이 작품은 (THC에) NIH DK095137에 의해 지원됩니다. 우리는 기술 된 방법의 개발 및 고도화에 기여 현재 전 실험실 구성원 감사합니다.

윤리 정책 : 동물의 사용 및 관리에 미시간위원회의 대학 (UCUCA)은 (실험 동물 연구를위한 연구소, 국립 연구위원회)가 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서에 따라 모든 방법과 프로토콜을 승인했다. 마우스는 미시간 대학의 동식물 사육장 유지하고, 음식과 물을 무료로 액세스 권한을 부여하고, 12 시간 어두운 / 라이트 사이클에 보관됩니다. 1. 준비 <ol><li> DMEM, 10 % FBS, 1 배 P / S / G 및 1X 항생제 / 항진균제와 차 문화 미디어를 준비합니다. 이것은 이전 소화 조직을 유지하는 데 사용된다. 37 ºC 물을 욕조에 주식과 나누어 놓습니다. </li><li> 5 ㎎ / ㎖ (+ 칼슘 + 마그네슘) 지방 패드의 각 유형에 대한 다섯 마우스에 최대, 고립 된 HBSS에 용해에서 유형 III 콜라겐 솔루션의 다섯 밀리리터를 준비합니다. 하나의 유전자형에서 SQ와 VIS를 분리 할 때 야생형과 돌연변이 SQ와 VIS는, 20 ㎖을 예를 들어, 10 mL로합니다. 7.4 인트하여 pH를 조정필터를 화나게. 50 ㎖ 튜브로 나누어지는. 따로 떨어져 빛에서 설정합니다. </li><li> 수술 부위를 소독하기 위해 70 % 에탄올을 사용합니다. 닦아와 푸른 패드 커버. 블루 패드에 약간의 에탄올을 스프레이. </li><li> 스티로폼 보드에 흡수 패드를 고정하고 가위로 잘라하기 위해 22 G 바늘을 사용합니다. 다음 블루 패드에 보드를 설정하고 해부를 시작하기까지 또 다른 블루 패드 커버 에탄올 패드​​ 스프레이. </li><li> 수술 부위에 인접한 스탠드에서 에탄올과 장소이 50 ㎖ 튜브를 입력합니다. 에탄올에 가위와 집게를 놓습니다. </li><li> 수술 도구를 에탄올을 세척을 위해 PBS 플러스 1 배 안티 - 안티 또 다른 50 ML 튜브를 입력합니다. </li><li> 후드에서 각 조직 유형에 대한 라벨 60mm 요리와 37 ºC로 가온 문화 미디어로 채우십시오. 외과 영역에 인접한 플레이트를 놓습니다. </li></ol> 피하 (SQ) 지방 패드 2. 분리 <ol><li> 이소 플루 란과 기흉의 과다 복용으로 마우스를 안락사. </li><li> 부드럽게70 % 에탄올로 마우스 스프레이와 부정사 누워. 22 G 바늘 폼 보드에 발을 고정. </li><li> 하복부의 피부에 작은 상처를 확인합니다. 포셉과 컷의 상단을 잡고 가위를 가지고 복막에서 피부를 분리합니다. </li><li> 피부가 흉부의 복부 복막로부터 분리되면, 상기 몸체의 측면을 따라 피부 측 방향으로 절개함으로써 얻어 헤드쪽으로 복막으로부터 피부를 반영한​​다. </li><li> 떨어져 몸에서 사타구니 지방을 잡고 나머지 피부를 반영, 22 G 바늘 보드 아래로 핀. </li><li> 미세 가위와 집게로 전환합니다. 복막 근처 원점에서 집게로 사타구니 지방 패드를 잡고 피부와 SQ 오염 방지 사타구니쪽으로 진행 피부와 사타구니 지방 사이의 거리 싹둑. </li><li> 표지 60mm 접시에 단리 된 사타구니 지방 패드를 놓습니다. </li></ol> 내 장기 (VIS) 지방 패드 3. 분리 <ol><li> 유사한 방식으로, 2.5 단계 지방 패드와 장 본능적 노출 열려 복막을 잘라. </li><li> 멀리 가슴을 향해 창자를 이동합니다. </li><li> 말단부에서 VIS 지방 패드를 잡고 부드럽게 잡아 당깁니다. 조직 (암컷 마우스를 사용하는 경우, 또는 자궁) 부고환을 제외 할 조심하면서 VIS 지방 패드를 해부하다. </li><li> 라벨 요리와 나머지 VIS 패드 단계를 반복 3.3의 장소. </li></ol> 지방 패드의 4 콜라게나 소화 <ol><li> 조직 문화 후드에 60mm 요리를 이동하고 미디어를 대기음. </li><li> 곡선 가위는 다음 콜라겐 솔루션에 추가로 지방 패드를 말하다. 에탄올과 PBS와 조직 유형 사이에 가위와 집게를 씻어해야합니다. </li><li> 조직이 소화 될 때까지 300 rpm으로 10 ~ 20 분 동안 37 ºC에서 흔들어. SQ의 일부 조각 여전히 볼 수 있습니다 경우는 허용됩니다. 이것은 이후 단계에서 해결 될 것입니다. </li><li> collag을 중지 콜라게나 제 용액에 배양액 25 ㎖를 추가10 ㎖의 혈청 학적 피펫 enase 처리 및 피펫 위아래로 10 배는 소화 조직을 분산합니다. </li><li> 100 μm의 셀 스트레이너를 사용하여 변형 세포. 300 × g으로 10 분 동안 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 펠렛을 방해하고 부드럽게 세포를 일시 중단 피펫을 펠렛에 멸균 물 5ml를 추가하지 미디어를 가만히 따르다. 적혈구를 용균 2 분을 기다립니다. </li><li> 새로운 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 10 % FBS와 변형 세포와 미디어의 25 ML을 추가합니다. </li><li> 300 × g으로 10 분 동안 원심 분리기. 캔트 미디어 및 배양 배지 1 ㎖에 재현 탁 펠렛. </li><li> 1 트리 판 블루 : 1을 사용하여 혈구와 세포를 계산합니다. </li><li> 6 잘 접시에 하나 잘 플레이트 1 × 10 6 세포. </li></ol> 5. 자기 세포 분리 <ol><li> 세포 부착의 약 4 내지 6 시간 후, HBSS (-CA, -mg)로 두 번 세포를 씻어. 0.05 % 트립신을 사용하여 접착 세포를 해리. 1 ml의 분리 버퍼와 스핀에서 트립신 세포 현탁액을 희석300 X g에서 5 분. </li><li> 기음 뜨는. 500 μL 버퍼를 Resuspend 세포. 10 μL 나누어지는을 제거하고 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. </li><li> 300 X g에서 5 분 스핀 세포. </li><li> 대기음이 완전히 뜨는. 90 μL 버퍼를 Resuspend 세포. 10 μl를 방지 SCA1-FITC 차 항체를 추가합니다. 잘 믹스와 어둠 속에서 4 ºC에서 10 분 동안 배양한다. </li><li> ml의 버퍼와 원심 분리기 세포 300 X g에서 5 분 1 세포를 씻으십시오. 완전히 뜨는을 제거합니다. </li><li> 80 μL 버퍼를 Resuspend 세포. 20 μl를 방지 FITC 마이크로 비드를 추가합니다. 잘 믹스와 어둠 속에서 4 ºC에서 15 분 동안 품어. </li><li> ml의 버퍼와 원심 분리기 세포 300 X g에서 5 분 1 세포를 씻으십시오. </li><li> 500 ㎕의 버퍼에 뜨는 및에 resuspend 펠렛을 제거합니다. </li><li> 자기 홀더에 열을 배치하고 500 μL 버퍼 열을 씻어. </li><li> 칼럼에 세포 현탁액을 추가합니다. 피펫 팅하는 동안 거품을 피하십시오. </li><li> 레이블이없는 SCA1를 수집 - &lt;/ SUP&gt; 세포와 500 μL 버퍼로 열 세 번 씻는다. 저수지가 비어있는 경우에만 새로운 버퍼를 추가합니다. 피펫 팅하는 동안 거품을 피하십시오. </li><li> 자기 홀더에서 열을 제거하고 15 ML 원뿔 튜브에 배치합니다. </li><li> 열 저수지를 통해 공급 플런저를 밀어 SCA1의 +를 컬럼에 버퍼 및 용출 ㎖로 1을 추가합니다. </li><li> 300 X g에서 5 분 동안 세포 분수를 스핀 다운. 1 ml의 배양 배지에 재현 탁 세포. </li><li> 레이블과 레이블이없는 분수에서 10 μL 나누어지는을 제거하고 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. </li><li> 6 웰 플레이트의 1도 각 세포 분획 플레이트. </li></ol> 유동 세포 계측법와 SCA1 높은 ACSS의 면역 자기 분리 6. 확인 <ol><li> HBSS (-ca, -mg)로 두 번 세포를 씻어 0.05 % 트립신을 사용하여 세포를 떼어 놓다. </li><li> 5 분 300 XG에 원심 분리기 세포. 1 ml의 배양 배지에 재현 탁 된 세포는 혈구를 사용하여 계산. </li><li> 구하는&gt; 10 (6) </SUP&gt; 1 ml의 배양액에서 세포 5 분 300 XG에 원심 분리기. </li><li> 뜨는 단계를 반복 6.3 두 번 더 제거합니다. </li><li> 2 % 염소 혈청 1 ㎖ + 2 % BSA 및 RT에서 30 분 동안 재현 탁 블록 셀. </li><li> 5 분 300 XG에 원심 분리기 세포. </li><li> 솔루션을 차단 제거합니다. </li><li> 4 ° C에서 2 % 염소 혈청과 2 % BSA + PBS와 PBS 100 ㎕에, : 또는 항 SCA1 알렉사 플 루어 647 (400 0.25 μg의 1) : 쥐 IgG2a의 알렉사 플 루어 647 (400 0.25 μg의 1) 추가 어둠 속에서 30 분 동안. </li><li> 세포에 차가운 PBS 1 ML을 추가합니다. 4 ℃에서 5 분 동안 원심 분리기 300 XG. </li><li> 뜨는 단계를 반복에게 6.9 두 번 더 제거합니다. </li><li> 1 ml의 PBS에 재현 탁 세포. 유세포 분석을위한 준비 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 전달합니다. </li></ol>

<ol><li>Chun, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pericellular+collagenase+directs+the+3-dimensional+development+of+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue.</a> Cell. 125 (3), 577-591 (2006).</li>
<li>Chun, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+link+between+obesity+and+MMP14-dependent+adipogenic+collagen+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover.</a> Diabetes. 59 (10), 2484-2494 (2010).</li>
<li>Chun, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peri-adipocyte+ECM+remodeling+in+obesity+and+adipose+tissue+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">Peri-adipocyte ECM remodeling in obesity and adipose tissue fibrosis.</a> Adipocyte. 1 (2), 89-95 (2012).</li>
<li>Sun, K., Tordjman, J., Clement, K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+and+adipose+tissue+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Fibrosis and adipose tissue dysfunction.</a> Cell Metab. 18 (4), 470-477 (2013).</li>
<li>Spangrude, G., Heimfeld, S., Weissman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Characterization+of+Mouse+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Purification and Characterization of Mouse Hematopoietic Stem Cells.</a> Science. 241, 58-62 (1988).</li>
<li>Welm, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sca-1%28pos%29+cells+in+the+mouse+mammary+gland+represent+an+enriched+progenitor+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Sca-1(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population.</a> Dev Biol. 245 (1), 42-56 (2002).</li>
<li>Gesta, S., Tseng, Y. H., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+origin+of+fat%3A+tracking+obesity+to+its+source%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental origin of fat: tracking obesity to its source.</a> Cell. 131 (2), 242-256 (2007).</li>
<li>Tang, W., Zeve, D., Suh, J. M., Bosnakovski, D., Kyba, M., Hammer, R. E., Tallquist, M. D., Graff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White+fat+progenitor+cells+reside+in+the+adipose+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature.</a> Science. 322, 583-586 (2008).</li>
<li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li>
<li>Tokunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+depot-specific+gene+signature+and+ECM+remodeling+of+Sca1%28high%29+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells.</a> Matrix Biol. 36, 28-38 (2014).</li>
<li>Chun, T. H., Inoue, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+adipocyte+differentiation+and+peri-adipocyte+collagen+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">3-D adipocyte differentiation and peri-adipocyte collagen turnover.</a> Methods Enzymol. 538, 15-34 (2014).</li>
<li>Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+ready-to-use%2C+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).</li>
<li>Ma, X., Robin, C., Ottersbach, K., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ly-6A+%28Sca-1%29+GFP+Transgene+is+Expressed+in+all+Adult+Mouse+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">The Ly-6A (Sca-1) GFP Transgene is Expressed in all Adult Mouse Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells. 20 (6), 514-521 (2002).</li>
<li>Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+adipocyte+cellular+lineage+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo.</a> Nat Cell Biol. 15 (3), 302-308 (2013).</li>
<li>Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+depot-specific+activation+of+adipocyte+precursor+cells+at+the+onset+of+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity.</a> Nat Cell Biol. 17 (4), 376-385 (2015).</li>
<li>Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristic+Expression+of+Extracellular+Matrix+in+Subcutaneous+Adipose+Tissue+Development+and+Adipogenesis%3B+Comparison+with+Visceral+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue.</a> Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).</li>
<li>Ong, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Specific+Cell-Surface+Markers+of+Adipose-Derived+Stem+Cells+from+Subcutaneous+and+Visceral+Fat+Depots%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).</li>
</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

여기에서 우리는 고립과 다른 지방 패드에서 쥐의 ASC의 면역 자기 세포 분리 및 체외 실험에 사용을 보여줍니다. 제시된 방법의 ASC 9,14의 기술적으로 복잡하고 비싼 FACS 매개 분리를 통해 유리하다 SCA1 양성의 ASC의 많은 수의 빠른 분리에 효과적이다. FACS 달리 면역 자기 세포 분리는 표적 세포 모집단의 확인을위한 여러 항원의 사용을 허용하지 않는다. 표면 항원은 잘 특성화되면 ?...

세포 항원 1 (SCA1 또는 Ly6A / E)를 줄기 제 조혈 및 중간 엽 줄기 세포, 6으로 표시되는 세포 표면 마커로 확인되었다. 마우스 지방 저장소에서 얻은 지방 조직의 기질 혈관 분획 (SVF)는 섬유 아 세포, 대 식세포, 혈관 내피 세포, 신경 세포 및 지방 세포의 전구 세포 (7)의 포함하는 세포의 이종 인구입니다. 지방 세포 전구 세포 또는 지방 - 유래 줄기 세포 (ASC를)는 풍부한 혈관 주위 콜라겐이 세포 외 기질 (ECM) (8)에있는 비 지질 함유 세포이다. CD34 + : SCA1 + 9 CD29 + - 약 SVF의 50 %는 혈통 음 (린)와 같은 특징의 ASC,로 구성되어 있습니다. 시험관에서의 지방 세포 분화 할 수있는 지방 세포 전구 세포 - CD24 : 이들 세포의 대부분은 SCA1 + 아르 그러나, 세포의 일부만 (SVF 0.08 %)의 구성을 SCA1 <s최대&gt; + : 증식 및 생체 조건 9 지방 세포로 분화 완벽하게 할 수있는 CD24 + 세포. CD24에서 CD24 + 세포를 구별하지 않고 SCA1 + SVF를 사용한 전위주의에도 불구하고 - 면역 자기 세포 분리를 사용하여 지방 저장소로부터 SCA1 +의 ASC를 세포를 단리 차 지방 세포 전구 세포의 세포 자율 표현형을 결정하는 효율적이고 실용적인 접근 방식이다. 비만과 당뇨병, 조직의 섬유화와 염증의 분야에서 2 형 당뇨병 3의 개발과 유지에 중요한 역할을한다. 최근, 토쿠 나가 등. (VIS, 또는 내장) 서혜부 (또는 피하, SQ)과 perigonadal에서 분리 SCA1 높은 세포 C57BL6 / J 지방 저장소가 시험관 (10)의 서로 다른 유전자 서명과 ECM의 리모델링을 나타내는 것으로 나타났다. MMP14 (MT1-MMP), 막-t의 원형 회원YPE 매트릭스 메탈은 (MMP) 패밀리는 collagenolytic 활성 (1)을 백색 지방 조직 (WAT)의 개발을 매개한다. 다음 프로토콜을 통해 분리되고 농축 된 세포로 수행 될 수있다 실험 예는 삼차원 배양, 분화 연구, 콜라겐 분해 분석 및 RNA 서열 10, 11을 포함한다. 분해 분석은 텔로 펩타이드 (11, 12)의 보존을 보장하기 위해, 산 추출 콜라겐으로 수행되어야한다. 다음 프로토콜은 서로 다른 지방 저장소에서 주요 혈관 간질 세포를 분리 및 면역 자기 세포 분리를 이용하여 지방 세포의 전구 세포를 풍부하게하는 방법을 설명 할 것이다. 셀 정렬의 유효성은 유동 세포 계측법으로하고 SCA1 프로모터 (13)에 의해 구동 SCA1 + 세포에서 GFP를 표현 SCA1-GFP 마우스를 사용을 통해 평가한다.

<table><tbody><tr><td>Type 3 Collagenase</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004182</td><td>Tissue digestion</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>High-glucose culture medium</td></tr><tr><td>Pen/Strep/Glutamine (100x)</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>Media antibiotic</td></tr><tr><td>Anti-anti (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>Media antifungal</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x, pH 7.4)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin (0.05%)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>BD Bioscience</td><td>352360</td><td>100-&amp;mu;m cell strainer</td></tr><tr><td>60 mm plates</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td>Large</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>FST</td><td>14091-11</td><td>Fine, curved tip</td></tr><tr><td>Large Forceps</td><td>FST</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Any vendor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25G 5/8&amp;rdquo; needles</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>22G 1.5&amp;rdquo; needles</td><td>BD</td><td>305159</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>MACS separation columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sca1 microbead kit (FITC)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-529</td><td>FITC-anti-Sca1 1&amp;ordm;Ab and anti-FITC microbeads 2&amp;ordm;Ab</td></tr><tr><td>AutoMACS running buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Blue chux pads</td><td>Fisher</td><td>276-12424</td><td></td></tr><tr><td>Absorbent pads</td><td>Fisher</td><td>19-165-621</td><td></td></tr><tr><td>Styrofoam board</td><td></td><td></td><td>Use from 50 ml tubes</td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Any vendor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2a Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>R2a21</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>MSCA21</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2a R-PE</td><td>Invitrogen</td><td>R2a04</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE</td><td>Invitrogen</td><td>MF48004</td><td></td></tr><tr><td>Round-bottom tube</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (&amp;ndash;Ca, &amp;ndash;Mg)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (+Ca, +Mg)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>For collagenase solution</td></tr><tr><td>Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid</td><td>Prepare in house&lt;sup&gt;12&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Gibco</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>0.34 N NaOH</td><td>Prepare in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cover slips</td><td>Corning</td><td>2870-22</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>0.89 M NaHCO&lt;sub&gt;3&amp;nbsp;&lt;/sub&gt;</td><td>Gibco</td><td>25080-094</td><td></td></tr></tbody></table>

immunomagnetic separation of fat depot-specific sca1high adipose-derived stem cells (ascs)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1high ASCs.

다른 지방 패드에서 SCA1 고의 ASC의 농축. SQ 지방 디스플레이와 같은 섬유 아세포로부터 단리 혈관 간질 세포 SCA1 발현 수준 (도 1a)에 관계없이 셀 형상 뻗어있다. VIS 한편, (EWAT이 유래) 높은 ​​SCA1 및 SCA1 낮은 세포는 세포 형태에 뚜렷한 차이를 보여줍니다. VIS SQ (iWAT 유래) SCA1 높은</s...

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Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.

지방 창고 별 SCA1의 면역 자기 분리<sup&gt; 높은</sup&gt; 지방이 유래 줄기 세포 (의 ASC)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

6.9K 조회수.  Biointerfaces Institute, University of Michigan. We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.

비디오: Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

분리 및 인간의 농축 향상된 골 연장술에 대한 기질 세포를 지방이 유래

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

연구

발생학

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of cardiovascular disease. ADSCs derived from different adipose tissues show distinct features, and those from the PVAT have not been well characterized. In a recent study, we reported that some ADSCs in the periaortic arch adipose tissue (PAAT) descend from the neural crest cells (NCCs), a transient population of migratory cells originating from the ectoderm.
In this paper, we describe a protocol for isolating red fluorescent protein (RFP)-labeled NCCs from the PAAT of Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+ mice and inducing their adipogenic differentiation in vitro. Briefly, the stromal vascular fraction (SVF) is enzymatically dissociated from the PAAT, and the RFP+ neural crest derived ADSCs (NCADSCs) are isolated by fluorescence activated cell sorting (FACS). The NCADSCs differentiate into both brown and white adipocytes, can be cryopreserved, and retain their adipogenic potential for ~3&#8211;5 passages. Our protocol can generate abundant ADSCs from the PVAT for modeling PVAT adipogenesis or lipogenesis in vitro. Thus, these NCADSCs can provide a valuable system for studying the molecular switches involved in PVAT differentiation.

We present a protocol for the isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest derived adipose-derived stem cells (NCADSCs) from the periaortic adipose tissue of Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+ mice. The NCADSCs can be an easily accessible source of ADSCs for modeling adipogenesis or lipogenesis in vitro.

신경 문장 원래 지방 유래 줄기 세포의 격리, 문화 및 지방 유도는 periaortic 지방 조직에서

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute functionally to the expansion and remodeling of WAT in adulthood. A tremendous barrier to studying the implications of this cellular heterogeneity is the inability to readily isolate functionally distinct cell subpopulations from WAT SVF for in vitro and in vivo analyses. Single-cell sequencing technology has recently identified functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic PDGFR&#946;+ perivascular cell subpopulations in intra-abdominal WAT depots of adult mice. Fibro-inflammatory progenitors (termed, &#8220;FIPs&#8221;) are non-adipogenic collagen producing cells that can exert a pro-inflammatory phenotype. PDGFR&#946;+ adipocyte precursor cells (APCs) are highly adipogenic both in vitro and in vivo upon cell transplantation. Here, we describe multiple methods for the isolation of these stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal WAT depots. FIPs and APCs can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) or by taking advantage of biotinylated antibody-based immunomagnetic bead technology. Isolated cells can be used for molecular and functional analysis. Studying the functional properties of stromal cell subpopulation in isolation will expand our current knowledge of adipose tissue remodeling under physiological or pathological conditions on the cellular level.

This protocol describes the technical approach to isolate adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal white adipose tissue (WAT) depots by fluorescence-activated cell sorting or immunomagnetic bead separation.

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute ...

면역학 및 감염병학

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult stem cells from liposuctioned adipose tissue that they initially termed Processed Lipoaspirate Cells or PLA cells. Since then, these stem cells have been renamed as Adipose-derived Stem Cells or ASCs and have gone on to become one of the most popular adult stem cells populations in the fields of stem cell research and regenerative medicine. Thousands of articles now describe the use of ASCs in a variety of regenerative animal models, including bone regeneration, peripheral nerve repair and cardiovascular engineering. Recent articles have begun to describe the myriad of uses for ASCs in the clinic. The protocol shown in this article outlines the basic procedure for manually and enzymatically isolating ASCs from large amounts of lipoaspirates obtained from cosmetic procedures. This protocol can easily be scaled up or down to accommodate the volume of lipoaspirate and can be adapted to isolate ASCs from fat tissue obtained through abdominoplasties and other similar procedures.

In 2001, researchers at UCLA described the isolation of a population of adult stem cells, termed Adipose-derived Stem Cells or ASCs, from adipose tissue. This article outlines the isolation of ASCs from lipoaspirates using a manual, enzymatic digestion protocol using collagenase.

인간 Lipoaspirates에서 지방 유래 줄기 세포를 수동으로 분리

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

생물학

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. As a clinically relevant cell type, optimal methods are needed to isolate and expand these cells in vitro. Most methods to isolate adipose-derived MSCs (ADSCs) rely on harsh enzymes, such as collagenase, to digest the adipose tissue. However, while effective at breaking down the adipose tissue and yielding a high ADSC recovery, these enzymes are expensive and can have detrimental effect on the ADSCs &#8212; including the risks of using xenogeneic components in clinical applications. This protocol details a method to isolate ADSCs from fresh lipoaspirate and abdominoplasty samples without enzymes. Briefly, this method relies on mechanical disassociation of any bulk tissue followed by an explant-type culture system. The ADSCs are permitted to migrate out of tissue and onto the tissue culture plate, after which the ADSCs can be cultured and expanded in vitro for any number of research and/or clinical applications.

This protocol provides an enzyme-free method for isolating mesenchymal stem cells from abdominoplasty and lipoaspirate samples using an explant method. The absence of harsh enzymes or centrifugation steps provides for clinically relevant stem cells that can be used for studies in vitro or transferred back to the clinic.

인간 지방분지 유래 중간엽 줄기 세포의 분리 및 확장을 위한 효소 없는 방법

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

의학

Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible source for regenerative clinical applications. Different protocols have been used to obtain adipose-derived stem cells. This article describes different steps of an improved time-saving protocol to obtain a more significant amount of ADSC, showing how to cryopreserve and thaw ADSC to obtain viable cells for culture expansion. One hundred milliliters of lipoaspirate were collected, using a 26 cm three-hole and 3 mm caliber syringe liposuction, from the abdominal area of nine patients who subsequently underwent elective abdominoplasty. The stem cells isolation was carried out with a series of washes with Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) solution supplemented with calcium and the use of collagenase. Stromal Vascular Fraction (SVF) cells were cryopreserved, and their viability was checked by immunophenotyping. The SVF cellular yield was 15.7 x 105 cells/mL, ranging between 6.1-26.2 cells/mL. Adherent SVF cells reached confluence after an average of 7.5 (&#177;4.5) days, with an average cellular yield of 12.3 (&#177; 5.7) x 105 cells/mL. The viability of thawed SVF after 8 months, 1 year, and 2 years ranged between 23.06%-72.34% with an average of 47.7% (&#177;24.64) with the lowest viability correlating with cases of two-year freezing. The use of DPBS solution supplemented with calcium and bag resting times for fat precipitation with a shorter time of collagenase digestion resulted in an increased stem cell final cellular yield. The detailed procedure for obtaining high yields of viable stem cells was more efficient regarding time and cellular yield than the techniques from previous studies. Even after a long period of cryopreservation, viable ADSC cells were found in the SVF.

The present protocol describes an improved methodology for ADSC isolation resulting in a tremendous cellular yield with time gain compared to the literature. This study also provides a straightforward method for obtaining a relatively large number of viable cells after long-term cryopreservation.

지방 조직에서 중간엽 줄기세포를 얻는 기술 및 장기 냉동 보존에서 기질 혈관 분획 특성 분석

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident adipose progenitor cells (APCs) play a key role in adipose tissue homeostasis and can contribute to the tissue pathology. The growing use of single cell analysis technologies &#8211; including single-cell RNA-sequencing and single-cell proteomics &#8211; is transforming the stem/progenitor cell field by permitting unprecedented resolution of individual cell expression changes within the context of population- or tissue-wide changes. In this article, we provide detailed protocols to dissect mouse epididymal adipose tissue, isolate single adipose tissue-derived cells, and perform fluorescence activated cell sorting (FACS) to enrich for viable Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APCs. These protocols will allow investigators to prepare high quality APCs suitable for downstream analyses such as single cell RNA sequencing.

We present a simple method to isolate highly viable adipose progenitor cells from mouse epididymal fat pads using fluorescence activated cell sorting.

마우스 전형 지방 조직에서 지방 전구의 준비

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

지방 조직 유래 줄기세포 분리 및 특성 분석

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in addition to their great capacity for self-renewal, migration, and proliferation. Adipose tissue is one of the least invasive and most accessible sources of mesenchymal cells. It has also been reported to have higher yields compared to other sources, as well as superior immunomodulatory properties. Recently, different procedures for obtaining adult mesenchymal cells from different tissue sources and animal species have been published. After evaluating the criteria of some authors, we standardized a methodology that is applicable to different purposes and easily reproducible. A pool of stromal vascular fraction (SVF) from perirenal and epididymal adipose tissue allowed us to develop primary cultures with optimal morphology and functionality. The cells were observed adhered to the plastic surface for 24 h, and exhibited a fibroblast-like morphology, with prolongations and a tendency to form colonies. Flow cytometry (FC) and immunofluorescence (IF) techniques were used to assess the expression of the membrane markers CD105, CD9, CD63, CD31, and CD34. The ability of adipose-derived stem cells (ASCs) to differentiate into the adipogenic lineage was also assessed using a cocktail of factors (4 &#181;M insulin, 0.5 mM 3-methyl-iso-butyl-xanthine, and 1 &#181;M dexamethasone). After 48 h, a gradual loss of fibroblastoid morphology was observed, and at 12 days, the presence of lipid droplets positive to oil red staining was confirmed. In summary, a procedure is proposed to obtain optimal and functional ASC cultures for application in regenerative medicine.

저자 스포트라이트: Sprague Dawley Rats의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별  

This protocol describes a methodology for isolating and identifying adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (MSCs) from Sprague Dawley rats.

Sprague Dawley 쥐의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

지방 창고 별 SCA1의 면역 자기 분리

요약

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Sprague Dawley 쥐의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별

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