עבודה זו מומנה בחלקה על ידי NIH R01 # DE021475 (CTM), גידול NIH Predoctoral הדרכה גרנט 5T32GM007127 (PAE), וכן מלגת מחקר לתארים מתקדמים NSF (NAE). אנו מודים קווין Schwalbach לביצוע BAC recombineering וזריקות, ניק Donde להפקת הנתונים רצף CRISPR סנגר, וקתרין ליפארי עבור משוב מועיל על פרוטוקול ההזרקה.

החוקרים אין לי מה לחשוף.

חד-תאי הזרקה עוברת קוצן עבור transgenesis או עריכת הגנום מציג שלושה אתגרים מרכזיים. ראשית, ביחס עוברי דג זברה, הסיסי עוברי קוצן קשה ולעתים קרובות ישבור מחטים. בעיה זו ניתן להתגבר חלקית על ידי שימוש micropipettes זכוכית עבה וחזק וההזרקה בניצב הסיסי (ראה פרוטוקול, איור 2). הה...

מרכיב בסיסי אחד של הבנה כיצד מגוון ביולוגי המתבקשת הוא לקביעת הבסיסי הגנטי והתפתחותיים של שינויים פנוטיפי התפתחו בטבע. דג עוקצן threespine, Gasterosteus aculeatus, התפתח מודל מצוין לחקר הבסיס הגנטי של אבולוציה. הקוצנים עברו שינויים אבולוציוניים אדפטיבית רבים כמו דגים ימיים יישבו בסביבות מים מתוקים אינספור ברחבי חצי הכדור הצפוני, וכתוצאה מכך מורפולוגיים דרמטי, פיזיולוגיים, ושינויים התנהגותיים 1. בגנום של אנשים מגובה של עשרים ואחד אוכלוסיות קוצן היה רצף והרכיבו, ומפה הצמדה צפיפות גבוהה נוצרה על מנת לשפר יותר את מכלול 2,3. ניסויי מיפוי גנטיים זיהו אזורים גנומית שבבסיס פנוטיפים התפתחו 4 - 6, ובעוד כמה מקרים, התפקידים התפקודיים של גני מועמדים ספציפיים נבדקו 7,8. מספר האזורים גנומית שבבסיס שינויים מורפולוגיים זוהה עם גני מועמדים מבטיחים, אך מועמדים אלו טרם נבדקו מבחינה תפקודית 9 - 12. בנוסף, הקוצנים הם מודלים נפוצים ללימודים של גנטיקה של אוכלוסיות / הגנומיקה 13,14, התפצלות 15, התנהגות 1, אנדוקרינולוגיה 16, ecotoxicology 17, אימונולוגיה 18 ופרזיטולוגיה 19. מחקרים עתידיים בכל אחד מהתחומים הללו ייהנו היכולת לבצע מניפולציות גנטיות תפקודיות הקוצנים. בנוסף מניפולצית רצפי הקידוד שלהם, את התפקידים של גני מועמדים ניתן להעריך על ידי לימוד הרצפים רגולטורית ציס שלהם ועל ידי הגדלה מבחינה תפקודית, קטן, או ביטול הביטוי של גן המועמד. שיטות Microinjection ו transgenesis ב הקוצנים מבוססות היטב 7,8,20 ו בתחילה פותחו באמצעות meganuclease בתיווךשיטה 21 תוארה לראשונה בשנת medaka 22. שיטת microinjection השונה המוצגת כאן כבר אופטימיזציה עבור שניהם transgenesis Tol2 בתיווך ופתחה לאחרונה ריאגנטים עריכת הגנום כולל TALENs ו CRISPRs. שינויי האלמנטים רגולטורית ציס נחשבים קריטי לאבולוציה מורפולוגיים, כמו השינויים רגולטורית ציס יכולים למנוע את ההשלכות השליליות של pleiotropic קידוד מוטציות 23. לכן, בדיקה והשוואת רצפים רגולטורית ציס משוערים הפכה ליעד מרכזי של מספר גדל והולך של מחקרים אבולוציוניים. בנוסף, רוב גרסאות מחלות אנושיות הן גרסאות רגולטוריות 24,25, ומערכות חוליות מודל נדרשים עז ללמוד לתפקד אלמנט רגולטורית ציס וההיגיון. דגים כי לדשן העוברי שלהם כלפי חוץ במספרים גדולים להציע מערכות חוליות רבות עצמה כדי לחקור -regulation cis. מערכת transposon Tol2, שבו foreiDNA GN להיות משולבת בגנום מוקף Tol2 transposase אתרי קישור ושיתוף הזריקו Tol2 transposase mRNA, עובד עם יעילות גבוהה לשילוב בהצלחה פלסמיד בונה לתוך הגנום דגים 26 - 28. בדרך כלל, משפר הפוטנציאל הוא משובטים במעלה הזרם של האמרגן הבזליים (כגון hsp70l 29) ואת הגן כתב ניאון כגון EGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת) או mCherry בתוך עמוד השדרה Tol2 והזריקו עם transposase mRNA 26. תצפית ביטוי של כתב הניאון, בין אם עובר מוזרקים או צאצא עם transgenes משולב ביציבות, מספקת מידע על ויסות spatiotemporal של ביטוי גנים מונעת על ידי המשפר המשוער. בניסויים נוספים, משפרי תוקף ניתן להשתמש בכונן ביטוי יתר ספציפי רקמות של גנים של עניין. באשר לניתוח אזורי רגולטורית ציס גדולים, באיכות גבוהה genom בקנה הכנסic ספריות באמצעות כרומוזומים מלאכותיים בקטריאלי (BACS) נבנו עבור שני הקוצנים ימיים מים מתוקים 30. Bács אלה ניתן recombineered להחליף גן עם גן כתב ניאון בהקשר של (kb 150-200) גדול באזור הגנומי 31. כתב הניאון מתבטא אז דפוס spatiotemporal כפי שנקבע על ידי רצפי רגולציה בתוך BAC. עבור מחקרים בדגים, אתרי Tol2 ניתן להוסיף גם את BAC כדי להקל אינטגרציה הגנומי 32,33. בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות כאשר הכלאה באתרו הוא מאתגר מבחינה טכנית, את ההודעה הניאון של BAC יכול לשמש כדי לחקור דפוסי ביטוי גנים, כפי שהוכח לחלבון קוצן עצם המוךפו&quot;גנטי שהולך 6 (Bmp6) 20. בנוסף, דפוסי ביטוי ניאון אדם יכול להיות במעקב לאורך זמן, אשר לא יכול להיות מושלם עם הכלאה באתרה. Bács יכול לשמש גם כדי להוסיף additionaעותק l של אזור גנומי כדי להגדיל את המינון של גן של עניין. לצורך המחקר של תפקוד הגן, עריכת הגנום הוא השדה המתרחב בפיצוץ, שניתן להשתמש בהם כדי לייצר שינויים ממוקדים אל רצפי הגנום במגוון רחב של אורגניזמים 34. מפעיל דמוי תמלול nucleases מפעיל (TALENs) הם nucleases מודולרי, ספציפית רצף מבודד במקור פתוגנים צמח יכול להיות מהונדסים בדיוק להיקשר ישירות רצף גנומי של בחירה וליצור גדיל כפול לשבור 35,36. באשכולות בקביעות interspaced חזרות palindromic קצר (CRISPR) / מערכות CAS נמצאו במקור חיידקים להשתמש RNA מדריך ואת החלבון Cas9 כדי ליצור הפסקה ברצף ה- DNA היעד משלים מדריך 37. התיקון בדיעבד של הפסקת הגדיל הכפולה שיצרה שתי TALENs ו CRISPRs לעתים קרובות משאיר אחריו כניסה קטנה או מחיקה, אשר יכול לשבש את הפונקציה של רצף היעד35-37. בשנת הקוצנים, שימשו TALENs לשבש ביטוי גנים על ידי מיקוד משפר 20, ושניהם TALENs ו CRISPRs יצרו בהצלחה מוטציות קידוד רצפים (נתונים שלא פורסמו). פרוטוקול מפורט עבור הדור של CRISPRs לשימוש דג הזברה יכול לשמש כקו מנחה לפתח CRISPRs עבור הקוצנים 38. מהונדס וניסויי עריכת הגנום דורשים מבוא של חומצות גרעין לתוך עובר חד-תאי שהופרה זה עתה. על ידי הצגת כלי transgene או הגנום עריכת בשלב מוקדם של התפתחות, מספר תאי הבת מניפולציות גנטיות בעובר מוגדל. עובר מוזרק אז מוקרנים חזותיים עבור קרינה או הוקרנתי מולקולרי עבור שינויים בגנום. אם תאי תורם germline ממוקדים בהצלחה, את הגן או המוטציה יכול להיות עברה על קבוצת משנה של צאצאים, גם כאשר הקטלניות לאחר הזרקה היא גבוהות. דג הפסיפס ניתן outcrossed אוintercrossed וצאצאיהם הוקרנו לשחזר את אללים מוטנטים או transgene משולב ביציבות של ריבית. פרוטוקול זה מתאר שיטות להכנסת transgenes ריאגנטים עריכת הגנום לעוברי קוצן חד-תאים וניטור עבור שינויים גנומיים מוצלחים.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscope with transillumination</td><td>Leica</td><td>S6e/ KL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>Manual micromanipulator</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MM33</td><td>Marzhauser M33 Micromanipulator</td></tr><tr><td>Pressure Injecion system</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>Back pressure unit</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette holder kit</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic base holder</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>Magnetic base</td><td></td></tr><tr><td>Foot switch</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>Iron plate (magnetic base)</td><td>Narishige</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Disposable transfer pipettes</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>0.5% phenol red in DPBS</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P0290</td><td>injection tracer</td></tr><tr><td>#5 forceps, biologie dumoxel&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>for needle breaking</td></tr><tr><td>Micropipette Storage Jar</td><td>World Precision Instruments</td><td>E210</td><td>holds needles</td></tr><tr><td>6&quot;, 6 teeth per inch plaster drywall saw</td><td>Lenox</td><td>20571 (S636RP)</td><td>hold eggs for injection</td></tr><tr><td>13 cm x 13 cm glass plate</td><td>any hardware store</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-F4</td><td>*harder glass than zebrafish injection capillaries</td></tr><tr><td>150 x 15mm Petri dish</td><td>Fisher</td><td>FB0875714</td><td>raise stickleback embryos</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Petri dish</td><td>Fisher</td><td>08-757-100A</td><td>store eggs pre-injection</td></tr><tr><td>Instant Ocean Salt</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate/MS-222</td><td>Western Chemical Inc</td><td>MS222</td><td>fish anaesthesia/euthanasia</td></tr><tr><td>Sp6 transcription kit</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>For transcription of TALENs and transposase mRNA</td></tr><tr><td>RNeasy cleanup kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>purify transposase or TALEN RNA</td></tr><tr><td>QiaQuick PCR cleanup kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>clean up plasmids for injection</td></tr><tr><td>Proteinase K 20 mg/ml</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td>for DNA preparation</td></tr><tr><td>Nucleobond BAC 100 kit</td><td>Clontech</td><td>740579</td><td>for BAC DNA preparation</td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>Phusion polymerase</td><td>Fisher</td><td>F-530L</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen PlasmidPlus Midi kit</td><td>Qiagen</td><td>12943</td><td>contains endotoxin rinse buffer</td></tr><tr><td>QIAQuick Gel Extraction</td><td>Qiagen</td><td>28704&amp;nbsp;</td><td>for sequencing induced mutations</td></tr><tr><td>Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol</td><td>Sigma</td><td>P2069-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma</td><td>S2889-250G</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (molecular biology grade)</td><td>Sigma</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>50x Tris-acetate-EDTA buffer</td><td>ThermoFisher</td><td>B49</td><td></td></tr><tr><td>0.5-10 Kb RNA ladder</td><td>ThermoFisher</td><td>15623-200</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop&amp;nbsp; Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>1 kb Plus DNA Ladder</td><td>ThermoFisher</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>ThermoFisher</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tris pH 8.3</td><td>Teknova</td><td>T1083</td><td></td></tr><tr><td>12-strip PCR tube</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1113</td><td></td></tr></tbody></table>

microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks

דג עוקצן threespine התפתח כמערכת רבה עצמה כדי לחקור את הבסיס הגנטי של מגוון רחב של מורפולוגיים, פיסיולוגי, פנוטיפים התנהגותיים. פנוטיפים המגוונים להפליא שהתפתחו כמו אוכלוסיות ימיות להסתגל לסביבת מים מתוקה אינספור, בשילוב עם היכולת לחצות צורות ימיות מים מתוקים, לספק מערכת החולייתנים נדירה בם גנטיקה יכולה לשמש כדי למפות אזורי גנומית שליטה התפתחה תכונות. משאבי גנומי מצוינים זמינים כעת, הקלה לנתיחת גנטיקה מולקולרית של שינויים התפתחו. בעוד ניסויי מיפוי ביצירת רשימות של גני מועמדים מעניינים, מניפולציות גנטיות פונקציונליות נדרשות לבחון את התפקידים של גנים אלה. ויסות גנים ניתן ללמוד עם פלסמידים BACS כתב מהונדסים משולבים לתוך הגנום באמצעות מערכת transposase Tol2. פונקציות של גנים מועמדים ספציפיים ואלמנטים רגולטורית ציס ניתן להעריך על ידי גרימת ממוקדמוטציות עם Talen ו CRISPR / Cas9 ריאגנטים עריכת הגנום. כל השיטות דורשות החדרת חומצות גרעין לעוברי קוצן חד תא מופרה, משימה שנעשתה מאתגר ידי סיסי העבה של עוברת קוצן ואת blastomere הקטנה ורזה יחסית. כאן, פרוטוקול מפורט עבור microinjection של חומצות גרעין לעוברי קוצן מתואר ליישומים מהונדסים הגנום עריכה ללמוד ביטוי גנים ותפקוד, כמו גם טכניקות כדי להעריך את ההצלחה של transgenesis ולשחזר קווי יציבה.

עבור transgenes גן הכתב כי יש פעילות משפרת, זריקה מוצלחת תגרום ביטוי ספציפי, סלולארי של transgene (איור 4 א, ​​4C). דגים מוזרקים לאחר מכן ניתן outcrossed לייצר קווי יציבה (דוגמא קו BAC יציב שמוצג באיור 4B). הזרקת DNA לעוברי קוצן בדרך כלל תוצאות ?...

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks at JoVE.com

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Microinjection עבור עריכת Transgenesis ו הגנום ב הקוצנים Threespine

מניפולציות מהונדסות ועריכה הגנום הן קריטיים עבור תפקודית בדיקות התפקידים של גנים ואלמנטים רגולטורית cis. הנה פרוטוקול microinjection מפורט עבור הדור של שינויים גנומיים (כולל מבנים transgene כתב ניאון בתיווך Tol2, TALENs, ו CRISPRs) מוצג לגבי דגים המודל המתהווה, עוקצן threespine.

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

microinjection-for-transgenesis-genome-editing-threespine

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.9K Views.  University of California, Berkeley.  מניפולציות מהונדסות ועריכה הגנום הן קריטיים עבור תפקודית בדיקות התפקידים של גנים ואלמנטים רגולטורית cis. הנה פרוטוקול microinjection מפורט עבור הדור של שינויים גנומיים (כולל מבנים transgene כתב ניאון בתיווך Tol2, TALENs, ו CRISPRs) מוצג לגבי דגים המודל המת...

Video: Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene function. Gene knockout has been used to study these gene functions in vivo. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system is a powerful tool used to edit genomic DNA sequences to alter gene function. While the traditional approach has been to introduce CRISPR/Cas9 mRNA into the single cell embryos through microinjection, this can be a slow and inefficient process in catfish. Here, a detailed protocol for microinjection of channel catfish embryos with CRISPR/Cas9 protein is described. Briefly, eggs and sperm were collected and then artificial fertilization performed. Fertilized eggs were transferred to a Petri dish containing Holtfreter's solution. Injection volume was calibrated and then guide RNAs/Cas9 targeting the toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1) gene and rhamnose binding lectin (RBL) gene were microinjected into the yolk of one-cell embryos. The gene knockout was successful as indels were confirmed by DNA sequencing. The predicted protein sequence alterations due to these mutations included frameshift and truncated protein due to premature stop codons.

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

A simple and efficient microinjection protocol for gene editing in channel catfish embryos using the CRISPR/Cas9 system is presented. In this protocol, guide RNAs and Cas9 protein were microinjected into the yolk of one-cell embryos. This protocol has been validated by knocking out two channel catfish immune-related genes.

Microinjection CRISPR/Cas9 החלבון לתוך ערוץ שפמנון, Ictalurus punctatus, העוברים עבור ג'ין עריכה

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Genetics

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

הדור של עכברים השתנה גנטית דרך Microinjection של ביציות

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biology

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

מיקרומניפולציה של ביטוי גנים במוח דג הזברה למבוגר באמצעות Microinjection Cerebroventricular של oligonucleotides morpholino

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Neuroscience

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

הזרקת דנ א לתוך eyebuds ב xenopus זריזה העוברים והדמיה של gfp המבטא האופטי axonal הביע בשלמותו, חי xenopus tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

מיקרו-הזרקה של זיגוטה ליצירת קלטות גנטיות ואללים של פלוקס בעכברים

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesis is now possible in a wide range of organisms using genome editing techniques. Here, we demonstrate a protocol for targeted gene mutagenesis using transcription activator like effector nucleases (TALENs) in Astyanax mexicanus, a species of fish that includes surface fish and cavefish.

הגנום עריכה<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; שימוש תמלול Activator דמוי מפעיל nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these independently derived phenotypes, which share a common genetic architecture. This is perhaps best exemplified by the numerous convergent features of gymnotiforms and mormyrids, two species-rich teleost clades that produce and detect weak electric fields and are called weakly electric fish. In the 50 years since the discovery that weakly electric fish use electricity to sense their surroundings and communicate, a growing community of scientists has gained tremendous insights into evolution of development, systems and circuits neuroscience, cellular physiology, ecology, evolutionary biology, and behavior. More recently, there has been a proliferation of genomic resources for electric fish. Use of these resources has already facilitated important insights with regards to the connection between genotype and phenotype in these species. A major obstacle to integrating genomics data with phenotypic data of weakly electric fish is a present lack of functional genomics tools. We report here a full protocol for performing CRISPR/Cas9 mutagenesis that utilizes endogenous DNA repair mechanisms in weakly electric fish. We demonstrate that this protocol is equally effective in both the mormyrid species Brienomyrus brachyistius and the gymnotiform Brachyhypopomus gauderio by using CRISPR/Cas9 to target indels and point mutations in the first exon of the sodium channel gene scn4aa. Using this protocol, embryos from both species were obtained and genotyped to confirm that the predicted mutations in the first exon of the sodium channel scn4aa were present. The knock-out success phenotype was confirmed with recordings showing reduced electric organ discharge amplitudes when compared to uninjected size-matched controls.

Here, a protocol is presented to produce and rear CRISPR/Cas9 genome knockout electric fish. Outlined in detail are the required molecular biology, breeding, and husbandry requirements for both a gymnotiform and a mormyrid, and injection techniques to produce Cas9-induced indel F0 larvae.

השתקה הניצוץ: CRISPR/Cas9 הגנום עריכה בדגים חשמליים חלש

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite the growing burden of tick-borne diseases, research on ticks has lagged behind insect disease vectors due to challenges in applying genetic transformation tools for functional studies to the unique biology of ticks. Genetic interventions have been gaining attention to reduce mosquito-borne diseases. However, the development of such interventions requires stable germline transformation by injecting embryos. Such an embryo injection technique is lacking for chelicerates, including ticks. Several factors, such as an external thick wax layer on tick embryos, hard chorion, and high intra-oval pressure, are some&#160;obstacles that previously prevented embryo injection protocol development in ticks. The present work has overcome these obstacles, and an embryo injection technique for the black-legged tick, Ixodes scapularis, is described here.&#160;This technique can be used to deliver components, such as CRISPR/Cas9, for stable germline transformations.

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

The present protocol describes a method for injecting tick embryos. Embryo injection is the preferred technique for genetic manipulation to generate transgenic lines.

טכניקת הזרקת עוברים לעריכת גנים בקרצייה שחורת הרגליים, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...