מיקרו-הזרקה של זיגוטה ליצירת קלטות גנטיות ואללים של פלוקס בעכברים

הפרוטוקולים שלנו מסייעים ליצור עכברים מהונדסים גנטית הדורשים ניסויים מתקדמים בעכבר in vivo, כגון הדמיה של ביטוי גנים, הומניזציה גנטית ונוקאאוט גנים מותנה. טכניקת עריכת הגנום של הזיגוטה בעכבר המוצגת כאן מאפשרת אינדוקציה יעילה, מהירה ופשוטה ביותר של שינויים גנטיים מתקדמים, כגון קלטת גנים ופלוקס. מכיוון שעכברים מהונדסים גנטית משמשים בתחומי מחקר מגוונים כגון נוירולוגיה, אימונולוגיה, מטבוליזם, רבייה ומחלות זיהומיות, הטכנולוגיה שלנו המוצגת כאן תומכת באופן בסיסי בתחום מחקר רחב זה.

מי שידגימו את ההליך יהיו נצומי איקי, מיוקי אישידה ויוקו טנימוטו, הצוות הטכני מהמעבדה שלי. בתור התחלה, הכינו שתי צלחות פטרי 35 מ"מ לתרבית זיגוטה והניחו אותן באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ופחמן דו חמצני של 5% עד לשימוש. אספו את האובידוקט והניחו אותם בטיפה של 20 מיקרוליטר של מדיום M2 המכיל 0.75 מיליגרם למיליליטר של היאלורונידאז על מכסה צלחת הפטרי.

השתמשו במלקחיים עדינים כדי להרים אובידוקט אחד ולחורר כ-50 מיקרוליטר של M2 בינוני עם היאלורונידאז דרך הפימבריה. לאחר 30 שניות, באמצעות נימי זכוכית, הרימו זיגוטות רגילות מורפולוגית עם כמות קטנה של מדיום ושטפו אותן על ידי העברתן לטיפות בינוניות M16 טריות. לאחר מכן, אגרו את הזיגוטה שטופה לתוך צלחת פטרי וחזרו על התהליך עד שכל הזיגוטה נשלפת.

באמצעות מושך פיפטה לתכנות, למשוך כמה פיפטות זכוכית. שברו את קצה מחט המיקרו-הזרקה על ידי פגיעה בכדור הזכוכית המחובר לקצה המיקרופורג'. בדוק את גודל הקצה תחת מיקרוסקופ בהגדלה של 1, 000x וודא שגודל הקצה של מחט המיקרו-הזרקה הוא בקוטר של מיקרומטר אחד.

השתמש microforge כדי לכופף את מחט microinjection בערך שניים עד שלושה מילימטרים מן הקצה. הזריקו 1 עד 1.5 ס"מ מנוזל הפעולה למרכז מחט המיקרו-הזרקה וחברו אותו למחזיק המיקרו-מזרק הידני עם מפעיל הפיזו. לאחר מכן, חבר את מחט האחיזה למחזיק המיקרו-מזרק הידני הנגדי והעבר את נוזל הפעולה לקצה מחט המיקרו-הזרקה בלחץ הדרגתי.

תקן את מחזיקי המזרק הידני על המיקרומניפולטור. הכינו תא הזרקה עם שלוש טיפות. ראשית, עם 10 מיקרוליטר של M2 בינוני, שנית, עם חמישה מיקרוליטרים של 12% פוליוויניל פירולידון בתווך M2, ושלישית, עם תערובת של חמישה מיקרוליטרים של crRNA, tracrRNA, חלבון Cas9 ותמיסת ה- DNA התורם.

מכסים את הטיפות בשמן מינרלי ומניחים את תא ההזרקה על שלב המיקרוסקופ ההפוך. תחת המיקרוסקופ ההפוך בהגדלה של פי 50, הורידו את פיפטת המיקרו-הזרקה לטיפה של 12% PVP. יש לשאוף ולהוציא 12% PVP כדי לנקות את החלק הפנימי של קצה מחט המיקרו-הזרקה ולהעביר אותו לטיפת ה-RNPD.

שים את microinjector ידני תחת לחץ שלילי. למצוץ את פתרון RNPD לתוך מחט microinjection ולחכות עד נפח מספיק הוא שאף. תחת הגדלה של פי 50, מלא את כל החלק הפנימי של מחט המיקרו-הזרקה בנוזל.

לאחר מכן, להפסיק את צריכת ולאפשר פתרון RNPD להיות מגורש בהדרגה על ידי הגדרת microinjector ידני ללחץ חיובי. העבירו את קצה מחט המיקרו-הזרקה לתוך השמן. הכניסו 50 זיגוטים לטיפת M2 והורידו בעדינות את פיפטת האחיזה לאותה טיפה.

מעבירים את מחט המיקרו-הזרקה לטיפת M2 המכילה זיגוטים. עברו למטרה של פי 20 והתמקדו בקצה פיפטת המיקרו-הזרקה. לאחר החזקת זיגוטה, התמקדו בגרעין על ידי הזזת המיקרומניפולטור.

הכנס את מחט המיקרו-הזרקה לזיגוטה וקרב את הקצה לגרעין. ברגע שהקצה מגיע לקרום הגרעין, יש למרוח את דופק הפיזו כדי לחדור. כאשר מחט מיקרו-הזרקה מנקבת את הגרעין, הזריקו את תמיסת ה-RNPD והתבוננו בנפיחות הגרעין.

לאחר שהגרעין מנופח במלואו, משוך במהירות את המחט ובצע את אותו הליך הן על הגרעין הנשי והן על הגרעין הגברי. להבדיל בין הזיגוטה לפני ואחרי ההזרקה על ידי העברת הזיגוטה המוזרקת למקום אחר בטיפת M2, ולהמשיך להזריק את כל הזיגוטה הקיימת בטיפת M2. לאחר ההזרקה, מעבירים את הזיגוטה לצלחת M16 טרייה.

בחר את הזיגוטה ששרדה 10 דקות לאחר ההזרקה. מוציאים את הזיגוטה הליזית שניזוקה מההזרקה ומפזרים זיגוטות ששרדו לכל טיפה בצלחת M16. מניחים כמות קטנה של מדיום תרבית, כמה בועות אוויר כטוש, ואת הזיגוטה בפיפטה להעברה.

באמצעות גזירה מיקרו, לעשות חתך בין אמפולה ואת fimbriae של oviduct. הכניסו את הזיגוטה לחתך ובו זמנית אשרו כי בועת האוויר הוצגה. יעילות הייצור החציונית של 13 עכברי קלטות גנים בלתי תלויות הייתה 20.8% עם מקסימום של 39.5% ומינימום של 7.9%שיעור הילודה החציוני בתנאי מיקוד גנים לא קטלני זה היה 34.0% עם מקסימום של 43.3% ומינימום של 15.9%יעילות הייצור החציונית של 10 עכברי floxed עצמאיים הייתה 7.7% עם מקסימום של 20.7% ומינימום של 2.1%למרות שהפונקציות של מספר גני מטרה היו לא ידוע, שיעור הילודה החציוני היה 30.2% עם מקסימום של 43.8% ומינימום של 17.3%קוטר הקצה של מחט ההזרקה לא צריך להיות דק מדי, ויש להתאים את הלחץ של המזרק הידני כדי להבטיח כי התמיסה במחט מוזרק וכי הגרעין מנופח לאט.