We thank Saran Kupul for technical assistance. This work was supported in part by NIH grant R01-AI104952 to FW. Further support was provided by the University of Alabama at Birmingham (UAB) Center for AIDS Research (CFAR), an NIH funded program (P30 AI027767) that was made possible by the following NIH Institutes: NIAID, NIMH, NIDA, NICHD, NHLDI, NIA.

1. Biofilm ייזום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תרבות של אורגניזם לייצר ביופילם בתווך עשיר מזין. לחסן זן aureus Staphylococcus ניומן ב 10 מ&quot;ל של מדיום מולר-הינטון ממלאי גליצרול. לבצע את כל העבודות שיש בהן טיפול S. aureus עם כפפות בתוך ארון בטיחות ביולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 16 שעות ב 37 ° C על שייקר רוטרי (100-200 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע OD 600 של התרבות באמצעות ספקטרופוטומטר ו קובט סטנדרטי (אורך מסלול: 1cm). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את נפח (V) של תרבות צריכה להכין 20 מ&quot;ל של הבידוד עם OD 600 (הבידוד) של 0.1 ב chelexed התקשורת מכון ממוריאל פארק Roswell (CRPMI) 9 באמצעות הנוסחה: [V = 20 מ&quot;ל * 0.1 / OD 600 (תרבות )] הערה: Reference 9 מספק פרטים על הכנת CRPMI. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את נפח תרבות מחושב (מלמעלה) לצינור צנטריפוגות ותאי גלולה על ידי ספינינג 1 דקות ב g 10,000 x. כדי prepaמחדש הבידוד ביופילם, לשאוב התא גלולה בינוני ו resuspend צמיחה בילה 20 מ&quot;ל CRPMI. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים הבידוד למאגר 25 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את המכסה מעל צלחת יתד 96-גם סטרילי על ידי משיכתו כלפי מעלה. הערה: יש להקפיד לא לזהם את היתדות שמוט מהמכסה. המכסה ניתן להציב במהופך על משטח נקי בתוך ארון בטיחות ביולוגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה 200 רב ערוצית μl, להוסיף 125 בידוד μl היטב בכל שורות A עד G של הצלחת התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו 125 μl סטרילי בינוני CRPMI היטב בכל שורה H כביקורת על סטריליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את-מכסה היתד והחזק אותו מעל תחתית הצלחת עם היתדות הפונות כלפי מטה. בזהירות ליישר את יתדות פרט עם הבארות שלהם. יש להימנע ממגע פיזי בין צלחת את היתדות. לאחר מיושר, להוריד את המכסה בזהירות למטה. הימנע misalignments כמו readjustments שבוצע לאחר היתדות נגע הצלחת התחתונה עשויה המשךשולטת עקרות aminate בשורה H. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את המכסה לצלחת עם הסרט פרפין כדי למנוע אידוי ומניחים בשקית ניילון סגר, איטום בחוזקה. שמור את נפח האוויר בשקית הנמוכה ככל האפשר על מנת למזער התאדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בלי ללחוץ על 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות 2 באינקובטור 5% CO. הערה: 48 שעות של צמיחה היו אופטימליות עבור ס aureus, אך ישתנו בהתבסס על האורגניזם בשימוש. הערה: למרות דגירת סטטי היא נקודת התחלה טובה כדי לייעל את assay, רועד בעדינות 150 סל&quot;ד על שייקר microplate היא וריאציה אפשרית כדי להביא להגברת היווצרות ביופילם של כמה ס aureus מבודד. </li></ol> 2. הכנת פלייט אתגר Biofilm <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום האתגר ביופילם לקחת צלחת 96-היטב טרי ולהוסיף 100 μl של CRPMI, equilibrated כדי RT, היטב כל השורות ב &#39;ח כדי למנוע תוצאות לא עקביות, לנצל צלחת 96-היטב שיכול להכיל 200 μlשל תקשורת כאשר היתדות הן בפנים, כוללות בארות עם ממדים זהים לאלה של הצלחת הייזום ביופילם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל עד 4 תרכובות בדיקה בנפרד 1.0 מיליליטר של CRPMI ל 2x לריכוז הסופי הרצוי, כדי לתת דין וחשבון על דילול סופי בשלב 2.7. הערה: נקודת התחלה טובה היא 8 לקפל מעל ריכוז המעכבות של תאי planktonic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של המתחם 1 בבארות A1 ל- A3, מתחם 2 בבארות A4 עד A6, מתחם 3 בבארות A7 כדי A9 מתחם 4 בבארות A10 כדי A12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדרתי לדלל את תרכובות הבדיקה באמצעות פיפטה רבה ולהעביר 100 μl משורה א &#39;עד בטור ב ומערבבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן זה, להמשיך להעביר 100 μl לבאר. מערבב אחרי כל העברה ולהפסיק בשורת פ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ערבוב, לגרש 100 μl משורה F לתוך מיכל פסולת. אל תעבירו את כל נוזל אל שורות G ו- H. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של CRPMI היטב כל הצלחת באמצעות פיפטה רבה כדילהביא את נפח 200 μl. ראה איור 1 עבור פריסת צלחת סופית. </li></ol> 3. אתגר Biofilm <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של בופר פוספט (PBS) בצלחת 96-גם סטרילי טרי כי תכונות בארות עם ממדים זהים לאלה של הצלחת ייזום ביופילם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא את שקית פלסטיק סרט פרפין מצלחת הייזום ביופילם מודגרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את המכסה כלפי מעלה. יש להימנע ממגע בין יתדות והחלק התחתון צלחת כפי שהדבר עלול לגרום נזק ביופילם. שמור חלק תחתון לניתוח שלאחר מכן OD 600 (ראה 3.8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף תאי planktonic על ידי נחת-המכסה יתד לצלחת המכילה PBS (משלב 3.1). לצלול יתדות במשך 5 שניות, להרים מתוך PBS, לצלול שוב, נזהרים שלא לפגוע יתדות נגד הצדדים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את יתד המכסה שטוף לתוך הצלחת האתגר. הימנעו ממגע בלתי נחוץ בין יתדות הצלחת התחתונה כמו זו תגרום נזק ביופילם המובילתוצאות לא עקביות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת חותם עם הסרט פרפין ומקום לתוך שקית ניילון סגר כמתואר בשלב 1.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצלחת ללא רעד במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס חממת 2 5% CO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח בתחתית צלחת biofilm ייזום מ -3.3. Resuspend החיידקים בכל טוב בעזרת פיפטה רבה ערוצים ולמדוד את OD 600 עם קורא microplate מתאים כדי לאשר צמיחה המתרחשת כל הבארות אבל שולט עקרות בשורה H. </li></ol> 4. קביעת Biofilm <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בקורא צלחת מצויד בתא דגירה ומסוגלים לקחת קריאות הקרינה הקינטית לאיתור resazurin המרה. הגדרת מדידת קרינה הקינטית 24 שעות באמצעות עירור 530 ננומטר 590 פליטת ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הטמפרטורה בתא עד 37 ° C ויש להם את צלחת לקרוא כל 20 דק &#39;. הגדר את קורא הצלחת למדוד מהחלק התחתון של הצלחת פי instruc של היצרןמשא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן צלחת לשטוף ידי הוספת 200 μl של PBS עם פיפטה רבה לצלחת גם 96 סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני התאוששות ביופילם על ידי הוספת 400 μl של 0.8 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​resazurin הפתרון המניות 20 מ&quot;ל של מדיום CRPMI לריכוז סופי של resazurin 16 מיקרוגרם / מ&quot;ל. הערה: Resazurin הוא מגרה את העור ידוע. השתמש בחלוק מעבדה, משקפים להתיז, וכפפות בזמן הטיפול. CRPMI כמו תקשורת התאוששות ביופילם שמש משום שהוא מספק את אות הרקע הנמוכה ביותר, אבל זה יכול להיות מוחלף על ידי תקשורת מילר Hinton אם מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 150 μl של מדיום התאוששות ביופילם עם טפטפת רב היטב בכל צלחת 96-היטב טריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת צלחת אתגר מן החממה לתוך ארון בטיחות ביולוגי ובזהירות להסיר שקית פלסטיק סרט איטום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מכסת היתד מצלחת האתגר ולשטוף תאי planktonic ב PBS כמתואר 3.4. שמור את החלק התחתון של צלחת אתגר OD עוקבת 600 anaתמוגה (ראה 4.10). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה, למקם את מכסת היתד לתוך התחתון הצלחת המכיל את מדיום ההתאוששות ביופילם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוטף את הצד של הצלחת עם סרט פרפין, נזהר שלא להכשיל את החלק התחתון של הבארות ההיקפיות. מייד לאחר לעטוף את הצלחת, ומניח אותו על קורא הצלחת ולהתחיל לקרוא הקינטית פני תקופה של 24 שעות על ידי ייזום עשה בעבר resazurin פרוטוקול הקינטית משלב 4.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת הצמיחה של תאים planktonic שעשוי או עלול לא להתרחש במהלך האתגר, לקרוא את OD 600 של תחתית צלחת האתגר כולו באמצעות קורא צלחת מיקרו. פעל בהתאם להוראות שניתנו בשלב 3.8. הערה: בזהירות resuspend התוכן של כל אחד גם כתאים משילים את ביופילם נוטים לגדול במקבצים בתחתית הבאר. כל בועות בתוך הבאר תפרענה מאוד עם קריאות OD 600 ו יש להימנע או להסיר לפני לקרוא. </li></ol>

<ol>
	<li>Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+insights+from+biofilm+biology+to+drug+development+-+can+a+new+approach+be+developed.">Applying insights from biofilm biology to drug development - can a new approach be developed.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 791-808 (2013).</li><li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prosthesis+infections+after+orthopedic+joint+replacement:+the+possible+role+of+bacterial+biofilms.">Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms.</a> Orthop Rev (Pavia). 5, 65-71 (2013).</li><li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases).">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases).</a> Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).</li><li>Bordi, C., de Bentzmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hacking+into+bacterial+biofilms:+a+new+therapeutic+challenge.">Hacking into bacterial biofilms: a new therapeutic challenge.</a> Ann Intensive Care. 1, 19 (2011).</li><li>Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+laboratory+reference+strains+mirror+'real-world'+pathogenesis?.">Can laboratory reference strains mirror 'real-world' pathogenesis?.</a> Trends Microbiol. 13, 58-63 (2005).</li><li>Kwasny, S. M., Opperman, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Static+biofilm+cultures+of+Gram-positive+pathogens+grown+in+a+microtiter+format+used+for+anti-biofilm+drug+discovery.">Static biofilm cultures of Gram-positive pathogens grown in a microtiter format used for anti-biofilm drug discovery.</a> Curr Protoc Pharmacol. Chapter 13, Unit 13A 18 (2010).</li><li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MBEC+Assay+System:+multiple+equivalent+biofilms+for+antibiotic+and+biocide+susceptibility+testing.">The MBEC Assay System: multiple equivalent biofilms for antibiotic and biocide susceptibility testing.</a> Methods Enzymol. 337, 377-385 (2001).</li><li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Calgary+Biofilm+Device:+new+technology+for+rapid+determination+of+antibiotic+susceptibilities+of+bacterial+biofilms.">The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms.</a> J Clinical Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).</li><li>Baker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+stress+induces+a+global+stress+response+in+Staphylococcus+aureus+and+represses+sae+and+agr+expression+and+biofilm+formation.">Copper stress induces a global stress response in Staphylococcus aureus and represses sae and agr expression and biofilm formation.</a> Appl Environ Microbiol. 76, 150-160 (2010).</li><li>Haeili, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+complexation+screen+reveals+compounds+with+potent+antibiotic+properties+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus.">Copper complexation screen reveals compounds with potent antibiotic properties against methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58, 3727-3736 (2014).</li><li>O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+Alamar+Blue+(resazurin)+fluorescent+dye+for+the+assessment+of+mammalian+cell+cytotoxicity.">Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity.</a> Eur J Biochem. 267, 5421-5426 (2000).</li><li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+the+minimal+bactericidal+concentration+of+an+antimicrobial+agent+for+planktonic+cells+(MBC-P)+and+biofilm+cells+(MBC-B).">Establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (MBC-P) and biofilm cells (MBC-B).</a> J Vis Exp. (83), e50854 (2014).</li><li>Junker, L. M., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screens+for+small-molecule+inhibitors+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development.">High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).</li><li>Shah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persisters:+a+distinct+physiological+state+of+E.+coli.">Persisters: a distinct physiological state of E. coli.</a> BMC Microbiol. 6, 53 (2006).</li><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riddle+of+biofilm+resistance.">Riddle of biofilm resistance.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45, 999-1007 (2001).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הנה, יש לנו תארנו assay biofilm שונה לקביעת פעילות של מעכבים נבדקו על S. biofilms aureus התמקדות מצב מטבולי של תאים הקשורים ביופילם. בעוד נהלים אתגר וייזום ביופילם תיאר בעיקר המלצות היצרן חיקה, השימוש resazurin לצבוע לזהות ולכמת תאים הקשורים biofilm ששורדים אתגר 24 שעות מעכב באופן...

חיידקים פתוגניים יכולים ליצור biofilms in vivo מוביל לזיהומים כרוניים שאינם חריפים 1. הזיהום הקשורים biofilm הוא גורם סיכון רציני של פרוצדורות רפואיות שכוללות השתלה של גופים זרים (למשל, מחליף עצם מלאכותי, שתלים בחזה) או באמצעות ההתקנה של צינורות לקנה נשימה או צנתרי שתן 2. בהקשרים אלה, טיפול אנטי זיהומיות הוא כמעט תמיד הכרחי כמו זיהומים מבוססים ביופילם נמחקים לעתים רחוקות בכוחות עצמם, אפילו אצל אנשים עם מערכת חיסון תקינים. Staphylococcus aureus הוא אחד מגורמי המחלה העיר לעתים הקרוב ביותר המעורבים סיבוכים הקשורים biofilm המתרחשים במהלך השימוש 3 מכשירים רפואיים פולשניים. למרבה הצער, טבעו של biofilms כמחסום מגן שהופך אותם עמיד יותר לטיפול מאשר תאי planktonic 1,4, וההערכה של יעילות קלינית חזה היא חלק קריטי של השני ראשוניפיתוח תרופות כמו גם מעקב עמידות לתרופות. יש הכרה גוברת כי בתנאי מעבדה, מתמקדים תרבויות planktonic, לא יכולים לייצג נאמן בעולם האמיתי מחלה 5. עוד הרכבה את הבעיה, השכפול של פנוטיפים biofilm קשה, ומודלים ביופילם קיימים הם מייגעים סובלים הבנת גבוה ולהבדלי תוך assay 6. לכן, חוקרים רבים, דרך צורך, כברירת מחדל מבחני תא planktonic רגישות תרופה, ובכך באופן פוטנציאלי הזנחת היבט חשוב של ארסיויות חיידקים ומחלות. כאן אנו מתארים את הפרוטוקול לחיידקי assaying, במיוחד ס aureus, ב biofilms טרום גדל ניצול 7,8 מערכת ביופילם מבוסס 96-היטב. בעוד הפרוטוקול להיווצרות ואתגר ביופילם כדלקמן בעצם המלצת היצרן, אנו מציגים מתודולוגיה מידע עשיר חלופית לכימות את הכדאיות של biofILM לאחר אתגר. בקצרה, חיידקים בתרבית צלחת היתד, שם biofilms להיוצר על היתדות הבולטות המצורפות את המכסה של הצלחת. לאחר ההיווצרות ביופילם, את היתדות הם טבלו בעדינות בבארות של צלחת טריה המלאה PBS להסיר תאי planktonic. PEG-מכסה, עם biofilms המצורפת, מועבר צלחת אתגר חדש, המכיל ריכוזים שונים של אנטיביוטיקה להיות assayed. לאחר דגירה שנייה, מכסה שוב מוסרים, שטף, והועברתי צלחת התאוששות המכילה resazurin לצבוע, שם הם עוברים דגירה סופית. מרת Resazurin ניתן להקליט kinetically או נלקחת קריאת הסיום לאחר תקופת החלמה מוגדרת. שיטת צבע מבוסס זה לכימות הכדאי של biofilms שונה באופן משמעותי מן (יחידות המושבה להרכיב) CFU המייגעים מתודולוגיה לספור מבוססת כמתואר בפרוטוקול המקורי 7. OD 600 מדידות של צלחת תרופת אתגר resazurin קינטיקה המר לשמש לקריאה כדאיתקטן של תאי planktonic ו biofilm, בהתאמה, המציע assay מהיר, אמין ועשיר במידע ופשוט טכני להישרדות ביופילם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="612">
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:227px;">&#160;Mueller-Hinton Medium</td>
			<td style="width:89px;">Oxoid</td>
			<td style="width:103px;">CM0405</td>
			<td style="width:195px;">Follow recommendations of manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:227px;">RPMI-medium</td>
			<td style="width:89px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:103px;">17-105-CV</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:227px;">CRPMI</td>
			<td style="width:89px;">Ref 9</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:195px;">RPMI-1640 medium chelexed for 1h with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:227px;">Chelex 100 Resin</td>
			<td style="width:89px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:103px;">142-2822</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:227px;">MBEC-plates</td>
			<td style="width:89px;">Innovotech</td>
			<td style="width:103px;">19111</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:227px;">Resazurin Sodium Salt</td>
			<td style="width:89px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">R7017</td>
			<td style="width:195px;">800&#181;g/ml in DI water&#160;&#160;&#160;&#160; Filter sterile</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:227px;">Micro Plate Shaking Platform&#160;</td>
			<td style="width:89px;">Heidolph Titramax 1000</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:227px;">Cytation 3 Plate Reader</td>
			<td style="width:89px;">Biotek</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:58px;width:227px;">Gen5 software</td>
			<td style="width:89px;">Biotek</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:195px;">Recording and analysis of resazurin conversion</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:227px;">Neocuproine</td>
			<td style="width:89px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">N1501&#160;</td>
			<td style="width:195px;">prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:227px;">Copper sulfate</td>
			<td style="width:89px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:103px;">7758-99-8</td>
			<td style="width:195px;">prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:227px;">Cu-Neocuproine</td>
			<td style="width:89px;">Self-Made</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:195px;">Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:227px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:89px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">G3632-1G</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting biofilm associated staphylococcus aureus using resazurin based drug-susceptibility assay

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.

את assay resazurin הוא רגיש מספיק כדי לזהות באופן אמין מאוד כמה תאי קיימא יכולת שכפול במדיום נקי מסמים לאחר אתגר. ב מתודולוגיה זו, נגדיר את הריכוז בביעור ביופילם המינימאלי כמו הריכוז הנמוך ביותר בה ללא מרת resazurin נתפסת בתוך 24 שעות. את assay resazurin מסתמך על מולקול?...

Watch this Scientific Journal Video about Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay at JoVE.com

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

מיקוד Associated Biofilm<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Assay רגישות בסמים בהתבסס Resazurin שימוש

Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

targeting-biofilm-associated-staphylococcus-aureus-using-resazurin

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

12.9K Views.  University of Alabama at Birmingham. Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms. 

Video: Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Biofilm microtiter תבשיל גיבוש Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1 Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached to a surface.2 Biofilm formation and development are commonly studied in the laboratory using batch systems such as microtiter plates or flow systems, such as flow-cells. These methodologies are useful for screening mutant and chemical libraries (microtiter plates)3 or growing biofilms for visualization (flow cells)4. Here we present detailed protocols for growing Staphylococcus aureus in two additional types of flow system biofilms: the drip flow biofilm reactor and the rotating disk biofilm reactor.
Drip flow biofilm reactors are designed for the study of biofilms grown under low shear conditions.5 The drip flow reactor consists of four parallel test channels, each capable of holding one standard glass microscope slide sized coupon, or a length of catheter or stint. The drip flow reactor is ideal for microsensor monitoring, general biofilm studies, biofilm cryosectioning samples, high biomass production, medical material evaluations, and indwelling medical device testing.6,7,8,9
The rotating disk reactor consists of a teflon disk containing recesses for removable coupons.10 The removable coupons can by made from any machinable material. The bottom of the rotating disk contains a bar magnet to allow disk rotation to create liquid surface shear across surface-flush coupons. The entire disk containing 18 coupons is placed in a 1000 mL glass side-arm reactor vessel. A liquid growth media is circulated through the vessel while the disk is rotated by a magnetic stirrer. The coupons are removed from the reactor vessel and then scraped to collect the biofilm sample for further study or microscopy imaging. Rotating disc reactors are designed for laboratory evaluations of biocide efficacy, biofilm removal, and performance of anti-fouling materials.9,11,12,13

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Protocols for utilizing open system flow biofilms with drip flow reactors and rotating disk reactors are presented in detail.

השימוש זרימה טפטוף ו כורים דיסק סיבוב עבור Staphylococcus aureus Biofilm ניתוח

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the United States. Among soft-tissue infections, myositis, pyomyositis, and necrotizing fasciitis have been increasingly reported in association with MRSA arising from the community. To understand the interplay between MRSA and host immunity leading to more severe infection, the availability of animal models is critical, permitting the study of host and bacterial factors. Several infection models have been introduced to assess the pathogenesis of S. aureus during superficial skin infection. Here, we describe a subcutaneous infection model that examines the skin, subcutaneous, and muscle pathologies.

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

Murine skin and soft tissue infection model is utilized for assessing the virulence function of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and the host immunological responses. Here, we presented a subcutaneous infection model for skin and soft tissue infection.

זיהום תת עורי של סטפילוקוקוס אוראוס עמיד Methicillin (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause of such syndromes with unacceptably high morbidity and mortality even with appropriate antimicrobial agent treatments4-6. The increase in infections due to methicillin-resistant S. aureus (MRSA), the high rates of vancomycin clinical treatment failures and growing problems of linezolid and daptomycin resistance have all further complicated the management of patients with such infections, and led to high healthcare costs7, 8. In addition, it should be emphasized that most recent studies with antibiotic treatment outcomes have been based in clinical settings, and thus might well be influenced by host factors varying from patient-to-patient. Therefore, a relevant animal model of endovascular infection in which host factors are similar from animal-to-animal is more crucial to investigate microbial pathogenesis, as well as the efficacy of novel antimicrobial agents. Endocarditis in rat is a well-established experimental animal model that closely approximates human native valve endocarditis. This model has been used to examine the role of particular staphylococcal virulence factors and the efficacy of antibiotic treatment regimens for staphylococcal endocarditis. In this report, we describe the experimental endocarditis model due to MRSA that could be used to investigate bacterial pathogenesis and response to antibiotic treatment.

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

Experimental rat endocarditis model due to methicillin-resistant S. aureus.

אנדוקרדיטיס דגם ניסיוני של Methicillin עמיד<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; (MRSA) ב עכברוש

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant reservoir of iron inside the human host is heme, which is the cofactor of hemoglobin. To acquire iron from hemoglobin, S. aureus utilizes an elaborate system known as the iron-regulated surface determinant (Isd) system1. Components of the Isd system first bind host hemoglobin, then extract and import heme, and finally liberate iron from heme in the bacterial cytoplasm2,3. This pathway has been dissected through numerous in vitro studies4-9. Further, the contribution of the Isd system to infection has been repeatedly demonstrated in mouse models8,10-14. Establishing the contribution of the Isd system to hemoglobin-derived iron acquisition and growth has proven to be more challenging. Growth assays using hemoglobin as a sole iron source are complicated by the instability of commercially available hemoglobin, contaminating free iron in the growth medium, and toxicity associated with iron chelators. Here we present a method that overcomes these limitations. High quality hemoglobin is prepared from fresh blood and is stored in liquid nitrogen. Purified hemoglobin is supplemented into iron-deplete medium mimicking the iron-poor environment encountered by pathogens inside the vertebrate host. By starving S. aureus of free iron and supplementing with a minimally manipulated form of hemoglobin we induce growth in a manner that is entirely dependent on the ability to bind hemoglobin, extract heme, pass heme through the bacterial cell envelope and degrade heme in the cytoplasm. This assay will be useful for researchers seeking to elucidate the mechanisms of hemoglobin-/heme-derived iron acquisition in S. aureus and possibly other bacterial pathogens.

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Here we describe a growth assay for Staphylococcus aureus using hemoglobin as the sole source of available nutrient iron. This assay establishes the role of bacterial factors involved in hemoglobin-derived iron acquisition.

צמיחת סטפילוקוקוס אוראוס באמצעות ההמוגלובין אנושי כמקור ברזל

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and clonal strain relatedness of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), particularly with the emerging outbreaks of community-associated MRSA (CA-MRSA) occurring on a worldwide basis. Traditional PCR typing schemes classify SCCmec by targeting and identifying the individual mec and ccr gene complex types, but require the use of many primer sets and multiple individual PCR experiments. We designed and published a simple multiplex PCR assay for quick-screening of major SCCmec types and subtypes I to V, and later updated it as new sequence information became available. This simple assay targets individual SCCmec types in a single reaction, is easy to interpret and has been extensively used worldwide. However, due to the sophisticated nature of the assay and the large number of primers present in the reaction, there is the potential for difficulties while adapting this assay to individual laboratories. To facilitate the process of establishing a MRSA SCCmec assay, here we demonstrate how to set up our multiplex PCR assay, and discuss some of the vital steps and procedural nuances that make it successful.

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

We demonstrate a simple multiplex PCR assay for quick-screening and typing of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) types I-V for methicillin-resistant Staphylococcus aureus, and provide some of the vital steps and procedural nuances that make it successful for adapting this assay to individual laboratories.

Multiplex assay PCR ?????? ?? ???? Mec ???????? ???? Staphylococcal I ?V ?-methicillin<em&gt; ???????????</em

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

חקר אינטראקציות של<em&gt; סטפילוקוקוס</em&gt; עם נויטרופילים ידי cytometry זרימה מיקרוסקופית וזמן לשגות

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

genotyping של<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; על ידי ריבוזומלי Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, is refractory to rapid and lasting chemotherapy due to the presence of bacilli exhibiting phenotypic drug resistance. The charcoal agar resazurin assay (CARA) was developed as a tool to characterize active molecules discovered by high-throughput screening campaigns against replicating and non-replicating M. tuberculosis. Inclusion of activated charcoal in bacteriologic agar medium helps mitigate the impact of compound carry-over, and eliminates the requirement to pre-dilute cells prior to spotting on CARA microplates. After a 7-10 day incubation period at 37 &#176;C, the reduction of resazurin by mycobacterial microcolonies growing on the surface of CARA microplate wells permits semi-quantitative assessment of bacterial numbers via fluorometry. The CARA detects approximately a 2-3 log10 difference in bacterial numbers and predicts a minimal bactericidal concentration leading to &#8805;99% bacterial kill (MBC&#8805;99). The CARA helps determine whether a molecule is active on bacilli that are replicating, non-replicating, or both. Pilot experiments using the CARA facilitate the identification of which concentration of test agent and time of compound exposure require further evaluation by colony forming unit (CFU) assays. In addition, the CARA can predict if replicating actives are bactericidal or bacteriostatic.

The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.

ויזואליזציה של Assay Resazurin פחם אגר עבור וכמותיות, ספירת בינוני תפוקה של Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to antibiotics. Genomic studies reveal that S. aureus carries many virulence and resistance genes located in mobile genetic elements, suggesting that horizontal gene transfer (HGT) plays a critical role in S. aureus evolution. However, a full and detailed description of the methodology used to study HGT in S. aureus is still lacking, especially regarding natural transformation, which has been recently reported in this bacterium. This work describes three protocols that are useful for the in vitro investigation of HGT in S. aureus: conjugation, phage transduction, and natural transformation. To this aim, the cfr gene (chloramphenicol/florfenicol resistance), which confers the Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A (PhLOPSA)-resistance phenotype, was used. Understanding the mechanisms through which S. aureus transfers genetic materials to other strains is essential to comprehending the rapid acquisition of resistance and helps to clarify the modes of dissemination reported in surveillance programs or to further predict the spreading mode in the future.

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

We describe here three different protocols for the in vitro investigation of conjugation, transduction, and natural transformation in Staphylococcus aureus.

מתודולוגיה לחקר ההעברה האופקית ג&#39;ין<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...