קצירת מדיום מותנה מועשר אקסוזום מתאים מתורבתים בבקבוקים bioreactor ובידוד על ידי כרית סוכרוז ultracentrifugation לגרום הכנה exosome של תשואה גבוהה עם חלבונים מזהמים מינימליים או וריסקים שאינם אקסוזומליים. שימוש כרית סוכרוז אחת מוכן תחמוצת דיטריום עוקף את ההכנה מייגעת של שיפוע סוכרוז רציפה ומפחית את כמות סוכרוז הדרוש כדי להשיג את הצפיפות הנדרשת. אספקה יעילה במבחנה של siRNA אנקפסולציה אקסוזומים שהוכנו בפרוטוקול זה מדגיש את הפוטנציאל של מערכת זו כטיפול חדש מבוסס הפרעה RNA הדור לסרטן הלבלב.
ראשית, תרבות HEK-293 תאים במדיום רגיל, כמתואר בכתב היד. הרחב את התאים לארבעה בקבוקונים T75, וגדל עד שהם מגיעים 90% confluency. כדי להכין בקבוק bioreactor, להוסיף 50 עד 100 מיליליטר של מדיום נורמלי לתוך המאגר הבינוני של בקבוק bioreactor להרטיב את הממברנה.
לאסוף את כל התאים HEK-293 מארבעת flasks T75, ו resuspend אותם 15 מיליליטר של מדיום דל שומן בצינור צנטריפוגה. לאחר מכן, השתמש במזרק 20 מיליליטר המחובר למחט מילוי קהה כדי להוסיף בזהירות את מתלי התא לתא התא של בקבוק bioreactor. לאחר מכן, למלא את המאגר הבינוני של בקבוק bioreactor עם המדיום הרגיל, עד 500 מיליליטר, ו דגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 במשך שבוע.
לאחר שבוע של דגירה, להסיר את כל המדיום מהמאגר הבינוני של בקבוק bioreactor על ידי לשפוך אותו החוצה. באמצעות מזרק 20 מיליליטר מחובר מחט מילוי קהה, להסיר את כל המדיום מתא התא. לאחר מכן, להוסיף 50 עד 100 מיליליטר של בינוני רגיל למאגר בינוני ו 15 מיליליטר של מדיום דל אקסואזום טרי לתא התא באמצעות מזרק 20 מיליליטר מחובר מחט מילוי קהה.
לאחר מכן, למלא את המאגר הבינוני של בקבוק bioreactor עם בינוני נורמלי עד 500 מיליליטר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 לשבוע נוסף. כדי לנקות מראש את המדיום המותנה שנאסף, צנטריפוגה אותו ב 500 פעמים g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
מעבירים את העל-טבעי לצינור חדש, ומשליכים את גלולת הכדור. לאחר שחזר על שלב צנטריפוגה זה עם על טבעי התאושש, לשחזר את העל טבעי שוב להשליך את גלולה. לאחר מכן, צנטריפוגה העל-טבעית התאוששה במהירות של 2,000 פעמים למשך 15 דקות וארבע מעלות צלזיוס.
שמור על העל-טבעי, והשליך את גלולת הכדור. סנן את העל-טבעי פעם אחת דרך מסנן 22 מיקרומטר המחובר למזרק של 20 מיליליטר לתוך צינור צנטריפוגה טרי. בינתיים, כדי להכין פתרון סוכרוז 25% תחמוצת דיטריום, במדויק לשקול 1.9 גרם של סוכרוז בצינור אוניברסלי.
לאחר מכן, מוסיפים תחמוצת דיטריום עד שהמשקל מגיע ל -7.6 גרם. לאחר מכן, מלא צינור אולטרהצנטריפוגה עם 22.5 מיליליטר של מדיום ממוזג טרום פינה. מניחים פיפטה זכוכית בצינור.
הוסף שלושה מיליליטר של פתרון סוכרוז דרך פיפטה, כך הפתרון יוצר שכבה נפרדת מתחת למדיום מותנה. בזהירות למקם את הצינור המכיל פתרון בינוני מותנה בשכבות / סוכרוז לתוך הדלי של רוטור מתנדנד החוצה. אבטח את הדלי לתוך הרוטור.
מניחים את הרוטור לתוך אולטרהצנטריפוגה, ולסובב ב 100, 000 פעמים g בארבע מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות. לאסוף שני מיליליטר של שכבת סוכרוז מן הצינור, אחד מיליליטר בכל פעם באמצעות פיפטה P1000, עם קצה שלה מחובר קצה 10 מיקרוליטר, ולהוסיף אותו בקבוק אולטרהצנטריפוגה המכיל 20 מיליליטר של PBS מסונן לכביסה. מניחים את הצינור לתוך רוטור בזווית קבועה, וצנטריפוגה אותו ב 100, 000 פעמים g בארבע מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות.
השתמש פיפטה סרולוגית 10 מיליליטר כדי להסיר בזהירות את supernatant. תן שימוש חוזר לכדור עם 400 מיקרוליטרים של PBS מסונן. לפני תחילת האלקטרופוריה, מצננים מראש את ה-cuvette של האלקטרופולציה על הקרח למשך 30 דקות.
מערבבים שבעה מיקרוגרם של אקסוזומים עם 33 מיקרוגרם של siRNA בצינור מיקרוצנטריפוגה. הוסף מאגר חומצת לימון כדי להשיג נפח של 150 microliters. מוסיפים את תערובת האקסוזום-siRNA לקרט האלקטרופורציה באמצעות פיפטה מפלסטיק, ומכסים את ה- cuvette.
מניחים את ה- cuvette בכיוון הנכון במחזיק ה- cuvette של האלקטרופורטור, ומסובבים את הגלגל המסתובב של האלקטרופורטור ב- 180 מעלות בכיוון השעון. בחר את התוכנית הרצויה ולחץ על לחצן התחל כדי להפעיל אלקטרופוזיה. הצג יצביע על דופק מוצלח.
לאחר מכן, להחזיר את הגלגל 180 מעלות נגד כיוון השעון, ולהסיר את cuvette. השתמש פיפטה פלסטיק כדי להסיר את המדגם מן cuvette לתוך צינור microcentrifuge חדש. יש לשמור את הצינור על הקרח או במקרר לפני עיבוד נוסף, אם לא נעשה בו שימוש מיידי.
כדי להתחיל הסרת siRNA חינם, לעבור 3.5 מיליליטר של PBS מסונן דרך עמודת כרומטוגרפיה אי הכללת גודל פעמיים כדי לצייד אותו. לאחר מכן, להמיס 150 microliters של מדגם אלקטרופולד ב 350 microliters של PBS מסונן, ולהעביר אותו לעמודה SEC. אסוף את שבר ה-500 מיקרוליטר הראשון שחמק מהעמודה לצינור מיקרו-פוגה, וסמן אותו כ-F0. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטרים של PBS מסונן לעמודה.
אסוף את השבר הבא וסמן אותו כ- F1. חזור על הוספת PBS ואיסוף שברי אלוטיון עד סך של 10 שברים 500 מיקרוליטר, או עד F9, נאסף. לבסוף, כדי להסיר שאריות מדגם, לשטוף את העמודה עם PBS מסונן לפחות פעמיים, ולאחר מכן להמשיך עם ניסויים, כמתואר בכתב היד. ניתוח מורפולוגי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור הראה כי אקסוזומים HEK-293 היו מבנים כדוריים מעט גדול יותר מ 100 ננומטר.
תוצאה זו מסכימה עם זה מדידת ניתוח מעקב חלקיקים, אשר הראה גם את התפלגות הגודל של exosomes. יתר על כן, הם היו חיוביים עבור סמנים אקסוזומליים CD81, CD9, ו CD63. אחוז השחזור של אקסוזומים מטוהרים באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל ואחוז השחזור של siRNA חושבו כמתואר בכתב היד.
ההתאוששות שלאחר הטיהור של אקסוסום הייתה 75% באמצעות העקומה הסטנדרטית siRNA, יעילות אנקפסולציה של siRNA באקסוזומים חושבה להיות על 10 כדי 20%זרימה ניתוח איכותי cytometry של ספיגת במבחנה של אקסוזומים טעון עם Atto655-siRNA פלואורסצנטי הראה כי PANC-1 תאים שטופלו exosomes siRNA-אנקפסולציה היה השינוי הגדול ביותר באות פלואורסצנטי. זה אושר על ידי הממצא כי PANC-1 תאים שטופלו exosomes encapsulated siRNA רשם אחוז גבוה יותר של אוכלוסייה חיובית עבור אות Atto655 לעומת זה שטופלו exosomes לא טעון ותערובת siRNA. ספיגת הסלולר של siRNA היה גם גבוה באופן משמעותי בתאי PANC-1 שטופלו exosomes encapsulated siRNA בהשוואה לזה שטופלו בתערובת exosome-siRNA, המאשר כי exosomes encapsulated siRNA הופנמו על ידי תאי PANC-1, כי הם מספקים ביעילות את siRNA תאית.
חשוב לשקול את תחמוצת סוכרוז ו deuterium במדויק מאוד בעת הכנת פתרון סוכרוז, ותמיד להשתמש בתותח סוכרוז מוכן טרי כדי למנוע שינוי צפיפות במהלך האחסון. מיקרוסקופ קונפוקלי יכול להתבצע כדי לאמת עוד יותר את ההפנמה של siRNA אנקפסולציה exosomes לתאים וללמוד סחר תאי שלה בעקבות ספיגת הסלולר. פרוטוקול זה מאפשר לנו להעריך את ההפלה הספציפית לגנים של siRNA המועברת על ידי exosome ומשמש ככלי לאימות יעד חדש בטיפול בסרטן מבוסס הפרעות RNA.
