פרוטוקול זה במבחנה, המבוסס על 96 צלחות היטב, יכול לשמש לבדיקת ההשפעה המעכבת של נוגדנים על חומרים אנטי-פטרייתיים חדשים על הפעילות המטבולית של תאים פטרייתיים בביופילמים של קנדידה. בהשוואה לשיטות אחרות, זוהי טכניקה רגישה מאוד, מדויקת, בעלת תפוקה גבוהה, ניתנת לשחזור, ידידותית למשתמש וחסכונית להערכת ההשפעה של נוגדנים או אנטי פטרייתיים על התפתחות ביופילמים של קנדידה. בדיקה זו יכולה לשמש להערכת היעילות של טיפולים חדשניים מבוססי תרופות או נוגדנים, כמו גם מועמדים לחיסון נגד ביופילמים של קנדידה, הקשורים לחומרת קנדידה פולשנית.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת לבדיקת ההשפעה של חומרים אנטי פטרייתיים חדשים או נוגדנים במהלך היווצרות ביופילם או התבגרות במסגרות שונות באמצעות זנים פטרייתיים שונים או מקורות נוגדנים. מי שידגים את ההליך הזה יהיה מר פנקאג' צ'נדלי, חוקר דוקטור שעובד במעבדה שלי. כדי להתחיל, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של תרבית קנדידה טרופיקליס לצלחת מיקרוטיטר של 96 בארות.
באמצעות פיפטה רב ערוצית, מלא את שני העמודים האחרונים עם 100 מיקרוליטר של RPMI 1640 MOPS בינוני לבד. מכסים את צלחת המיקרוטיטר במכסה ובנייר אלומיניום ודוגרים את הצלחת למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתנאים נייחים. למחרת, לשאוף את המדיום בזהירות באמצעות פיפטה רב ערוצית.
הפוך את הצלחת בעדינות על יריעות הכתמה והקש כדי להסיר את שאריות המדיום. לשטוף את הצלחת עם 200 microliters של 1X PBS באמצעות פיפטה רב ערוצית. שאפו את ה-PBS בזהירות באמצעות פיפטה רב-ערוצית, וכבסו פעמיים עם PBS.
כדי להסיר עודפי PBS, ייבשו את הצלחת באוויר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בתוך ארון בטיחות ביולוגי. הכן דילולים סדרתיים של דגימות סרום מומת חום במדיום RPMI 1640 MOPS סטרילי. הוסף 100 מיקרוליטרים של דילול הסרום שנבחר לכל באר של צלחת microtiter 96 באר.
בעמודה 10, הוסף רק מדיום RPMI 1640 MOPS לשליטה חיובית בפטרייה בלבד. הוסיפו דילול של אחד ל-50 סרום לכל הבארות בעמודה 11 כדי לשמש כבקרה שלילית ללא פטריות פלוס בסרום. לאחר כיסוי הצלחת במכסה ובנייר אלומיניום, דגירה על הצלחת למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
למחרת, לאחר שאיפת הסרום בזהירות באמצעות פיפטה רב ערוצית, הקש בעדינות על הצלחת ההפוכה כדי להסיר את שאריות הסרום. חזרו על שטיפת PBS שלוש פעמים, וייבשו את הצלחת באוויר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בתוך ארון בטיחות ביולוגי כדי לייבש כל PBS עודף. לאחר מכן, יש להמיס 25 מיליגרם של XTT ב-50 מיליליטר של לקטט רינגר מעוקר במסנן.
Aliquot 10 מיליליטר בצינורות נפרדים. מכסים אותו ברדיד אלומיניום ומאחסנים אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להמיס 8.6 מיליגרם של מנדיון בחמישה מיליליטר של אצטון.
ולאחר הפצת 50 microliters ב 100 צינורות מיקרו נפרדים, לאחסן את aliquots ב מינוס 80 מעלות צלזיוס. קח 10 מיליליטר של XTT והוסף מיקרוליטר אחד של מנדיון כדי לקבל פתרון עבודה מיקרומולרי אחד. הוסף 100 מיקרוליטרים של תמיסת XTT menadione לכל באר של צלחת microtiter 96 באר.
לאחר מכן, לאחר כיסוי הצלחת עם מכסה רדיד אלומיניום, לדגור את הצלחת במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס בחושך. לבסוף, העבירו 80 מיקרוליטרים של הסופרנטנט הצבעוני מכל באר לצלחת טרייה של 96 בארות, וקראו את הצלחת בגודל 490 ננומטר. סרום מעכברים מחוסנים ב-Sap2-parapsilosis יכול למנוע את ההבשלה של ביופילמים מוכנים מראש של קנדידה טרופיקליס ב-65%, בהשוואה ל-45% בסרום מ-Sap2-אלביקנס, ו-55% בעכברים מחוסנים ב-Sap2-טרופיקליס.
באופן כללי, עיכוב הביופילם על ידי סרום החיסון של Sap2 היה גבוה משמעותית מזה של סרום החיסון של Sham, שהוא 16% ו-13% בסרום טרום-חיסוני. עיכוב הביופילם היה קרוב לזניחות בשימוש ב-PBS וללא שליטה בסרום. יש לנקוט בזהירות מרבית בעת ביצוע שלבי הכביסה למניעת הפרעה לביופילמים.
יש להכין את פתרון XTT ממש לפני השימוש, ולהוסיף לצלחת מיד. לאחר הליך זה, משתמשים יכולים להעריך את ההשפעה של חומרים אנטי פטרייתיים חדשים, מועמדים לחיסון או נוגדנים במהלך היווצרות ביופילם קנדידה והבשלתה במסגרות מחקר שונות תוך שימוש בזני פטריות שונים.
