מחקר זה נתמך על ידי קרנות מריטה אלן מענק קרן לSeena אג&#39;יט. המחברים מבקשים להודות אריקה Balogh וד&quot;ר Soumitra Ghoshroy מאוניברסיטת דרום קרוליינה מרכז מיקרוסקופית אלקטרונים לשימוש מכשיר, סיוע מדעי וטכני.

כל הניסויים בשימוש בדגימות דם של בני אדם ומכרסמים הוצאו להורג בעמידה בכל ההנחיות הרלוונטיות, תקנות וגופים הרגולטוריים. בני אדם נרשמו לאחר שנתן הסכמה מדעת, כפי שאושר על ידי מכללת אוניברסיטת דרקסל של דירקטוריון סקירה מוסדי רפואה ואת כל הנהלים למחקרים שבוצעו באמצעות בעלי חיים אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי של דרקסל ועדה השתמשו. 1. טיהור Exosome מדם (~ 5.5 שעות) טיפים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו resuspend exosomes מצינור אחד של דם (~ 10 מיליליטר דם אדם ודם ~ 2 מיליליטר עכבר) ב300 מאגר תמוגה RNA μl מערכת בידוד מירנה mirVana. </li><li class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לטהר exosomes מתרבות תקשורת סלולרי, התקשורת הוא הסתובב במהירות XG 500 במשך 10 דקות כדי להסיר את התאים וגם מסונן דרך מסנן 0.22 מיקרומטר לאחר צנטריפוגה ב 12,000 x גרם. טיהור exosome מתרבות תקשורת סלולריאינו מחייב דילול PBS, לשטוף PBS או צעד ultracentrifugation השני. </li><li class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> אם exosomes המטוהר ישמש למחקרי proteomics, והוסיף צעד צנטריפוגה שיפוע סוכרוז אחרי צעד ultracentrifugation יהיה להקטין את כמות אגרגטים חלבון ומזהמים 15. </li><li class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> המורפולוגיה הנצפית של exosomes יכולה להשתנות בהתאם למקור והן בשלבי העיבוד עבור TEM. אנו לא צופים את המורפולוגיה בצורת הכוס לexosomes שיוחס בעבר להבדלים בעיבוד מדגם 9,15. תמונות TEM שלנו כוללים תיוג immunogold דומות לדיווחים קודמים ממקורות שונים, כולל דם, מרה ותרבות קליפת המוח נגזרת exosomes 9,16,17. </li></ul><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך צינור מצופה EDTA המכיל דם 5x ומקום זקוף בטמפרטורת חדר למשך 10-60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 2000 במשך 15 דקות ב 4 ° C. </<html> p&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את השכבה העליונה, הפלזמה, בצינורות 15 מ&quot;ל ולשמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל נוזל עם נפח שווה של PBS. צנטריפוגה 30 דקות XG ב 2000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה לצנטריפוגה צינורות, להוסיף 1X PBS עבור נפח כולל של 24 מ&quot;ל, וצנטריפוגות 45 דקות ב XG 12,000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה לultracentrifuge צינורות וצנטריפוגות שעה 2 ב 110,000 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה בPBS ו צנטריפוגות השעה 1 ב100,000 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה במאגר המתאים (מאגר תמוגה RNA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend בPBS או Ripa חיץ למיקרוסקופ אלקטרונים וניתוח כתם מערבי, בהתאמה. </li></ol> 2. RNA טיהור באמצעות ערכת בידוד מירנה mirVana השתנה (~ 1 שעות) טיפים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את השטח לבידוד RNA על ידי לבישת ציוד מגן אישי (PPE), מנגב את המשטחים וטפטפות עם RNase זאפ, ובאמצעות טיפים סינון סטרילי וצינורות. </li><li </html style=";text-align:right;direction:rtl">class = &quot;jove_content&quot;&gt; למרות שהפרוטוקול מהספק נותן את האפשרות של טיהור מירנה בלבד, אנחנו תמיד בודד RNA הכולל בין ה-mRNA ומירנה, כך שאנו יכולים ללמוד מאותו המדגם. </li><li class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת שלב טיפול DNase בטור מסירה עקבות של ה-DNA שעשויה להיות נוכחת. בהתאם למקור של exosomes, ה-DNA כבר דיווח להיעדר בexosomes המטוהר מכמה מקורות, כולל עכבר ושורות תאי פיטום בני 8 אבל רצפי DNA כרומוזומליות זוהו בexosomes מטוהר מתקשורת של cardiomyocytes התרבותי 18. </li><li class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו הקטנו את היקף הפתרון לשטוף 1 ל -350 μl (שלב 2.4 להלן), כי הספק מספק מספיק רק לשטוף פתרון 1 לתוספת אחת 700 μl. אם הנפח לא מצטמצם אין פתרון מספק יצא לבאמצעות תוכן ערכה שלם. שלבים הנותרים בוצעו על פי המלצות היצרן. </li></ul><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף VO 1/10lume של תוסף מירנה homogenate (30 μl) ולדגור על קרח למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ עם נפח של חומצת פנול: כלורופורם שווה להיקף lysate הראשוני. צנטריפוגה ולשחזר את השלב העליון בצינור טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.25 כרכי אתנול 100% (375 μl). מערבולת. החל כדי לסנן מחסנית וצנטריפוגות 15 שניות ב10,000 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חצי ממומלץ פתרון לשטוף מירנה נפח 1 (350 μl) ו צנטריפוגות 15 שניות ב10,000 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 DNase 1-70 μl חיץ RDD μl (Qiagen) לכל דגימה. הוסף 80 μl לעמודה ודגירה 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לשטוף פתרון 1 (350 μl) ו צנטריפוגות 15 שניות ב10,000 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לשטוף פתרון 2/3 (500 μl) ו צנטריפוגות 15 שניות ב10,000 x גרם. חזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute עם 40 μl 95 מעלות צלזיוס nuclease ללא H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הריכוז של רנ&quot;א ולדלל את הרנ&quot;א ל100 ng / μl. </li></ol> 3. פרופיל של מירנה Exosomes מBlooד באמצעות TaqMan צפיפות מערך (TLDA) כרטיסים נמוכים (~ 6.5 שעות) טיפים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את השטח לבידוד RNA על ידי לובש PPE, מנגב את המשטחים וטפטפות עם RNase זאפ, ובאמצעות טיפים סינון סטרילי וצינורות. </li><li class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום הגברה צעד (לפני המגבר) מומלץ ל1-350 ng-RNA (350-1,000 דגימות ng אינן דורשות צעד מראש מגבר לאחר סינתזת cDNA). זה חשוב כדי לקבוע אם מראש מגבר הוא הכרחי עבור המדגם שלך, כי אתה חייב לטפל בכל הדגימות בתנאים שווים. צעד מראש מגבר מוסיף עלות ויש להם את ערכי ה-CT מחתך מקובל נמוך יותר (32 במקום 40). </li><li class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> כדאי להכין את תגובת cDNA בצינורות רצועה במקום צלחת בהתאם למספר כרטיסים שניתן להפעיל ביום אחד. זה יהיה למזער הקפאת הפשרה של דגימות cDNA שלא יטופלו באותו היום. </li><li class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> Exosomes שנאסף ממקורות שונים יש diffeלשכור כמויות של רנ&quot;א. פרוטוקול זה מאפשר למקסימום של 3 תבנית RNA μl לתגובת סינתזת cDNA. בהתאם למקור, כמות של RNA exosomal שניתן לבודד אולי מוגבלת. בעוד רקמות טיפוסי יניבו מספיק RNA שcDNA יהיה עשויים מ100 ng-RNA בנפח 3 μl, exosomes מדם אנושי, או תקשורת תרבות תאים האנושית בדרך כלל מכיל פחות רנ&quot;א וcDNA חייב להיות עשוי מחומר פחות התחלה. exosomes דם העכבר מכיל רמות גבוהות יותר של RNA וניתן להשיג לפחות 100 ng ב3 μl. </li></ul><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין cDNA ממטוהרי RNA באמצעות הבריכות קומפלקס ענקיות להפוך פריימרים transcriptase (בריכת וברכה שמכיל פריימרים לmiRNAs על כרטיסי microfluidic מערך B ו-B), להפשיר את מרכיבי תגובה על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית שני צינורות 1.5 מ&quot;ל RNase ללא לתגובת RT עם בריכת פריימרים או primers B בריכת ולהוסיף רכיבים על מנת תרשים. להוסיף נפח נוסף לפחות אחד מהרכיבים עבור 2 או יותר ריאקציות או לעשות תערובת אמן כפי שהומלצה על ידי tהוא ספק. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיב תגובת RT </td><td> ריכוז רכיב </td><td> נפח למדגם 1 (4.5 = V / המדגם μl) </td></tr><tr><td> מים nuclease ללא </td><td></td><td> 0.20 μl </td></tr><tr><td> קומפלקס ענקי RT חיץ (10X) </td><td> 1X </td><td> 0.80 μl </td></tr><tr><td> dNTPs (100 מ&quot;מ) </td><td> 4.4 מ&quot;מ </td><td> 0.20 μl </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 מ&quot;מ) </td><td> 5 מ&quot;מ </td><td> 0.90 μl </td></tr><tr><td> RNase מונעי (20U/μl) </td><td> 2 U </td><td> 0.10 μl </td></tr><tr><td> קומפלקס הענקי RT Primers A או B (10X) </td><td> 1X </td><td> 0.80 μl </td></tr><tr><td> MultiScribe רברס טרנסקריפטאז </td><td> 75 U </td><td> 1.50 μl </td></tr></tbody></table><ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך צינורות 6 פעמים והסנאטrifuge לזמן קצר. ואז, פיפטה μl 4.5 תמהיל RT תגובה לMicroAmp רצועות 8-צינור או צלחת תגובה אופטית 96, גם MicroAmp. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 ננוגרם של רנ&quot;א ולהתאים את עוצמת קול עד 3 μl עם מים שטופלו DEPC או להוסיף 3 רנ&quot;א הכל μl, מערבבים עם קצה פיפטה, ולאטום את הצינורות או צלחת. ספין בקצרה ולדגור על קרח למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את התגובה למכונה ה-PCR ולהפעיל אותו בתנאים הבאים (כפי שהומלץ על ידי פרוטוקול יישומי Biosystems מגפלקס הבריכות): </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שלב </td><td> טמפ </td><td> זמן </td></tr><tr><td> מחזור (40x) </td><td> 16 מעלות צלזיוס </td><td> 2 דקות </td></tr><tr><td></td><td> 42 מעלות צלזיוס </td><td> 1 דקות </td></tr><tr><td></td><td> 50 מעלות צלזיוס </td><td> 1 שניות </td></tr><tr><td> להחזיק </td><td> 85 מעלות צלזיוס </td><td> 5 דקות </td></tr><tr><td> להחזיק </td><td> 4 מעלות צלזיוס </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table><ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן cDNA ב -20 ° C (טוב למשך שבוע אחד לפחות) או להמשיך לשלב טרום מגבר שיכול להיות מאוחסן במשך שבוע אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי פריימרים קדם מגבר לברכה וברכה ב &#39;על קרח ולהפוך לערבב. מערבולת TaqMan טרום Amp מיקס מאסטר ולשמור על קרח גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב תרשים הוספת נפח נוסף לפחות אחד מהרכיבים עבור 2 או יותר ריאקציות או לעשות תערובת אמן כפי שהומלצה על ידי הספק. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיב תגובה מראש Amp </td><td> נפח למדגם 1 </td></tr><tr><td> מים nuclease ללא </td><td> 7.5 μl </td></tr><tr><td> מיקס מאסטר קדם מגבר TaqMan (2X) </td><td> 12.5 μl </td></tr><tr><td> צבעי יסוד קדם מגבר A או B קומפלקס ענקי (10X) </td><td> 2.5 μl </td></tr></tbody></table><ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה μl 2.5 RT produCT לMicroAmp רצועות 8-צינור או צלחת תגובה אופטית 96, גם MicroAmp ולוותר 22.5 תערובת תגובת קדם מגבר μl לכל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת, דגירה על קרח דק 5 ולאחר מכן לטעון למכונה מדגם ה-PCR. הפעלה בתנאים הבאים. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שלב </td><td> טמפ </td><td> זמן </td></tr><tr><td> להחזיק </td><td> 95 מעלות צלזיוס </td><td> 10 דקות </td></tr><tr><td> להחזיק </td><td> 55 מעלות צלזיוס </td><td> 2 דקות </td></tr><tr><td> להחזיק </td><td> 72 מעלות צלזיוס </td><td> 2 דקות </td></tr><tr><td> מחזור (12x) </td><td> 95 מעלות צלזיוס </td><td> 15 שניות </td></tr><tr><td></td><td> 60 מעלות צלזיוס </td><td> 4 דקות </td></tr><tr><td> להחזיק </td><td> 99.9 מעלות צלזיוס </td><td> 10 דקות </td></tr><tr><td> להחזיק </td><td> 4 מעלות צלזיוס </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table><ol start="11" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תגובת קדם המגבר הוא סיים, צנטריפוגות בקצרה את הצינורות או צלחת ולאחר מכן להוסיף 75 0.1X pH TE 8.0 μl היטב כל אחד או צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום ולערבב וספין בקצרה. אחסן את המוצר בדילול המלא בשבוע אחד ב -20 ° C או להמשיך לטעון את הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב הבא בצינור RNase ללא 1.5 מ&quot;ל על קרח. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיב </td><td> נפח לכרטיס 1 </td></tr><tr><td> TaqMan יוניברסל PCR מיקס מאסטר, לא AmpErase UNG (2X) </td><td> 450 μl </td></tr><tr><td> מוצר קדם מגבר בדילול מלא </td><td> 9 μl </td></tr><tr><td> מים nuclease ללא </td><td> 441 μl </td></tr></tbody></table><ol start="14" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את הצינור כדי לערבב וצנטריפוגות בקצרה. לוותר על 100 תערובת תגובת PCR μl לכל יציאה של כרטיס מערך MicroRNA TaqMan. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG כרטיס 1,000 x 2 דקות 1. חותם את הכרטיס ולהפעיל אותו באמצעות התבנית מסופקת עם פריימרים ביישומי Biosystems הידני ואת 384 הגדרות מערך צפיפות נמוכות TaqMan כן. אנו משתמשים במערכת יישומי Biosystems 7900HT מהירה בזמן אמת PCR. </li></ol> 4. mRNA ניתוח על ידי TaqMan (~ 1.5 שעות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין תגובת qPCR, לערבב את מרכיבי התגובה בצו בתרשים. כל הדגימות תנותח עם בדיקות פריימר לגן של עניין, כמו גם rRNA 18S כגן מנרמל. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיב תגובת TaqMan </td><td> נפח למדגם 1 </td></tr><tr><td> מים nuclease ללא </td><td> 7 μl (להתאים מבוסס על מדגם בודד) </td></tr><tr><td> TaqMan מהיר מיקס מאסטר (2X) </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td> בדיקות פריימר TaqMan (20x) </td><td> μl 1 </td></tr><tr><td> cDNA מ100 ng-RNA </td><td> 2 &amp; mu, L (להתאים מבוסס על מדגם בודד) </td></tr></tbody></table><ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הצלחת גם 96 שימוש בבלוק 96 גם המהיר כפי שהומלץ על ידי היצרן (Applied מערכת Real-Time PCR מהיר 7900HT Biosystems). </li></ol>

<ol>
	<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+target+recognition+and+regulatory+functions.">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li><li>Mendell, J. T., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+stress+signaling+and+human+disease.">MicroRNAs in stress signaling and human disease.</a> Cell. 148, 1172-1187 (2012).</li><li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-coding+RNAs+in+human+disease.">Non-coding RNAs in human disease.</a> Nature reviews. Genetics. 12, 861-874 (2011).</li><li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection.">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10513-10518 (2008).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microRNAs+in+serum:+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases.">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell research. 18, 997-1006 (2008).</li><li>Gilad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+microRNAs+are+promising+novel+biomarkers.">Serum microRNAs are promising novel biomarkers.</a> PloS one. 3, e3148 (2008).</li><li>Mittelbrunn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unidirectional+transfer+of+microRNA-loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen-presenting+cells.">Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells.</a> Nature. 2, 282 (2011).</li><li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells.">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat Cell Biol. 9, 654-659 (2007).</li><li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles,+current+state-of-the-art:+emerging+role+of+extracellular+vesicles.">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cell Mol Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).</li><li>Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+extracellular+organelles+important+in+intercellular+communication.">Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication.</a> J. Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).</li><li>Ramachandran, S., Palanisamy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+transfer+of+RNAs:+exosomes+as+mediators+of+intercellular+communication.">Horizontal transfer of RNAs: exosomes as mediators of intercellular communication.</a> Wiley Interdiscip Rev. RNA. , (2011).</li><li>Record, M., Subra, C., Silvente-Poirot, S., Poirot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+intercellular+signalosomes+and+pharmacological+effectors.">Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectors.</a> Biochem Pharmacol. 81, 1171-1182 (2011).</li><li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses.">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nat Rev Immunol. 9, 581-593 (2009).</li><li>Ludwig, A. K., Giebel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+small+vesicles+participating+in+intercellular+communication.">Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 44, 11-15 (2012).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 22 (2006).</li><li>Masyuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+exosomes+influence+cholangiocyte+regulatory+mechanisms+and+proliferation+through+interaction+with+primary+cilia.">Biliary exosomes influence cholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through interaction with primary cilia.</a> American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 299, G990-G999 (2010).</li><li>Faur&#233;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+are+released+by+cultured+cortical+neurones.">Exosomes are released by cultured cortical neurones.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 31, 642-648 (2006).</li><li>Waldenstrom, A., Genneback, N., Hellman, U., Ronquist, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+microvesicles+contain+DNA/RNA+and+convey+biological+messages+to+target+cells.">Cardiomyocyte microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells.</a> PloS one. 7, e34653 (2012).</li><li>Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+proteomic+insights+and+diagnostic+potential.">Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential.</a> Expert Rev Proteomics. 6, 267-283 (2009).</li><li>Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+extracellular+circulating+microRNA.">Characterization of extracellular circulating microRNA.</a> Nucleic acids research. 39, 7223-7233 (2011).</li><li>El-Andaloussi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+delivery+of+siRNA+in+vitro+and+in+vivo.">Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo.</a> Nature. 7, 2112-2126 (2012).</li><li>Singh, P. P., Smith, V. L., Karakousis, P. C., Schorey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+isolated+from+mycobacteria-infected+mice+or+cultured+macrophages+can+recruit+and+activate+immune+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Exosomes isolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo.</a> J. Immunol. 189, 777-785 (2012).</li><li>Etheridge, A., Lee, I., Hood, L., Galas, D., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+microRNA:+A+new+source+of+biomarkers.">Extracellular microRNA: A new source of biomarkers.</a> Mutat. Res. , (2011).</li><li>Stenvang, J., Silahtaroglu, A. N., Lindow, M., Elmen, J., Kauppinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+LNA+in+microRNA-based+cancer+diagnostics+and+therapeutics.">The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics.</a> Seminars in cancer biology. 18, 89-102 (2008).</li><li>Mathivanan, S., Fahner, C. J., Reid, G. E., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExoCarta+2012:+database+of+exosomal+proteins,+RNA+and+lipids.">ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids.</a> Nucleic acids research. 40, D1241-D1244 (2012).</li></ol>

יש מחברים אין לחשוף.

בפרוטוקול זה, אנו מראים כימות של miRNAs וmRNAs מexosomes מטוהרים על ידי צנטריפוגה ההפרש מאמצעי תקשורת והתרבות בדם. יש לי Exosomes מרכיבים שונים התלויים מוצאם והם מעורבים במספר תפקודים ביולוגיים, כולל תגובה חיסונית, מצגת אנטיגן, תקשורת תאית, והעברה של רנ&quot;א וחלבונים 9,11,12,19,20....

miRNAs noncoding קצר לווסת ביטוי גנים באמצעות הקשירה mRNA היעד. השלמת רצף זרע ~ 7 זוגות בסיסים מאפשרת מירנה להיקשר לmRNA המטרה וכתוצאה מכך העיכוב של תרגום או בירידה ביציבות של ה-mRNA, אשר שניהם יכולים לגרום לירידה בביטוי של חלבון 1 היעד. מחקר בעשור האחרון הוכיח באופן חד משמעי לתפקיד בסיסי miRNAs בתיווך תפקודים תאיים. יש גם מאמץ ניכר מכוון לנתח שינויים מולקולריים העומדים בבסיס תיווך מירנה מחלות שונות 2,3. יתר על כן, זיהוי האחרון של miRNAs יציבה בנוזלי גוף 4-6 סלל את הדרך לשימוש בם כסמנים ביולוגיים חדשניים המתאימים לאבחנה קלינית. מצב אחד של התחבורה מירנה בנוזלי גוף הוא באמצעות exosomes, שלפוחית ​​קטנה שנושאות mRNAs, חלבונים, שומנים בדם, ומתווכי miRNAs לתאים המקבלים באמצעות circulat דם המערכתייון 7-14. התוצאה הוא אפנון של ביטוי גנים בתאי נמען ומייצגת מנגנון חדשני של תקשורת סלולרית. לדוגמה, תאים יכולים לווסת את התהליכים חיסונית-רגולציה על ידי הפרשת ו / או exosomes קליטת המכיל מולקולות ביולוגיות מעורבות בדלקת כגון אינטרלויקין 1β (IL1β), נמק גידול גורם-α (TNFα) והפך את גורם גדילה-β5 (TGFβ5), ו את miRNAs המווסת את הגנים האלה 13. כביטוי חריג מירנה הוא תכונה נפוצה במגוון רחב של מחלות בבני אדם, מולקולות אלה מציעות הזדמנויות חדשות ומלהיבות עבור הגילוי והאימות של מטרות טיפוליות חדשניות 2. miRNAs במחזור נמצא בכל נוזלי גוף וזה ידוע שרכב exosomes שונה המבוסס על תאי המקור שממנו הם שוחררו. לכן הם מציעים השדרה כדי ללמוד את המצב הפיזיולוגי של התאים וכיצד תאי אלתר איתות אפילוTS בתגובה ללחץ, כולל מחלות. לימוד שינויים בהרכב exosome יכול לספק תובנה הולכים אותות ולחקור את פוטנציאל השירות שלהם כסמנים ביולוגיים או מסלולי התערבות טיפוליות. כאן אנו להדגים את טיהור exosomes ממקורות מרובים המבוססים על פרוטוקולים שפורסמו. exosomes אלה ישמש לבידוד RNA אחרי qPCR לזהות ולמדוד את רמות miRNAs בהווה בexosomes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA coated vacutainer (10 ml tubes)</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>366643</td>
 <td>For exosome purification from human blood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA coated vacutainer (2 ml tubes)</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>367841</td>
 <td>For exosome purification from mouse blood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PAXgene Blood RNA Tube</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>762165</td>
 <td>For miRNA isolation from total blood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>miRVana microRNA isolation kit</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM1561</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acid-Phenol: CHCl3</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>9721G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNase 1</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>79254</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4326614</td>
 <td>For TLDA cards</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex RT rodent Pool Set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444746</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex preamp rodent Pool set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444747</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444909</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex RT Human Pool set V3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444745</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex Preamp human pool set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444748</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444913</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman MicroRNA RT kit</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4366596</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman fast universal PCR master mix </td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4366072</td>
 <td>For mRNA qRT-PCR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tumor necrosis factor (primer probe)</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Hs01113624_g1 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vascular endothelial growth factor A (primer probe)</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Hs00900055_m1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>K1642</td>
 <td>For mRNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HSP70 antibody</td>
 <td>Abcam</td>
 <td>ab94368 </td>
 <td>For western blot</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-rabbit IgG-Gold</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G7402</td>
 <td>For electron microscopy</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rabbit-anti CD81</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>SAB3500454</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nickel 300 mesh carbon formvar grids</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>FCF300-Ni</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Copper 300 mesh carbon formvar grids</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>FCF300-Cu</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 1. Table of specific reagents.</td>
</tr>
 </tbody>
 </table>

purification and microrna profiling of exosomes derived from blood and culture media

miRNAs יציבה נמצאות בכל נוזלי הגוף וכמה miRNAs מחזור מוגנת מפני השפלה על ידי תפיסה בשלפוחית ​​קטנה בשם exosomes. Exosomes יכול להתמזג עם קרום הפלזמה וכתוצאה מכך ההעברה של רנ&quot;א וחלבונים לתא המטרה. התפקודים הביולוגיים שלהם כוללים תגובה חיסונית, מצגת אנטיגן, ותקשורת תאית. מסירה של miRNAs שיכול לווסת את ביטוי הגנים בתאים המקבלים באמצעות דם פתחה אפיקים חדשים להתערבות היעד. בנוסף מציע אסטרטגיה למשלוח של תרופות או סוכנים טיפוליים RNA, תוכן exosomal יכול לשמש כסמנים ביולוגיים שיכול לסייע באבחון, קביעת אפשרויות טיפול וסיכויי החלמה. כאן אנו מתארים את הליך ניתוח miRNAs כמותית וRNAs שליח (mRNA) מexosomes המופרש בדם ותרבות תקשורת סלולרי. exosomes המטוהר יהיה מאופיין באמצעות ניתוח כתם מערבי לexosסמני omal וPCR לmRNAs של עניין. מיקרוסקופ האלקטרונים הילוכים (TEM) וסימון immunogold ישמש כדי לאמת את המורפולוגיה והיושרה exosomal. סך RNA יהיה מטוהר מexosomes אלה כדי להבטיח שאנחנו יכולים ללמוד גם ה-mRNA ומירנה מהמדגם הזהה. לאחר אימות תקינות הרנ&quot;א על ​​ידי Bioanalyzer, נבצענו אמיתי תפוקת כמותית PCR בזמן בינוני (qPCR) כדי לזהות את מירנה exosomal באמצעות מערך TaqMan בצפיפות נמוך (TLDA) כרטיסים ומחקרי ביטוי גנים לתעתיקים של עניין. פרוטוקולים אלה יכולים לשמש כדי לכמת את השינויים בmiRNAs exosomal בחולים, מודלים של מכרסמים ותרבות תקשורת סלולרי לפני ואחרי ההתערבות תרופתית. תוכן Exosomal להשתנות בהתאם למקור של המקור ואת התנאים הפיסיולוגיים של תאים המפרישים exosomes. וריאציות אלו יכולות לספק תובנות על אופן בו תאים ומערכות להתמודד עם מתח או הפרעות פיסיולוגיות. הנתונים שלנו מראים היציגים Variations בmiRNAs להציג בexosomes מטוהר מהדם עכבר, דם אדם ותקשורת בתרבות של תאי אדם. כאן אנו מתארים את הליך ניתוח miRNAs כמותית וRNAs שליח (mRNA) מexosomes המופרש בדם ותרבות תקשורת סלולרי. exosomes המטוהר יהיה מאופיין באמצעות ניתוח כתם מערבי לסמני exosomal וPCR לmRNAs של עניין. מיקרוסקופ האלקטרונים הילוכים (TEM) וסימון immunogold ישמש כדי לאמת את המורפולוגיה והיושרה exosomal. סך RNA יהיה מטוהר מexosomes אלה כדי להבטיח שאנחנו יכולים ללמוד גם ה-mRNA ומירנה מהמדגם הזהה. לאחר אימות תקינות הרנ&quot;א על ​​ידי Bioanalyzer, נבצענו אמיתי תפוקת כמותית PCR בזמן בינוני (qPCR) כדי לזהות את מירנה exosomal באמצעות מערך TaqMan בצפיפות נמוך (TLDA) כרטיסים ומחקרי ביטוי גנים לתעתיקים של עניין. פרוטוקולים אלה יכולים לשמש כדי לכמת את השינויים בmiRNAs exosomaln חולים, מודלים של מכרסמים ותרבות תקשורת סלולרי לפני ואחרי ההתערבות תרופתית. תוכן Exosomal להשתנות בהתאם למקור של המקור ואת התנאים הפיסיולוגיים של תאים המפרישים exosomes. וריאציות אלו יכולות לספק תובנות על אופן בו תאים ומערכות להתמודד עם מתח או הפרעות פיסיולוגיות. נתונים המייצגים שלנו מראים שינויים בmiRNAs להציג בexosomes מטוהר מהדם עכבר, דם אדם ותקשורת בתרבות תאים האנושית

לאחר בידוד exosomes מתקשורת ותרבות דם או סלולרי, טוהר של exosomes יכול להיבדק על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים (EM) וכתם המערבי (האיורים 1A ו-1B). אנחנו אישר הכנות exosome ממקורות שונים עם EM וכתם מערבי באמצעות נוגדנים מרובים. איור 1 א מציג תמונות EM המאשר כי exosomes הם שלמים ...

Watch this Scientific Journal Video about Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media at JoVE.com

Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

הנוכחות של מיקרו RNA היציב (miRNAs) בexosomes יצרה עניין עצום כמו מצב רומן של תקשורת בין תאית, לשירות שלהם כסמנים ביולוגיים הפוטנציאלי וכנתיב להתערבות טיפולית. כאן אנו מדגימים טיהור exosome מתקשורת והתרבות בדם ואחרי PCR כמו לזהות miRNAs מועברת.

טיהור וmicroRNA פרופיל של Exosomes נגזר מדיה דם ותרבות

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs  are protected from degradation by sequestration in small vesicles called  ...

purification-microrna-profiling-exosomes-derived-from-blood-culture

Research

JoVE Journal

Biology

31.7K Views.  Drexel University College of Medicine. הנוכחות של מיקרו RNA היציב (miRNAs) בexosomes יצרה עניין עצום כמו מצב רומן של תקשורת בין תאית, לשירות שלהם כסמנים ביולוגיים הפוטנציאלי וכנתיב להתערבות טיפולית. כאן אנו מדגימים טיהור exosome מתקשורת והתרבות בדם ואחרי PCR כמו לזהות miRNAs מועברת.

Video: Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

בידוד ואפיון של RNA המכיל Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

בידוד וטיהור של kinesin מ תסיסנית עוברים

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) were first identified in adult human peripheral blood by Asahara et al. in 1997 2 bringing an infusion of new hypotheses and strategies for vascular regeneration and repair. EPCs are rare but normal components of circulating blood that home to sites of blood vessel formation or vascular remodeling, and facilitate either postnatal vasculogenesis, angiogenesis, or arteriogenesis largely via paracrine stimulation of existing vessel wall derived cells3. No specific marker to identify an EPC has been identified, and at present the state of the field is to understand that numerous cell types including proangiogenic hematopoietic stem and progenitor cells, circulating angiogenic cells, Tie2+ monocytes, myeloid progenitor cells, tumor associated macrophages, and M2 activated macrophages participate in stimulating the angiogenic process in a variety of preclinical animal model systems and in human subjects in numerous disease states4, 5. Endothelial colony forming cells (ECFCs) are rare circulating viable endothelial cells characterized by robust clonal proliferative potential, secondary and tertiary colony forming ability upon replating, and ability to form intrinsic in vivo vessels upon transplantation into immunodeficient mice6-8. While ECFCs have been successfully isolated from the peripheral blood of healthy adult subjects, umbilical cord blood (CB) of healthy newborn infants, and vessel wall of numerous human arterial and venous vessels 6-9, CB possesses the highest frequency of ECFCs7 that display the most robust clonal proliferative potential and form durable and functional blood vessels in vivo8, 10-13. While the derivation of ECFC from adult peripheral blood has been presented14, 15, here we describe the methodologies for the derivation, cloning, expansion, and in vitro as well as in vivo characterization of ECFCs from the human umbilical CB.

Endothelial colony forming cells (ECFCs) are circulating endothelial cells with robust clonal proliferative potential that display intrinsic in vivo vessel forming ability. Phenotypic and functional characterization of outgrowth endothelial cells derived from CB are important to identify and isolate bona fide ECFCs for potential clinical application in repairing damaged tissues.

אפיון פנוטיפי ופונקציונלי של תאים מושבה אנדותל יוצרי נגזר דם טבורי האדם קורד

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

טיהור של תמלילים ומטבוליטים מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשים

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

בידוד של דם המופק מכולים multipotent מבשרים משרירי שלד אדם

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

פרופילי הביטוי microRNA של תאי iPS האנושי, רשתית פיגמנט האפיתל נגזר משב&quot;ס, ועוברי הרשתית פיגמנט האפיתל

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

דור והתרבות של דם תולדה תאי אנדותל מאדם דם היקפי

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Purification of Platelets from Mouse Blood

Platelets are purified from whole blood to study their functional properties, which should be free from red blood cells (RBC), white blood cells (WBC), and plasma proteins. We describe here purification of platelets from mouse blood using three-fold more iohexol gradient medium relative to blood sample volume and centrifugation in a swinging bucket rotor at 400 x g for 20 min at 20 &#176;C. The recovery/yield of the purified platelets were 18.2-38.5%, and the purified platelets were in a resting state, which did not contain any significant number of RBC and WBC. The purified platelets treated with thrombin showed up to 93% activation, indicating their viability. We confirmed that the purified platelets are sufficiently pure using flow cytometric and microscopic evaluation. These platelets can be used for gene expression, activation, granule release, aggregation, and adhesion assays. This method can be used for purification of platelets from the blood of other species as well.

Here, mouse blood was collected in the presence of an anti-coagulant. The platelets were purified by iohexol gradient medium using low speed centrifugation. The platelets were activated with thrombin to investigate if they were viable. The quality of the purified platelets was analyzed by flow cytometry and microscopy.

טיהור של טסיות מתוך דם העכבר

Platelets are purified from whole blood to study their functional properties, which should be free from red blood cells (RBC), white blood cells (WBC), ...