה הניתנת לכימות.
