עבודה זו נתמכת על ידי NIH DK095137 (עד THC). אנו מודים לחברי המעבדה בהווה ובעבר אשר תרמו להתפתחות והתחכום של השיטות שתוארו.

משפט ואתיקה: אוניברסיטת מישיגן ועדת על השימוש והטיפול של בעלי חיים (UCUCA) ואישר את כל שיטות ופרוטוקולים בהתאם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (המכון מעבדה בבעלי חיים למחקר, המועצה הלאומית למחקר). עכברים נשמרות ביבר אוניברסיטת מישיגן מקבלים גישה חופשית למזון ומים ושמר על מחזור 12 שעות חושך / אור. 1. הכנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן תקשורת התרבות העיקרית עם DMEM, 10% FBS, 1x P / S / G ו- 1x אנטיביוטיקה / antifungals. זה ישמש כדי לשמור רקמות לעיכול לפני. מניח מניות aliquot באמבט מים 37 ºC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן חמישה מיליליטר של תמיסת collagenase Type III ב 5 מג / מיליליטר מומס HBSS (+ Ca, Mg +) עבור כל סוג של כרית שומן מבודדת, עד חמישה עכברים. לדוגמה, כאשר לבודד SQ ו VIS מ גנוטיפ יחיד, לעשות 10 מ&quot;ל, אם סוג-בר SQ מוטנטים VIS, לעשות 20 מ&quot;ל. התאם ל- pH 7.4 ו STEלהרגיז מסנן. Aliquot לתוך צינורות 50 מ&quot;ל. מניחים בצד הרחק מאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 70% אתנול לחיטוי בתחום כירורגית. נגב ולכסות עם כרית כחולה. לרסס קצת אתנול על כרית כחולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 22 מחטי G כדי להצמיד כרית ספיגה ללוח הקלקר לקצץ במספריים. תרסיס כרית עם אתנול ולאחר מכן להגדיר את הלוח על כרית כחולה ומכסים כרית כחולה אחרת עד תחילת לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו שני צינורות 50 מ&quot;ל עם אתנול ומניחים עמדה סמוך בתחום כירורגית. מניח את מספרי מלקחיים של אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו אחר צינור 50 מ&quot;ל עם PBS בתוספת 1x אנטי-אנטי לשטיפה אתנול מחוץ כלים כירורגיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב למכסה המנוע, מנות התווית 60 מ&quot;מ לכל סוג רקמה ולמלא עם התקשורת והתרבות חימם עד 37 ºC. מניח את הצלחות סמוכות לאזור כירורגית. </li></ol> בידוד 2. של תת עורי (SQ) רפידות שומן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר עם ממנת יתר של isoflurane ו pneumothorax. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינותלרסס עכבר עם 70% אתנול ושכב פרקדן. הצמד את הכפות אל קאפה עם 22 מחטים G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך קטן בעור של הבטן התחתונה. החזקת החלק העליון של החתך עם מלקחיים, לקחת את המספריים ולהפריד את העור מפני הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העור מופרד הצפק מן הבטן אל החזה, לשקף את העור הרחק הצפק לכיוון הראש על ידי ביצוע חתכים לרוחב בעור לאורך צדי הגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקף את העור שנותר מחזיק את השומן מפשעתי מהגוף להצמיד ללוח עם 22 מחטים G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Switch to מספרי מלקחיים בסדר. תפוס את כרית השומן מפשעתי עם מלקחיים בראשית הצירים ליד הצפק לגזוז בין עור ושומן מפשעתי התקדמות לקראת במפשעה הימנעות זיהום SQ עם העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את כרית השומן מפשעתי insolated בצלחת שכותרתו 60 מ&quot;מ. </li></ol> 3. בידוד של הקרביים (VIS) רפידות שומן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן דומה לשלב 2.5, לחתוך הצפק פתוח לחשוף את רפידות ובמעיים שומן הקרביים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הבטן משם לכיוון בית החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את כרית השומן VIS בקצה הדיסטלי ולמשוך בעדינות. לנתח את כרית שומן VIS תוך הקפדה שלא לכלול epididymal (או רחם, אם באמצעות נקבת עכברים) רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום בצלחת שכותרתו וחזור על שלב 3.3 עבור כרית VIS הנותרים. </li></ol> 4. עיכול Collagenase של רפידות שומן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז 60 מ&quot;מ צלחות למכסה המנוע בתרבית רקמה ו לשאוב את התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכך את רפידות שומן עם מספריים מעוקל מכן להוסיף לפתרון collagenase. הקפידו לשטוף את המספריים מלקחיים בין סוגי רקמות עם אתנול PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Shake ב 300 סל&quot;ד ו -37 ºC עבור 10-20 דקות עד רקמות מתעכלות. מקובל אם כמה חתיכות של SQ עדיין גלויות. זה יטופל בשלב מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 מ&quot;ל של התקשורת בתרבות לפתרון collagenase לעצור את collagטיפול enase, ו פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים עם טפטף סרולוגיות 10 מיליליטר לפזר את הרקמות המעוכלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זנים באמצעות מסננת תא 100 מיקרומטר. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב g 300 x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות למזוג את התקשורת לא להפריע גלולה ולהוסיף 5 מ&quot;ל של מים סטריליים כדי גלולה ו פיפטה בעדינות להשעות תאים. חכה 2 דקות כדי lyse אריתרוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 מ&quot;ל של התקשורת עם תאים FBS ומתח 10% דרך מסננת תא חדש 100 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 10 דקות ב g 300 x. התקשורת למזוג ו resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל של התקשורת והתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים עם hemocytometer באמצעות 1: 1 trypan כחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 1 x 10 6 תאים היטב אחד על צלחת 6 באר. </li></ol> 5. הפרדת Cell מגנטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כ -4 עד 6 שעות של הידבקות התא, לשטוף תאים פעמיים עם HBSS (-Ca, -Mg). לנתק תאים חסידים באמצעות טריפסין 0.05%. לדלל השעית תא טריפסין חיץ הפרדה 1 מיליליטר ספין עבור5 דקות ב g 300 x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant. תאי Resuspend במאגר 500 μl. הסרת aliquot 10 μl ולספור תאים באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין תאים למשך 5 דקות ב 300 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant לחלוטין. תאי Resuspend ב 90 חיץ μl. הוסף 10 μl נוגדן ראשוני נגד Sca1-FITC. מערבבים היטב דגירה במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם 1 מ&quot;ל חיץ תאים צנטריפוגות במשך 5 דקות ב g 300 x. הסר supernatant לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Resuspend ב 80 חיץ μl. הוסף 20 μl microbeads אנטי FITC. מערבבים היטב דגירה במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם 1 מ&quot;ל חיץ תאים צנטריפוגות במשך 5 דקות ב g 300 x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant ו resuspend גלולה במאגר 500 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום עמודה בעל מגנטית ולשטוף טור עם 500 חיץ μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף השעית תא לעמודה. הימנע בועות תוך pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את Sca1 ללא תווית - &lt;/ Sup&gt; תאים ולשטוף פעמים בטור 3 עם 500 חיץ μl. רק להוסיף למאגר חדש כאשר המאגר ריק. הימנע בועות תוך pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר עמודה מבעל מגנטי ומקום לתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל חיץ לעמודה ו elute Sca1 + על ידי דחיפת הבוכנה המסופק באמצעות המאגר טור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה שברי תא במשך 5 דקות ב 300 x ז. תאים Resuspend בתקשורת תרבות 1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת aliquot 10 μl מן השברים שכותרתו ללא תווית ולספור תאים באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט כל שבריר תא 1 גם צלחת 6 באר. </li></ol> 6. אימות של הפרדת immunomagnetic של ACSs Sca1 הגבוה עם cytometry הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את התאים פעמיים עם HBSS (-Ca, -Mg) ו לנתק תאים באמצעות טריפסין 0.05%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות. תאים Resuspend בתקשורת תרבות 1 מ&quot;ל ולספור באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג&gt; 10 6 </sup&gt; תאים 1 מ&quot;ל התקשורת בתרבות צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צעד supernatant וחזור 6.3 פעמיים נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend עם 1 מ&quot;ל של סרום עיזים 2% + 2% BSA ולחסום במשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חסימת פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף עכברוש IgG2a אלקסה פלואוריד 647 (0.25 מיקרוגרם, 1: 400) או אנטי-Sca1 אלקסה פלואוריד 647 (0.25 מיקרוגרם, 1: 400), ב 100 μl של PBS עם 2% נסיוב עז ו -2% BSA + PBS ב 4 ° C במשך 30 דקות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של קר PBS לתאים. צנטריפוגה XG 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צעד supernatant וחזור 6.9 פעמיים נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 1 מ&quot;ל PBS. Pass השעיות התא דרך מסננת התא 100 מיקרומטר כהכנה ניתוח תזרים cytometric. </li></ol>

<ol>
	<li>Chun, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pericellular+collagenase+directs+the+3-dimensional+development+of+white+adipose+tissue.">A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue.</a> Cell. 125 (3), 577-591 (2006).</li><li>Chun, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+link+between+obesity+and+MMP14-dependent+adipogenic+collagen+turnover.">Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover.</a> Diabetes. 59 (10), 2484-2494 (2010).</li><li>Chun, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peri-adipocyte+ECM+remodeling+in+obesity+and+adipose+tissue+fibrosis.">Peri-adipocyte ECM remodeling in obesity and adipose tissue fibrosis.</a> Adipocyte. 1 (2), 89-95 (2012).</li><li>Sun, K., Tordjman, J., Clement, K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrosis+and+adipose+tissue+dysfunction.">Fibrosis and adipose tissue dysfunction.</a> Cell Metab. 18 (4), 470-477 (2013).</li><li>Spangrude, G., Heimfeld, S., Weissman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+Mouse+Hematopoietic+Stem+Cells.">Purification and Characterization of Mouse Hematopoietic Stem Cells.</a> Science. 241, 58-62 (1988).</li><li>Welm, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sca-1(pos)+cells+in+the+mouse+mammary+gland+represent+an+enriched+progenitor+cell+population.">Sca-1(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population.</a> Dev Biol. 245 (1), 42-56 (2002).</li><li>Gesta, S., Tseng, Y. H., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origin+of+fat:+tracking+obesity+to+its+source.">Developmental origin of fat: tracking obesity to its source.</a> Cell. 131 (2), 242-256 (2007).</li><li>Tang, W., Zeve, D., Suh, J. M., Bosnakovski, D., Kyba, M., Hammer, R. E., Tallquist, M. D., Graff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White+fat+progenitor+cells+reside+in+the+adipose+vasculature.">White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature.</a> Science. 322, 583-586 (2008).</li><li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li><li>Tokunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+depot-specific+gene+signature+and+ECM+remodeling+of+Sca1(high)+adipose-derived+stem+cells.">Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells.</a> Matrix Biol. 36, 28-38 (2014).</li><li>Chun, T. H., Inoue, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+adipocyte+differentiation+and+peri-adipocyte+collagen+turnover.">3-D adipocyte differentiation and peri-adipocyte collagen turnover.</a> Methods Enzymol. 538, 15-34 (2014).</li><li>Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+ready-to-use,+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications.">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).</li><li>Ma, X., Robin, C., Ottersbach, K., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ly-6A+(Sca-1)+GFP+Transgene+is+Expressed+in+all+Adult+Mouse+Hematopoietic+Stem+Cells.">The Ly-6A (Sca-1) GFP Transgene is Expressed in all Adult Mouse Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells. 20 (6), 514-521 (2002).</li><li>Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+adipocyte+cellular+lineage+in+vivo.">Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo.</a> Nat Cell Biol. 15 (3), 302-308 (2013).</li><li>Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+depot-specific+activation+of+adipocyte+precursor+cells+at+the+onset+of+obesity.">Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity.</a> Nat Cell Biol. 17 (4), 376-385 (2015).</li><li>Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristic+Expression+of+Extracellular+Matrix+in+Subcutaneous+Adipose+Tissue+Development+and+Adipogenesis;+Comparison+with+Visceral+Adipose+Tissue.">Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue.</a> Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).</li><li>Ong, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Specific+Cell-Surface+Markers+of+Adipose-Derived+Stem+Cells+from+Subcutaneous+and+Visceral+Fat+Depots.">Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

בזאת אנו מדגימים את הבידוד והפרדה תא immunomagnetic של ASCs בעכברים מ רפידות שומן שונים והשימוש בהם לניסויים במבחנה. השיטה המוצגת היא יעילה עבור הבידוד המהיר של מספר רב של ASCs Sca1 החיובי, המהווה יתרון על FACS בתיווך מורכב ויקר טכניים הבידוד של ASCs 9,14. בניגוד FACS, הפרדת תא im...

תאי גזע אנטיגן 1 (Sca1, או Ly6A / E) זוהה לראשונה כסמן פני התא הביע על ידי תאים hematopoietic ו גזע mesenchymal 5,6. השבר וסקולרית סטרומה (SVF) של רקמת שומן המתקבלת מאגרי שומן עכבר הוא אוכלוסייה הטרוגנית של תאים הכוללים פיברובלסטים, מקרופאגים, תאי אנדותל של כלי דם, תאים עצביים, ועל ובתאים adipocyte 7. ובתאי adipocyte, או תאי גזע שמקורם שומן (ASCs) הם תאים שאינם שומנים-לאדן כי מתגוררים מטריקס perivascular עשיר קולגן (ECM) 8. כ -50% של SVF מורכב ASCs, המאופיינים שלילי השושלת (לין -) ו CD29 +: CD34 +: Sca1 + 9. רוב של תאים אלה הם Sca1 +: CD24 - אבות adipocyte, המסוגלים בידול adipocyte במבחנה; עם זאת, רק חלק קטן של תאים (0.08% של SVF) מהווה Sca1 <sעד&gt; +: CD24 + תאים המסוגלים מלא של מתרבים ומבדל לתוך adipocytes בתנאים vivo ב 9. למרות הסייגים הפוטנציאל של שימוש Sca1 + SVF ללא אפלית CD24 + תאי CD24 - תאים, לבודד Sca1 + ASCs מן מחסני שומן באמצעות פרדת תא immunomagnetic היא גישה יעילה ומעשית כדי לקבוע את הפנוטיפ-אוטונומי תא של ובתאים adipocyte העיקרי. בתחום השמנת יתר וסוכרת, סיסטיק לרקמות ודלקת לשחק תפקיד קריטי בפיתוח ותחזוקה של סוכרת מסוג 2 3. לאחרונה, Tokunaga et al. הראה כי תאי גבוה Sca1 המבודד מפשעתי (או תת עורית, SQ) ו perigonadal (או קרבי, VIS) מאגרי שומן C57BL6 / J להפגין חתימות גנטיות שונות שיפוץ ECM במבחנה 10. MMP14 (MT1-MMP), חבר אבטיפוס של-t הממברנהמטלו מטריקס ype (MMP) המשפחה מתווכת בפיתוח שומן לבן (WAT) דרך פעילותה collagenolytic 1. דוגמאות של ניסויים שעלולים להתנהל עם התאים מבודדים והעשירו באמצעות הפרוטוקול הבא כוללות תרבות תלת ממדים, מחקרי בידול, מבחני שפלת קולגן, ו- RNA רצף 10,11. מבחני שפלה צריכים להתנהל עם קולגן חומצת חילוץ כדי להבטיח את השימור של telopeptide 11,12. הפרוטוקול הבא יהיה להדגים את השיטות לבודדות תאי סטרומה וסקולרית ראשית ממנהל מאגרי שומן שונים ולהעשיר ובתאי adipocyte באמצעות פרדת תא immunomagnetic. תוקפו של מיון התא יוערכו עם זרימת cytometry ובאמצעות באמצעות עכברים Sca1-GFP המבטאים GFP ב Sca1 + תאים, מונע על ידי האמרגן Sca1 13.

<table><tbody><tr><td>Type 3 Collagenase</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004182</td><td>Tissue digestion</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>High-glucose culture medium</td></tr><tr><td>Pen/Strep/Glutamine (100x)</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>Media antibiotic</td></tr><tr><td>Anti-anti (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>Media antifungal</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x, pH 7.4)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin (0.05%)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>BD Bioscience</td><td>352360</td><td>100-&amp;mu;m cell strainer</td></tr><tr><td>60 mm plates</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td>Large</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>FST</td><td>14091-11</td><td>Fine, curved tip</td></tr><tr><td>Large Forceps</td><td>FST</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Any vendor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25G 5/8&amp;rdquo; needles</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>22G 1.5&amp;rdquo; needles</td><td>BD</td><td>305159</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>MACS separation columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sca1 microbead kit (FITC)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-529</td><td>FITC-anti-Sca1 1&amp;ordm;Ab and anti-FITC microbeads 2&amp;ordm;Ab</td></tr><tr><td>AutoMACS running buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Blue chux pads</td><td>Fisher</td><td>276-12424</td><td></td></tr><tr><td>Absorbent pads</td><td>Fisher</td><td>19-165-621</td><td></td></tr><tr><td>Styrofoam board</td><td></td><td></td><td>Use from 50 ml tubes</td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Any vendor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2a Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>R2a21</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>MSCA21</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2a R-PE</td><td>Invitrogen</td><td>R2a04</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE</td><td>Invitrogen</td><td>MF48004</td><td></td></tr><tr><td>Round-bottom tube</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (&amp;ndash;Ca, &amp;ndash;Mg)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (+Ca, +Mg)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>For collagenase solution</td></tr><tr><td>Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid</td><td>Prepare in house&lt;sup&gt;12&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Gibco</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>0.34 N NaOH</td><td>Prepare in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cover slips</td><td>Corning</td><td>2870-22</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>0.89 M NaHCO&lt;sub&gt;3&amp;nbsp;&lt;/sub&gt;</td><td>Gibco</td><td>25080-094</td><td></td></tr></tbody></table>

immunomagnetic separation of fat depot-specific sca1high adipose-derived stem cells (ascs)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1high ASCs.

העשרה של ASCs הגבוהה Sca1 מ רפידות שומן שונות. תאי סטרומה וסקולרית המבודדים תצוגת שומן SQ פיברובלסטים דמויים, נמתחו צורת תא ללא קשר לרמת ביטוי Sca1 (איור 1 א). מצד השני, VIS (eWAT נגזרת) תאי ...

Watch this Scientific Journal Video about Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs at JoVE.com

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.

הפרדת immunomagnetic של שומן דיפו ספציפי Sca1<sup&gt; גבוה</sup&gt; בתאי גזע שמקורם שומן (ASCs)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

immunomagnetic-separation-fat-depot-specific-sca1high-adipose-derived

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

6.8K Views.  Biointerfaces Institute, University of Michigan. We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.

Video: Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

בידוד וההעשרה של אדם שומן המופק מתאי סטרומה לOsteogenesis משופר

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of cardiovascular disease. ADSCs derived from different adipose tissues show distinct features, and those from the PVAT have not been well characterized. In a recent study, we reported that some ADSCs in the periaortic arch adipose tissue (PAAT) descend from the neural crest cells (NCCs), a transient population of migratory cells originating from the ectoderm.
In this paper, we describe a protocol for isolating red fluorescent protein (RFP)-labeled NCCs from the PAAT of Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+ mice and inducing their adipogenic differentiation in vitro. Briefly, the stromal vascular fraction (SVF) is enzymatically dissociated from the PAAT, and the RFP+ neural crest derived ADSCs (NCADSCs) are isolated by fluorescence activated cell sorting (FACS). The NCADSCs differentiate into both brown and white adipocytes, can be cryopreserved, and retain their adipogenic potential for ~3&#8211;5 passages. Our protocol can generate abundant ADSCs from the PVAT for modeling PVAT adipogenesis or lipogenesis in vitro. Thus, these NCADSCs can provide a valuable system for studying the molecular switches involved in PVAT differentiation.

We present a protocol for the isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest derived adipose-derived stem cells (NCADSCs) from the periaortic adipose tissue of Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+ mice. The NCADSCs can be an easily accessible source of ADSCs for modeling adipogenesis or lipogenesis in vitro.

בידוד, תרבות, והשראה של הרכס העצבי המקורי אדיפוז-תאי גזע שמקורם ברקמת אדיפוז

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute functionally to the expansion and remodeling of WAT in adulthood. A tremendous barrier to studying the implications of this cellular heterogeneity is the inability to readily isolate functionally distinct cell subpopulations from WAT SVF for in vitro and in vivo analyses. Single-cell sequencing technology has recently identified functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic PDGFR&#946;+ perivascular cell subpopulations in intra-abdominal WAT depots of adult mice. Fibro-inflammatory progenitors (termed, &#8220;FIPs&#8221;) are non-adipogenic collagen producing cells that can exert a pro-inflammatory phenotype. PDGFR&#946;+ adipocyte precursor cells (APCs) are highly adipogenic both in vitro and in vivo upon cell transplantation. Here, we describe multiple methods for the isolation of these stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal WAT depots. FIPs and APCs can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) or by taking advantage of biotinylated antibody-based immunomagnetic bead technology. Isolated cells can be used for molecular and functional analysis. Studying the functional properties of stromal cell subpopulation in isolation will expand our current knowledge of adipose tissue remodeling under physiological or pathological conditions on the cellular level.

This protocol describes the technical approach to isolate adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal white adipose tissue (WAT) depots by fluorescence-activated cell sorting or immunomagnetic bead separation.

בידוד תת-אוכלוסיות תאי סטרומה אדיפוגניים ופיברו-דלקתיים ממחסני שומן תוך-בטניים של מורין

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute ...

Immunology and Infection

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult stem cells from liposuctioned adipose tissue that they initially termed Processed Lipoaspirate Cells or PLA cells. Since then, these stem cells have been renamed as Adipose-derived Stem Cells or ASCs and have gone on to become one of the most popular adult stem cells populations in the fields of stem cell research and regenerative medicine. Thousands of articles now describe the use of ASCs in a variety of regenerative animal models, including bone regeneration, peripheral nerve repair and cardiovascular engineering. Recent articles have begun to describe the myriad of uses for ASCs in the clinic. The protocol shown in this article outlines the basic procedure for manually and enzymatically isolating ASCs from large amounts of lipoaspirates obtained from cosmetic procedures. This protocol can easily be scaled up or down to accommodate the volume of lipoaspirate and can be adapted to isolate ASCs from fat tissue obtained through abdominoplasties and other similar procedures.

In 2001, researchers at UCLA described the isolation of a population of adult stem cells, termed Adipose-derived Stem Cells or ASCs, from adipose tissue. This article outlines the isolation of ASCs from lipoaspirates using a manual, enzymatic digestion protocol using collagenase.

בידוד ידני של תאי גזע שמקורם בשומן מLipoaspirates האדם

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Biology

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. As a clinically relevant cell type, optimal methods are needed to isolate and expand these cells in vitro. Most methods to isolate adipose-derived MSCs (ADSCs) rely on harsh enzymes, such as collagenase, to digest the adipose tissue. However, while effective at breaking down the adipose tissue and yielding a high ADSC recovery, these enzymes are expensive and can have detrimental effect on the ADSCs &#8212; including the risks of using xenogeneic components in clinical applications. This protocol details a method to isolate ADSCs from fresh lipoaspirate and abdominoplasty samples without enzymes. Briefly, this method relies on mechanical disassociation of any bulk tissue followed by an explant-type culture system. The ADSCs are permitted to migrate out of tissue and onto the tissue culture plate, after which the ADSCs can be cultured and expanded in vitro for any number of research and/or clinical applications.

This protocol provides an enzyme-free method for isolating mesenchymal stem cells from abdominoplasty and lipoaspirate samples using an explant method. The absence of harsh enzymes or centrifugation steps provides for clinically relevant stem cells that can be used for studies in vitro or transferred back to the clinic.

שיטה נטולת אנזימים לבידוד והתרחבות של אדיפוז האנושית-תאי גזע נגזרים

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Medicine

Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible source for regenerative clinical applications. Different protocols have been used to obtain adipose-derived stem cells. This article describes different steps of an improved time-saving protocol to obtain a more significant amount of ADSC, showing how to cryopreserve and thaw ADSC to obtain viable cells for culture expansion. One hundred milliliters of lipoaspirate were collected, using a 26 cm three-hole and 3 mm caliber syringe liposuction, from the abdominal area of nine patients who subsequently underwent elective abdominoplasty. The stem cells isolation was carried out with a series of washes with Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) solution supplemented with calcium and the use of collagenase. Stromal Vascular Fraction (SVF) cells were cryopreserved, and their viability was checked by immunophenotyping. The SVF cellular yield was 15.7 x 105 cells/mL, ranging between 6.1-26.2 cells/mL. Adherent SVF cells reached confluence after an average of 7.5 (&#177;4.5) days, with an average cellular yield of 12.3 (&#177; 5.7) x 105 cells/mL. The viability of thawed SVF after 8 months, 1 year, and 2 years ranged between 23.06%-72.34% with an average of 47.7% (&#177;24.64) with the lowest viability correlating with cases of two-year freezing. The use of DPBS solution supplemented with calcium and bag resting times for fat precipitation with a shorter time of collagenase digestion resulted in an increased stem cell final cellular yield. The detailed procedure for obtaining high yields of viable stem cells was more efficient regarding time and cellular yield than the techniques from previous studies. Even after a long period of cryopreservation, viable ADSC cells were found in the SVF.

The present protocol describes an improved methodology for ADSC isolation resulting in a tremendous cellular yield with time gain compared to the literature. This study also provides a straightforward method for obtaining a relatively large number of viable cells after long-term cryopreservation.

טכניקה לקבלת תאי גזע מזנכימליים מרקמת שומן ואפיון שבר כלי דם סטרומלי בשימור בהקפאה ארוכת טווח

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident adipose progenitor cells (APCs) play a key role in adipose tissue homeostasis and can contribute to the tissue pathology. The growing use of single cell analysis technologies &#8211; including single-cell RNA-sequencing and single-cell proteomics &#8211; is transforming the stem/progenitor cell field by permitting unprecedented resolution of individual cell expression changes within the context of population- or tissue-wide changes. In this article, we provide detailed protocols to dissect mouse epididymal adipose tissue, isolate single adipose tissue-derived cells, and perform fluorescence activated cell sorting (FACS) to enrich for viable Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APCs. These protocols will allow investigators to prepare high quality APCs suitable for downstream analyses such as single cell RNA sequencing.

We present a simple method to isolate highly viable adipose progenitor cells from mouse epididymal fat pads using fluorescence activated cell sorting.

הכנת תאי אדיפוס אבות מרקמות שומן אפידימליות עכבר

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

בידוד ואפיון תאי גזע שמקורם ברקמת שומן

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in addition to their great capacity for self-renewal, migration, and proliferation. Adipose tissue is one of the least invasive and most accessible sources of mesenchymal cells. It has also been reported to have higher yields compared to other sources, as well as superior immunomodulatory properties. Recently, different procedures for obtaining adult mesenchymal cells from different tissue sources and animal species have been published. After evaluating the criteria of some authors, we standardized a methodology that is applicable to different purposes and easily reproducible. A pool of stromal vascular fraction (SVF) from perirenal and epididymal adipose tissue allowed us to develop primary cultures with optimal morphology and functionality. The cells were observed adhered to the plastic surface for 24 h, and exhibited a fibroblast-like morphology, with prolongations and a tendency to form colonies. Flow cytometry (FC) and immunofluorescence (IF) techniques were used to assess the expression of the membrane markers CD105, CD9, CD63, CD31, and CD34. The ability of adipose-derived stem cells (ASCs) to differentiate into the adipogenic lineage was also assessed using a cocktail of factors (4 &#181;M insulin, 0.5 mM 3-methyl-iso-butyl-xanthine, and 1 &#181;M dexamethasone). After 48 h, a gradual loss of fibroblastoid morphology was observed, and at 12 days, the presence of lipid droplets positive to oil red staining was confirmed. In summary, a procedure is proposed to obtain optimal and functional ASC cultures for application in regenerative medicine.

מחבר זרקור: בידוד וזיהוי של תאי גזע מזנכימליים שמקורם ברקמת שומן של חולדות Sprague Dawley  

This protocol describes a methodology for isolating and identifying adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (MSCs) from Sprague Dawley rats.

בידוד וזיהוי תאי גזע מזנכימליים שמקורם ברקמת שומן של חולדות Sprague Dawley

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

הפרדת immunomagnetic של שומן דיפו ספציפי Sca1

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בידוד וההעשרה של אדם שומן המופק מתאי סטרומה לOsteogenesis משופר

בידוד, תרבות, והשראה של הרכס העצבי המקורי אדיפוז-תאי גזע שמקורם ברקמת אדיפוז

בידוד תת-אוכלוסיות תאי סטרומה אדיפוגניים ופיברו-דלקתיים ממחסני שומן תוך-בטניים של מורין

בידוד ידני של תאי גזע שמקורם בשומן מLipoaspirates האדם

שיטה נטולת אנזימים לבידוד והתרחבות של אדיפוז האנושית-תאי גזע נגזרים

טכניקה לקבלת תאי גזע מזנכימליים מרקמת שומן ואפיון שבר כלי דם סטרומלי בשימור בהקפאה ארוכת טווח

הכנת תאי אדיפוס אבות מרקמות שומן אפידימליות עכבר

בידוד וזיהוי תאי גזע מזנכימליים שמקורם ברקמת שומן של חולדות Sprague Dawley

בידוד וזיהוי תאי גזע מזנכימליים שמקורם ברקמת שומן של חולדות Sprague Dawley

בידוד וזיהוי תאי גזע מזנכימליים שמקורם ברקמת שומן של חולדות Sprague Dawley