אנו מודים למהנדסים ולסטודנטים במרכז פראונהופר לחדשנות בייצור. על העזרה בתכנון, עיבוד שבבי ואוטומציה של מערכת הניסוי, אנו מודים לאנדריאס פרינסן, הולגר וירז, דאג פוס, דיוויד צ'ארגין וד"ר סודונג שו. אנו מודים לג'וליה קקארץ, מלאני צימרמן, ניקו קרצמר, טים גאמבל, ג'וש ויאנואבה, מינורי שימיזו וקטרז'ינה קוליגה על העזרה בבדיקת פרוטוקולים ניסיוניים ואיסוף נתונים. אנו מכירים בד"ר אן א. קרפנטר ומארק-אנתוני בריי מפלטפורמת ההדמיה במכון ברוד של הרווארד ו-MIT לעזרה בפיתוח שגרת ניתוח התמונה ב- CellProfiler. הפרויקט המתואר נתמך בחלקו על ידי פרסים R21AI079474 ו 1R01AI101446 מהמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את השקפותיו הרשמיות של המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות או המכונים הלאומיים לבריאות. הפרויקט נתמך גם על ידי פראונהופר ארה"ב.

1. הפוך את שכבת PDMS (איור 1)
<ol><li>מערבבים במרץ PDMS וסוכן ריפוי ביחס של 10:1. כדי להסיר בועות, degas את התערובת צמיג בתא ואקום במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>בקנה מידה, יוצקים את PDMS לאט על תבנית האלומיניום. יוצקים מהמרכז ושומרים על התבנית מאוזנת. הקפד להשאיר את הפינים חשופים. להפסיק לשפוך פעם אחת משקל היעד מושגת. התבנית שלנו דורשת 4 גרם של PDMS ו 0.4 גרם של ריאגנט ריפוי.
</li>
	<li>מיישרים את התבנית בתוך תנור, ומרפאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. זמני ריפוי חלופיים הם 2 שעות ב 60 מעלות צלזיוס או 1 שעה ב 90 מעלות צלזיוס.
</li>
	<li>לנתח את שכבת PDMS נרפא לאורך קצה התבנית בזהירות לקלף אותו משטח עובש עם זוג מלקחיים. נקה את משטח התבנית עם 70% אתנול וקצה Q.</li>
</ol>2. להרכיב את תא הזרימה לפי איור 2
הרכבה סטנדרטית של PDMS עם מגלשות זכוכית נעשית באמצעות טיפול בפלזמת חמצן בשני המשטחים, המבטיח חיבור ללא דליפה בין PDMS ומגלשת זכוכית מיקרוסקופ. בפרוטוקול שהוצג, טיפול הפלזמה יהרוס את הציפוי הכימי במגלשת הזכוכית. לכן המגלשה אטומה בלחץ ולא פלזמה מטופלת.
<ol><li>מניחים את חלון הזכוכית בכיס תא הזרימה.</li>
	<li>הנח שקופית זכוכית מצופה מעל חלון הזכוכית בתוך הכיס של תא הזרימה כאשר הצד הפעיל למעלה, והנח את שכבת ה- PDMS עם ערוצים הפונים כלפי מטה מעליה. מקם את שקופית ה- PDMS באופן כזה שכניסות הערוצים יתיישרו עם חורי הכניסה בלוח המתכת. בעדינות לדחוף את האוויר מתוך בין השכבות.</li>
	<li>הפוך את מכלול שקופית הזכוכית/PDMS כך שה- PDMS יפונה לחלון הזכוכית. חפף את כניסות ערוץ PDMS עם חורי הכניסה בלוח המתכת.</li>
	<li>מניחים את לוחית הלחץ למעלה ומהדקים את הברגים.</li>
	<li>הנח את תא הזרימה המורכב מתחת למיקרוסקופ. הגדר את הגדלת המיקרוסקופ ל- 60X ויישר מראש את מיקומי הערוצים.</li>
</ol>3. הכן חיידקי שלב יומן
<ol><li>יום לפני הניסוי: לחסן 50 מ"ל של מרק מולר הינטון המכיל 2% NaCl (MH2) עם מושבת חיידקים. לנער ב 250 סל"ד לילה ב 37 מעלות צלזיוס. זן חיידקי אחד או שניים ניתן ללמוד בניסוי אחד עבור ההגדרה המתוארת.
</li>
	<li>לפני הניסוי: מערבבים 50 מיקרוליטר של תרבות חיידקים לילה לתוך 50 מ"ל של מדיה MH2. לנער ב 250 סל"ד במשך 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס כדי להבטיח את החיידקים נמצאים בשלב יומן.</li>
</ol>4. לחמם את רכיבי הפתרון הניסיוני לפחות 10 דקות לפני שהם נדרשים
<ol><li>להפשיר את הצבע הפלואורסצנטי (5 מ"מ מלאי) ו lysostaphin (10 מיקרוגרם / מיליליטר מלאי) בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מחממים את אבקת האוקסצילין לטמפרטורת החדר.</li>
</ol>5. להכין ולטעון את ההשעיה החיידקית
<ol><li>לאחר סיום תת-תרבות של 3 שעות: יש ליטול 10 מ"ל של תרבות חיידקים וצנטריפוגה ב-1,650 x גרם למשך 2 דקות.</li>
	<li>הסר את החיידקים supernatant ו resuspend ב 1 מ"ל של מדיה MH2 טרי.</li>
	<li>חבר אורך קצר של צינורות למזרק מנעול Luer 1 מ"ל. לשטוף את צינורות המזרק עם 1 מ"ל של מדיה. השאירו קצת מדיה בצינורות כדי למנוע בועות אוויר בעת ציור ההשעיה חיידקי.</li>
	<li>טען 0.7 מ"ל של חיידקים מסוג 1 לתוך המזרק. למלא שני ערוצים של תא הזרימה עם סוג חיידקים 1. צפה עבור הנוזל להופיע בצד השני של הערוץ לאחר ca. 150 μl. השקיפות של הערוץ משתנה כפי שהוא מלא חיידקים.
</li>
	<li>אם אתם מתנסים בסוגי חיידקים מרובים, חזרו על הליך הטעינה של חיידקים מסוג 2 לשני הערוצים הנותרים של תא הזרימה.</li>
	<li>מניחים את תא הזרימה בתוך האינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות כדי לאפשר התיישבות חיידקית והחזקה למשטח השקופית.</li>
</ol>6. להכין ולטעון את הפתרונות הניסיוניים
<ol><li>הכן 140 μl של 0.5 מ"מ פתרון צבע פלואורסצנטי על ידי ערבוב 14 μl של מלאי צבע פלואורסצנטי (5 mM) ו 126 μl של מדיה MH2.</li>
	<li>לדלל 10 מ"ג של אוקסצילין ב 40 מ"ל של מדיה MH2 כדי לקבל ריכוז סופי של 250 מיקרוגרם / מ"ל oxacillin.</li>
	<li>הכן 130 מ"ל של פתרון בקרה עם ריכוזים סופיים של 0.25 μM צבע פלואורסצנטי ו 0.7 ng/ml של lysostaphin. כדי לעשות זאת, לערבב 65 μl של צבע פלואורסצנטי (0.5 מ"מ), 9.12 μl של מלאי lysostaphin (10 מיקרוגרם / מיליליטר) ו 130 מ"ל של מדיה MH2.</li>
	<li>הכן 130 מ"ל של פתרון אנטיביוטי עם ריכוזים סופיים של צבע פלואורסצנטי 0.25 מיקרומטר, 0.7 ng/ml של lysostaphin, ו 50 מיקרוגרם / מיליליטר אוקסצילין. כדי לעשות זאת, לערבב 65 μl של צבע פלואורסצנטי (0.5 מ"מ), 9.12 μl של מלאי lysostaphin (10 מיקרוגרם / מיליליטר), 26 מ"ל של אוקסצילין (250 מיקרוגרם / מיליליטר) ו 104 מ"ל של מדיה MH2.</li>
	<li>ממלאים שני מזרקים 60 מ"ל עם פתרון בקרה ושני מזרקים 60 מ"ל עם פתרון אנטיביוטי. שמור על פתרונות עטופים בנייר אלומיניום כדי למנוע השפלה הנגרמת על ידי אור של ריאגנטים. למלא יתר על הים את המזרקים כדי להסביר את ההפסד עקב שטיפה של צינורות.
</li>
	<li>הסר בועות אוויר מהמזרקים על-ידי החלקה. חבר ומלא צינורות קלט לקצה עם הפתרון הניסיוני.</li>
	<li>הר מזרקים על המשאבה. מקם תחילה את המזרק עם הנפח הקטן ביותר ולאחר מכן נעל את מיקום הבוכנה. להתאים את שאר המזרקים על המשאבה, לסחוט את הבוכנות שלהם לפי הצורך.</li>
	<li>הגדר את מהירות המשאבה ל 1 מיליליטר / דקה ואת נפח המשאבה ל 60 מ"ל. לעשות סומק עם המשאבה עד זרם קבוע של נוזל נראה מכל המזרקים.</li>
</ol>7. הגדרת תא הזרימה מתחת למיקרוסקופ
<ol><li>הסירו את תא הזרימה מהצנטריפוגה והרכיבו אותו על במת המיקרוסקופ (איור 3).</li>
	<li>חבר צינורות קלט/פלט לכל אחד מתעלות תא הזרימה (פלט קלט/פלט אחד לערוץ). איסוף פלט לארבעה גורמים מכילים שונים מאפשר מדידה של אמצעי אחסון בודדים של פלט ערוץ.</li>
</ol>8. הפעל את הניסוי בן 60 הדקות
<ol><li>בדוק את העמדות החתונות מראש משלב 2.5. אם שדה התצוגה של המיקרוסקופ אינו ממורכז בערוץ ו/או נמצא מחוץ למוקד, התאם את ההגדרות ושמור את המיקומים החדשים. התמקדות מדויקת לא יכולה להיות אפשרית לפני תחילת הזרימה בשל הצפיפות הגבוהה של חיידקים טעונים.
</li>
	<li>הגדר את זמן הרכישה של ניגודיות הפאזה ל- 10 msec ואת זמן רכישת הפלואורסצנטיות ל- 1,600 msec.</li>
	<li>השג תמונות ניגודיות פאזה ופלואורסצנטיות עבור כל מיקום לפני התחלת הזרימה. זה נותן הערכה איכותית של צפיפות החיידקים הטעונים.
</li>
	<li>התחל את זרימת הנוזלים ומיד לבדוק כי המיקרוסקופ מתמקד בתחתית הערוצים.</li>
	<li>קח תמונות ניגודיות פאזה ופלואורסצנטיות של אזורי היעד בתוך הדקה הראשונה של הזרימה.</li>
	<li>רכוש תמונות כל 2 דקות לאחר קבוצת התמונות הראשונה עד שתתרחש זרימה של 60 דקות. התמקד מחדש לפי הצורך.</li>
</ol>9. לחטא את תא הזרימה
<ol><li>הפוך פתרון אקונומיקה 10% ב כיף (100 מ"ל). ממלאים 4 x 20 מ"ל מזרקים עם 10 מ"ל של התערובת. לרוקן את המזרקים ולחבר אותם לתא הזרימה. זה ייקח ~ 1-2 דקות עבור הערוצים כדי להיות ברור של חיידקים.
</li>
	<li>הגדר את מהירות המשאבה ל 1 מיליליטר / דקה ואת נפח המשאבה ל 3 מ"ל. לרוץ במשך 3 דקות.</li>
	<li>מלאו 4 x 60 מ"ל מזרקים עם 60 מ"ל של מים DI. לרוקן את המזרקים ולחבר אותם לתא הזרימה.</li>
	<li>הגדר את מהירות המשאבה ל 1 מיליליטר / דקה ואת נפח המשאבה ל 30 מ"ל. לרוץ במשך 30 דקות.</li>
	<li>לפקח על ניקוי הערוצים מתחת למיקרוסקופ.</li>
	<li>לפרק את תא הזרימה. בטל את שקופית האפוקסי הנמצאת בשימוש. משרים את רכיבי תא הזרימה במים DI במשך 20 דקות.</li>
</ol>10. לנתח תמונות וליצור נתונים
<ol><li>ספור את מספר החיידקים בכל תמונה. תוכנת הגישה הפתוחה, CellProfiler משמשת לביצוע עיבוד תמונתאצווה 16. חלוקה לרמות גבוהה של רוטינות CellProfiler מסוכמת בטבלה 1. מספר החיידקים הנמצאים בתמונת ניגודיות הפאזה (Np)נותן את ספירת החיידקים הכוללת. מספר החיידקים הנראים בתמונת הפלואורסצנטיות (Nf)נותן את מספר החיידקים המתים.
</li>
	<li>לחשב את אחוז התמותה של תאי חיידקים מנורמלים כפונקציה של זמן.<ol>
<li>יבא Nf ו- Np עבור תמונות בודדות לתוכנת ניתוח הנתונים.</li>
		<li>לחשב את השבר של חיידקים מתים בכל ערוץ בנקודת זמן ספציפית שניתנה על ידי השבר (Nf / Np) ב t = T.</li>
		<li>הפחת את שבר החיידקים המתים הנמצאים בתחילת הניסוי (t = 1 min) הן עבור הבקרה והן עבור ערוצי הניסוי.</li>
		<li>הפחת את השבר של חיידקים מתים הנמצאים בערוץ הבקרה מזה שנמצא בערוץ הניסוי בכל נקודת זמן עם המשוואה הבאה: <img alt="Data Analysis Equation" fo:content-width="6in" height="217" src="/files/ftp_upload/50828/Data_analysis_equation.png" width="620">
</li>
		 <li>גרף DP נורמה לעומת t במהלך הניסוי. שים לב כי מדגם עם אחוז מוות של תא גדול מ 1% נחשב רגישים, בעוד פחות מ 0.5% מוות מעיד על התנגדות. אחוזים הנכללים בין שני ניתוקים אלה נחשבים לא מוגדרים ויש לבדוק שוב את המדגם.
</li>
		<li>השתמש בגיליון אלקטרוני כדי לסכם ולנתח תוצאות מניסויים שונים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mairhofer, J., Roppert, K., Ertl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+systems+for+pathogen+sensing:+a+review.">Microfluidic systems for pathogen sensing: a review.</a> Sensors. 9, 4804-4823 (2009).</li><li>Yager, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+diagnostic+technologies+for+global+public+health.">Microfluidic diagnostic technologies for global public health.</a> Nature. 442, 412-418 (2006).</li><li>Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+bacteria+and+determining+their+susceptibility+to+antibiotics+by+stochastic+confinement+in+nanoliter+droplets+using+plug-based+microfluidics.">Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+toxicological+complexity+by+multi-dimensional+screenings+in+microsegmented+flow:+modulation+of+antibiotic+interference+by+nanoparticles.">Uncovering toxicological complexity by multi-dimensional screenings in microsegmented flow: modulation of antibiotic interference by nanoparticles.</a> Lab Chip. 12, 474-484 (2012).</li><li>Chen, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+susceptibility+testing+using+high+surface-to-volume+ratio+microchannels.">Antimicrobial susceptibility testing using high surface-to-volume ratio microchannels.</a> Anal. Chem. 82, 1012-1019 (2010).</li><li>Churski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+screening+of+antibiotic+toxicity+in+an+automated+microdroplet+system.">Rapid screening of antibiotic toxicity in an automated microdroplet system.</a> Lab Chip. 12, 1629-1637 (2012).</li><li>Eun, Y. J., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulating+bacteria+in+agarose+microparticles+using+microfluidics+for+high-throughput+cell+analysis+and+isolation.">Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation.</a> ACS Chem. Biol. 6, 260-266 (2011).</li><li>Kim, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+monitoring+of+antibiotic+susceptibility+of+bacterial+biofilms+in+a+microfluidic+device.">In situ monitoring of antibiotic susceptibility of bacterial biofilms in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 10, 3296-3299 (2010).</li><li>Peitz, I., van Leeuwen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+bacteria+growth+monitoring+by+automated+DEP-facilitated+image+analysis.">Single-cell bacteria growth monitoring by automated DEP-facilitated image analysis.</a> Lab Chip. 10, 2944-2951 (2010).</li><li>Kalashnikov, M., Lee, J. C., Campbell, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+rapid,+stress-induced+antibiotic+susceptibility+testing+of+Staphylococcus+aureus.">A microfluidic platform for rapid, stress-induced antibiotic susceptibility testing of Staphylococcus aureus.</a> Lab Chip. 12, 4523-4532 (2012).</li><li>McDonald, J. C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(dimethylsiloxane)+as+a+material+for+fabricating+microfluidic+devices.">Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices.</a> Acc. Chem. Res. 35, 491-499 (2002).</li><li>Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+viability+and+antibiotic+susceptibility+testing+with+SYTOX+green+nucleic+acid+stain.">Bacterial viability and antibiotic susceptibility testing with SYTOX green nucleic acid stain.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 2421-2431 (1997).</li><li>Francius, G., Domenech, O., Mingeot-Leclercq, M. P., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+Staphylococcus+aureus+cell+wall+digestion+by+lysostaphin.">Direct observation of Staphylococcus aureus cell wall digestion by lysostaphin.</a> J. Bacteriol. 190, 7904-7909 (2008).</li><li>Jordan, S., Hutchings, M. I., Mascher, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+envelope+stress+response+in+Gram-positive+bacteria.">Cell envelope stress response in Gram-positive bacteria.</a> FEMS Microbiol. Rev. 32, 107-146 (2008).</li><li>Koch, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+wall+as+target+for+attack:+past,+present,+and+future+research.">Bacterial wall as target for attack: past, present, and future research.</a> Clin. Microbiol. Rev. 16, 673-687 (2003).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+antibiotics+kill+bacteria:+from+targets+to+networks.">How antibiotics kill bacteria: from targets to networks.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 423-435 (2010).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Hayete, B., Lawrence, C. A., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+mechanism+of+cellular+death+induced+by+bactericidal+antibiotics.">A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics.</a> Cell. 130, 797-810 (2007).</li></ol>

השיטה המיקרופלואידית תלויה ועומדת: סאוור-באדג' A, שרון א', קלצ'ניקוב ז, וירז H, ממציאים; שיטה ומכשיר לגילוי מהיר של עמידות לאנטיביוטיקה חיידקית/פטנט רגישות PCT/US10/33523.

הפרוטוקול שהוצג אומת ואופטימיזציה בסדרה של ניסויים עם זני סטפילוקוקוס אוראוס רגישים למתיצילין ועמידים במתיצילין10. לכן, פרוטוקול זה ללא שינוי צריך להיות ישים ישירות זנים אחרים של S. aureus ואנטיביוטיקה אחרים עם מנגנונים של פעולה המשפיעים על ביוסינתזה של דופן התא החיידקי. סוגי...

עליית ההתנגדות החיידקית מגבירה את הצורך בבדיקות רגישות אנטיביוטיות מבוססות פנוטיפ מהירות על מנת להגן על התרופות שלנו של המוצא האחרון. בדיקות רגישות סטנדרטיות מבוססות על עיכוב גדילה חיידקית בנוכחות אנטיביוטיקה שלוקח כמה (8-24) שעות כדי להשלים. פיתחנו בדיקת רגישות אנטיביוטית חדשנית על פלטפורמה מיקרופלואידית המסתמכת על הפעלת מתח של מסלולים ביוסינתטיים כדי להאיץ את פעולת האנטיביוטיקה.
בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה בקנה מידה microfluidic לשאת את היתרון של שימוש יעיל מדגם, שכן הם דורשים מספר קטן של חיידקים. בנוסף, התקנים microfluidic ניתן multiplexed על מנת לבדוק דגימות מרובות בתנאים מרובים1,2. לאחרונה, מספר שיטות microfluidic עבור בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה דווחו3-9. בשיטות אלה, חיידקים גדלים בתוך טיפות ננו ופיקוליטר3,7, בנפח המלא של הערוץ המיקרופלואידי4-6,8, או כמו חיידקים בודדים מקומיים חשמלית על פני השטח התחתון שלהערוץ 9. למרות בדיקות אלה מתבצעות בערוצים microfluidic, כולם לפקח על צמיחה מיקרוביאלית בנוכחות והיעדר אנטיביוטיקה דומה לשיטות מסורתיות. מדידות צמיחה מתבצעות באמצעות צפיפות אופטית, צבעים רגישים ל- pH או תמונות ניגודיות או פלואורסצנטיות בהירות של שדה/פאזה. למרות שחלק מבדיקות אלה מהירות יותר משיטות מסורתיות, כל אחת מהן מזהה באופן פסיבי עמידות לאנטיביוטיקה. במילים אחרות, שיטות אלה עדיין דורשות מהמשתמש לחכות לצמיחת חיידקים כמו הקריאה הסופית.
לעומת זאת, פיתחנו שיטה המשתמשת בשילוב של גזירה ומתח אנזימטי כדי להפעיל מסלולים ביוכימיים רגישים לאנטיביוטיקה10. קריאת תיגר על החיידקים הדגיש עם אנטיביוטיקה אלה יוצרת בדיקת רגישות מהירה יותר. חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה מסוגלים לעמוד בתנאים מלחיצים. חיידקים רגישים, לעומת זאת, נהרגים במהירות על ידי הלחצים המשולבים. אחוז המוות של תאים לאחר שעה אחת, הנמדד על ידי מיקרוסקופיה באמצעות כתם תא מת פלואורסצנטי, מגדיר את הפנוטיפ של החיידקים (עמיד לעומת רגיש).
ליישום מוצלח של השיטה שלנו, חיידקים חייבים להיות משותקים על המשטח התחתון של הערוץ המיקרופלואידי. בדרך זו, חיידקים יכולים להיות נתונים ללחצים שונים ובמקביל להדמית תחת מיקרוסקופ במישור אחד. שקופית זכוכית מיקרוסקופ מצופה משמשת לשיתוק חיידקים. השקופית היא precoated על ידי היצרן עם קבוצות אפוקסיד עבור מחייב חלבון לא ספציפי. הכריכה הלא ספציפית של אפוקסידים אלה לחלבוני פני השטח החיידקיים מחברת את החיידקים למשטח השקופית.
זנים נבדקים בתנאים זהים (גזירה + מתח אנזימטי) בהיעדר (שליטה) ונוכחות (ניסוי) של אנטיביוטיקה. תמונות מיקרוסקופ של ניגודיות פאזה ופלואורסצנטיות של כל ערוץ נלקחות באופן אוטומטי כל שתי דקות למשך שעה אחת. כינויי התנגדות נעשים לאחר מכן על ידי השוואת אחוז החיידקים המתים בערוץ הניסוי לאלה הנמצאים בערוץ הבקרה. לאחר שעה אחת, מדגם עם אחוז מוות של תא גדול מ -1% נחשב רגיש, בעוד פחות מ 0.5% מוות מעיד על התנגדות. אחוזים הנכללים בין שני ניתוקים אלה נחשבים לא מוגדרים ויש לבדוק שוב את המדגם.
ערוצים מיקרופלואידיים מוגדרים ב- PDMS, שהוא חומר המועדף על מכשירים מיקרופלואידיים11. PDMS שקוף אופטית במגוון רחב של אורכי גל, תואמים ביולוגית, אינרטיים, חדירים לגזים ויש לו חדירות נמוכה לנוזלים; לכן הוא מתאים היטב לניסויים אלה.
מתח מכני/גזירה נוצר על ידי זרימת מדיית טמפרטורת החדר על פני החיידקים משותקים. (הערה: התחממות המדיה ל 37 °C (69 °F) אין השפעה משמעותית על תוצאת התסעפות.) משאבות מזרק אוטומטיות מאלצות מדיה (המכילה כתם תא מת +/- אנטיביוטי, כמו גם גורמי לחץ אנזימטיים אופציונליים) דרך הערוצים המיקרופלואידיים (200 מיקרומטר x 400 מיקרומטר) בקצב זרימה של 1 מ"ל / דקה כדי לתת 6.25 kPa של כוח גזירה או קצב גזירה של 6,000 שניות-1. שיעור זה שווה או עולה על הלחצים גזירה שנחקרו בעבר על Staphylococci.
האנזים, lysostaphin, נבחר לניסויים ראשוניים כי זה גורם נזק ישיר לקיר התא סטפילוקוקוס. הריכוז של lysostaphin (0.7 ng/ml) הספיק כדי לגרום נזק לקיר התא החיידקי, אך לא מספיק כדי לגרום למוות של תאים חיידקיים ללא אנטיביוטיקה במסגרת הזמן של הניסוי. Lysostaphin אינו נדרש לייעוד הנכון של רגישות חיידקית אבל זה להגדיל את התוצאה, המוביל מוות תאי מוגבר זנים רגישים. לעומת זאת, לחץ גזירה הוא קריטי לתפקוד מבחנים. כאשר זני סטפילוקוקוס אוראוס רגישים למתיצילין מטופלים בליזוזאפין ובאוקסצילין בהעדר זרימה, לא נרשם מוות תאי במהלך הניסוי.
הכדאיות של התא מנוטרת עם כתם תא מת פלואורסצנטי12. בחירת הצבע התבססה על יכולתו להכתים באופן סלקטיבי רק תאים פגומים, על אי-ציותו לתאים חיים ועל פלואורסצנטיות הרקע הנמוכה שלו, שאפשרה את הוספתו הישירה למדיית התאים ללא צעדים נוספים. הבחירה של ריכוז צבע פלואורסצנטי של 0.25 מיקרומטר הייתה להשיג רמות אות מקובלות במהלך זמן חשיפה של 1.6 שניות לאור עירור פלואורסצנטי.
הבטא-לקטם, אוקסצילין, שימש במחקרים הראשוניים שלנו. מינים עמידים בפני מתיצילין S. aureus (MRSA) עמידים בפני אוקסצילין ולא יראו מוות תאי ניכר במסגרת הזמן של הניסוי. הריכוז של 50 מיקרוגרם / מיליליטר נקבע במחקרים הראשוניים. ריכוזים נמוכים יותר של אנטיביוטיקה נתנו פחות הפרדה בין זנים עמידים רגישים, בעוד ריכוזים גבוהים יותר לא גרמו להבדל ניכר בתוצאות הניסוי.
דיווחנו בעבר על פיתוח מוצלח של בדיקה המשלבת לחצים מכניים ואנזימטיים המשפיעים ישירות על דופן התא החיידקי13 עם אנטיביוטיקה המעכבת את הביוסינתזה של דופן התא14,15. ניסויים אלה הוכחת העיקרון בוצעו על פאנל של MRSA ומתיצילין רגיש S. aureus (MSSA). עם זאת, עם הבחירה של פרמטרים ניסיוניים נאותים, השיטה שלנו צריכה להיות ישימה על מינים מרובים של חיידקים ומחלקות מרובות של אנטיביוטיקה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">SYTOX Green</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Invitrogen Corporation</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">S7020</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Dead cell fluorescence stain</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrich, Inc</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">A9418-5G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Used for lysostaphin storage</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Sodium Acetate</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrich, Inc</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">S8750-500G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Used for lysostaphin storage</td>
		</tr>
		<tr height="98">
			<td dir="LTR" height="98" style="height:98px;width:195px;">Lysostaphin&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Cell Sciences</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">CRL309A</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Arrives as 1 mg solid. For storage: Dissolve in 20 mM sodium acetate. Mix with BSA solution to final concentration of 1% BSA and 100 &#181;g/ml &#160;lysostaphin for storage&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Oxacillin salt</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrich, Inc</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">28221-1G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Mueller Hinton Broth</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">DF0757-17-6</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrixh</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">S3014-500G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">2% added to Mueller-Hilton broth prior to autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:195px;">1 ml, Luer-lock syringe&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">BD (Beckton, Dickinson and Comp.)</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">14-823-2F</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:195px;">2 oz, Luer-lock syringe</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">BD (Beckton, Dickinson and Comp.)</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">309653 - 60 mL</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Overfill to ~65 ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Microscope</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Cambridge Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">9349</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">60X, Fluorescence/Phase contrast objective</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Olympus Corp.</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">LCPlan F1 60x/0.70 Ph2</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Retiga 12-bit monochrome CCD camera</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">QImaging</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">RET-4000R-F-M-12-C&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Microscope automation</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Shutters phase contrast/fluorescence</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H204/H202</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">X/Y Stage&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H107AENN</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Focus motor</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H122</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Joystick for XYZ control</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">CS152EF</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Proscan Controller</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H3-XY2</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Image Acquisition Software</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Flow Cell Assembly and PDMS</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Flow Cell</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1044</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Engineering drawings were produced by Fraunhofer CMI</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td dir="LTR" height="33" style="height:33px;width:329px;">Glass window</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1054</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:269px;">Glass window was cut to the proper size at Fraunhofer CMI</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td dir="LTR" height="33" style="height:33px;width:329px;">BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Edmund Optics Inc.</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">NT48-543</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td dir="LTR" height="50" style="height:50px;width:329px;">Sealing plate</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">BU Scientific Instruments Facility</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1045</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Epoxide glass slide</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Arrayit Corporation</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">SuperEpoxy 2</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td dir="LTR" height="45" style="height:45px;width:329px;">PDMS master</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1053</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Master machined in aluminum or brass with UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine)</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">PDMS slide design</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1053</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Tubing</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td dir="LTR" height="50" style="height:50px;width:329px;">Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16 in, PEEK, green&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">M-644-03</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Flow cell inputs/outputs are tapped for this ferrule</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS lock ring, black</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">M-657</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">P-255</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), yellow</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">P-259</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Fits Luer-lock adapter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Tubing, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, green&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">1520G</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Adapter, quick connect female Luer to female 1/4-28, PEEK, red&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">P-658</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stress-induced antibiotic susceptibility testing on a chip

פיתחנו שיטה מיקרופלואידית מהירה לבדיקות רגישות לאנטיביוטיקה בסביבה מבוססת מתח. נוזל מועבר במהירויות גבוהות על חיידקים משותקים בתחתית ערוץ מיקרופלואידי. בנוכחות מתח ואנטיביוטיקה, זנים רגישים של חיידקים מתים במהירות. עם זאת, חיידקים עמידים לשרוד אלה תנאים מלחיצים. ההשערה מאחורי שיטה זו היא חדשה: הפעלת מתח של מסלולים ביוכימיים, שהם מטרות של אנטיביוטיקה, יכול להאיץ בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה. בהשוואה לשיטות סטנדרטיות לבדיקת רגישות לאנטיביוטיקה, הצעד המגביל את הקצב - צמיחת חיידקים - מושמט במהלך יישום אנטיביוטי. היישום הטכני של השיטה הוא בשילוב של טכניקות סטנדרטיות וגישות חדשניות. החלקים הסטנדרטיים של השיטה כוללים פרוטוקולי תרבות חיידקים, הגדרת ערוצים מיקרופלואידיים בפולידימתילסילוקסן (PDMS), ניטור כדאיות התא עם פלואורסצנטיות ועיבוד תמונת אצווה לספירת חיידקים. חלקים חדשניים של השיטה נמצאים בשימוש בזרימת מדיה תרבותית ליישום מתח מכני, שימוש באנזימים לנזק אך לא להרוג את החיידקים, ושימוש במצעים microarray עבור התקשרות חיידקית. הפלטפורמה המפותחת יכולה לשמש בפיתוח ובדיקות של תרופות אנטיביוטיות ולא אנטיביוטיות. בהשוואה לניסויים הסטנדרטיים בהשעיית חיידקים, ניתן להדליק ולכבות את השפעת התרופה שוב ושוב על פני תקופות זמן מבוקרות. התבוננות חוזרת ונשנית באותה אוכלוסיית חיידקים אפשרית במהלך אותו ניסוי.

הנתונים המוצגים באיור 4 מראים את התגובה של זן סטפילוקוקוס אוראוס רגיש לאורך זמן בערוץ מיקרופלואידי המכיל אנטיביוטיקה. תמונות ניגודיות פאזה שנרכשו בשעה ובסוף הניסוי של שעה מוצגות באיורים 4A ו- B. הנתונים המנותחים של שעה מוצגים באיור 4C כאשר החיי...

Watch this Scientific Journal Video about Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip at JoVE.com

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

פיתחנו פלטפורמה מיקרופלואידית לבדיקות רגישות לאנטיביוטיקה במהירות. נוזל מועבר במהירויות גבוהות על חיידקים משותקים בתחתית ערוץ מיקרופלואידי. בנוכחות מתח ואנטיביוטיקה, זנים רגישים של חיידקים מתים במהירות. עם זאת, חיידקים עמידים יכולים לשרוד את התנאים מלחיצים אלה.

בדיקת רגישות אנטיביוטית הנגרמת על ידי מתח על שבב

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

stress-induced-antibiotic-susceptibility-testing-on-a-chip

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.3K Views.  Fraunhofer USA Center for Manufacturing Innovation. פיתחנו פלטפורמה מיקרופלואידית לבדיקות רגישות לאנטיביוטיקה במהירות. נוזל מועבר במהירויות גבוהות על חיידקים משותקים בתחתית ערוץ מיקרופלואידי. בנוכחות מתח ואנטיביוטיקה, זנים רגישים של חיידקים מתים במהירות. עם זאת, חיידקים עמידים יכולים לשרוד את התנאים מלחיצים א...

Video: Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

Lensless Fluorescent Microscopy on a Chip

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for high-throughput screening applications. This emerging technology platform has the potential to eliminate the need for bulky and/or costly optical components through the help of novel theories and digital reconstruction algorithms. Along the same lines, here we demonstrate an on-chip fluorescent microscopy modality that can achieve e.g., &lt;4&mu;m spatial resolution over an ultra-wide field-of-view (FOV) of &gt;0.6-8 cm2 without the use of any lenses, mechanical-scanning or thin-film based interference filters. In this technique, fluorescent excitation is achieved through a prism or hemispherical-glass interface illuminated by an incoherent source. After interacting with the entire object volume, this excitation light is rejected by total-internal-reflection (TIR) process that is occurring at the bottom of the sample micro-fluidic chip. The fluorescent emission from the excited objects is then collected by a fiber-optic faceplate or a taper and is delivered to an optoelectronic sensor array such as a charge-coupled-device (CCD). By using a compressive-sampling based decoding algorithm, the acquired lensfree raw fluorescent images of the sample can be rapidly processed to yield e.g., &lt;4&mu;m resolution over an FOV of &gt;0.6-8 cm2. Moreover, vertically stacked micro-channels that are separated by e.g., 50-100 &mu;m can also be successfully imaged using the same lensfree on-chip microscopy platform, which further increases the overall throughput of this modality. This compact on-chip fluorescent imaging platform, with a rapid compressive decoder behind it, could be rather valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

A lensless on-chip fluorescent microscopy platform is demonstrated that can image fluorescent objects over an ultra-wide field-of-view of e.g., &#62;0.6-8 cm2 with &#60;4&#956;m resolution using a compressive sampling based decoding algorithm. Such a compact and wide-field fluorescent on-chip imaging modality could be valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

פלורסנט מיקרוסקופית עצמים ללא עדשה על שבב

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for ...

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial dysfunction. However, early functional changes in endothelium that signify an individual's level of risk are not directly assessed clinically to help guide therapeutic strategy. Moreover, the regulation of inflammation by local hemodynamics contributes to the non-random spatial distribution of atherosclerosis, but the mechanisms are difficult to delineate in vivo. We describe a lab-on-a-chip based approach to quantitatively assay metabolic perturbation of inflammatory events in human endothelial cells (EC) and monocytes under precise flow conditions. Standard methods of soft lithography are used to microfabricate vascular mimetic microfluidic chambers (VMMC), which are bound directly to cultured EC monolayers.1 These devices have the advantage of using small volumes of reagents while providing a platform for directly imaging the inflammatory events at the membrane of EC exposed to a well-defined shear field. We have successfully applied these devices to investigate cytokine-,2 lipid-3, 4 and RAGE-induced5 inflammation in human aortic EC (HAEC). Here we document the use of the VMMC to assay monocytic cell (THP-1) rolling and arrest on HAEC monolayers that are conditioned under differential shear characteristics and activated by the inflammatory cytokine TNF-&alpha;. Studies such as these are providing mechanistic insight into atherosusceptibility under metabolic risk factors.

Microfluidic flow chambers etched by photolithography and fabricated from PDMS are applied to probe functional outcomes associated with EC dysfunction and inflammation. In a representative experiment, the ability of differential shear stress to modulate monocytic cell adhesion to cytokine activated EC monolayers is demonstrated.

על שבב phenotyping דלקתיות האנדותל

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, and observation and quantification are very challenging. However, conventional in vitro microvessel assays have limitations when representing in vivo microvessels with respect to three-dimensional (3D) geometry and providing continuous fluid flow. Using a combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics, we have developed a multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip, which mimics the 3D geometry of in vivo microvessels and runs under controlled continuous perfusion flow. A positive reflowable photoresist was used to fabricate a master mold with a semicircular cross-sectional microchannel network. By the alignment and bonding of the two polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated from the master mold, a cylindrical microchannel network was created. The diameters of the microchannels can be well controlled. In addition, primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) seeded inside the chip showed that the cells lined the inner surface of the microchannels under controlled perfusion lasting for a time period between 4 days to 2 weeks.

A microchannels-on-a-chip platform was developed by the combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics. The endothelialized microchannels platform mimics the three-dimensional (3D) geometry of in vivo microvessels, runs under controlled continuous perfusion flow, allows for high-quality and real-time imaging&#160;and can be applied for microvascular research.

הליך הפיתוח של Multi-עגול עומק חתך Endothelialized microchannels-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP על שבב: מחקר ללא תווית של אינטראקציות חלבון- phosphoinositide

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

פלטפורמה מבוססת Photoresist ביוסנסור אלקטרוכימי Microfluidic הסרט יבש: ייצור המכשיר, הכנה על שבב Assay, ותפעול המערכת

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

ייצור ואימות מערכת איברים על שבב עם אלקטרודות משולבת ישירות לכמת התנגדות חשמלית Transendothelial

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical environment. During this process, mechanosensitive osteocytes regulate the opposing responses between the catabolic osteoclasts and anabolic osteoblasts. To better understand the highly intricate signaling pathways that regulate this process, our lab has developed a foundationary lab-on-a-chip (LOC) platform for analyzing functional outcomes (formation and resorption) of bone remodeling within a small scale system. As bone remodeling is a lengthy process that occurs on the order of weeks to months, we developed long-term cell culturing protocols within the system. Osteoblasts and osteoclasts were grown on functional activity substrates within the LOC and maintained for up to seven weeks. Afterward, chips were disassembled to allow for the quantification of bone formation and resorption. Additionally, we have designed a 3D printed mechanical loading device that pairs with the LOC platform and can be used to induce osteocyte mechanotransduction by deforming the cellular matrix. We have optimized cell culturing protocols for osteocytes, osteoblasts, and osteoclasts within the LOC platform and have addressed concerns of sterility and cytotoxicity. Here, we present the protocols for fabricating and sterilizing the LOC, seeding cells on functional substrates, inducing mechanical load, and disassembling the LOC to quantify endpoint results. We believe that these techniques lay the groundwork for developing a true organ-on-a-chip for bone remodeling.

Here, we present protocols for analyzing bone remodeling within a lab-on-a-chip platform. A 3D printed mechanical loading device can be paired with the platform to induce osteocyte mechanostransduction by deforming the cellular matrix. The platform can also be used to quantify bone remodeling functional outcomes from osteoclasts and osteoblasts (resorption/formation).

פלטפורמת מעבדה על שבב לעירור מכניציט וניתוח תוצאות פונקציונליות של שיפוץ עצם

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical ...

3D Cell-Printed Hypoxic Cancer-on-a-Chip for Recapitulating Pathologic Progression of Solid Cancer

Cancer microenvironment has a significant impact on the progression of the disease. In particular, hypoxia is the key driver of cancer survival, invasion, and chemoresistance. Although several in vitro models have been developed to study hypoxia-related cancer pathology, the complex interplay of the cancer microenvironment observed&#160;in vivo has not been reproduced yet owing to the lack of precise spatial control. Instead, 3D biofabrication approaches have been proposed to create microphysiological systems for better emulation of cancer ecology and accurate anticancer treatment evaluation. Herein, we propose a 3D cell-printing approach to fabricate a hypoxic cancer-on-a-chip. The hypoxia-inducing components in the chip were determined based on a computer simulation of the oxygen distribution. Cancer-stroma concentric rings were printed using bioinks containing glioblastoma cells and endothelial cells to recapitulate a type of solid cancer. The resulting chip realized central hypoxia and aggravated malignancy in cancer with the formation of representative pathophysiological markers. Overall, the proposed approach for creating a solid-cancer-mimetic microphysiological system is expected to bridge the gap between in vivo and in vitro models for cancer research.

Hypoxia is a hallmark of tumor microenvironment and plays a crucial role in cancer progression. This article describes the fabrication process of a hypoxic cancer-on-a-chip based on 3D cell-printing technology to recapitulate a hypoxia-related pathology of cancer.

3D תא מודפס סרטן היפוקסי על שבב עבור recapitulating התקדמות פתולוגית של סרטן מוצק

Cancer microenvironment has a significant impact on the progression of the disease. In particular, hypoxia is the key driver of cancer survival, invasion, ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of concept, a simplified and undifferentiated human skin containing a dermal (stromal) and an epidermal (epithelial) compartment has been modelled. To accomplish this, a versatile and robust, vinyl-based device divided into two chambers has been developed, overcoming some of the drawbacks present in microfluidic devices based on polydimethylsiloxane (PDMS) for biomedical applications, such as the use of expensive and specialized equipment or the absorption of small, hydrophobic molecules and proteins. Moreover, a new method based on parallel flow was developed, enabling the in situ deposition of both the dermal and epidermal compartments. The skin construct consists of a fibrin matrix containing human primary fibroblasts and a monolayer of immortalized keratinocytes seeded on top, which is subsequently maintained under dynamic culture conditions. This new microfluidic platform opens the possibility to model human skin diseases and extrapolate the method to generate other complex tissues.

Here, we present a protocol to generate a three-dimensional simplified and undifferentiated skin model using a micromachined microfluidic platform. A parallel flow approach allows the in situ deposition of a dermal compartment for the seeding of epithelial cells on top, all controlled by syringe pumps.

יצירת דגם תלת מימדי תלת מימדי של עור על שבב בפלטפורמה מיקרופלואידית מיקרו-מכונות

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target joint disorders are mostly palliative. The unmet need for effective disease-modifying OA drugs (DMOADs) has been primarily caused by the absence of appropriate models for studying the disease mechanisms and testing potential DMOADs. Herein, we describe the establishment of a miniature synovial joint-mimicking microphysiological system (miniJoint) comprising adipose, fibrous, and osteochondral tissue components derived from human mesenchymal stem cells (MSCs). To obtain the three-dimensional (3D) microtissues, MSCs were encapsulated in photocrosslinkable methacrylated gelatin before or following differentiation. The cell-laden tissue constructs were then integrated into a 3D-printed bioreactor, forming the miniJoint. Separate flows of osteogenic, fibrogenic, and adipogenic media were introduced to maintain the respective tissue phenotypes. A commonly shared stream was perfused through the cartilage, synovial, and adipose tissues to enable tissue crosstalk. This flow pattern allows the induction of perturbations in one or more of the tissue components for mechanistic studies. Furthermore, potential DMOADs can be tested via either &#34;systemic administration&#34; through all the medium streams or &#34;intraarticular administration&#34; by adding the drugs to only the shared &#34;synovial fluid&#34;-simulating flow. Thus, the miniJoint can serve as a versatile in vitro platform for efficiently studying disease mechanisms and testing drugs in personalized medicine.

We provide detailed methods for generating four types of tissues from human mesenchymal stem cells, which are used to recapitulate the cartilage, bone, fat pad, and synovium in the human knee joint. These four tissues are integrated into a customized bioreactor and connected through microfluidics, thus generating a knee joint-on-a-chip.

יצירת מפרק ברך על שבב למידול מחלות מפרקים ובדיקת תרופות

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...