We would like to thank Ainara Ruiz de Sabando for providing H&amp;E images. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (DK052230, DK093680 and CA172113) awarded to Dr. Vincent W. Yang.

1. עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל מחקרים שכללו עכברים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת סטוני ברוק ועדת שימוש (IACUC). העכברים היו מתוחזקים על מחזור אור חשוך שעות 12:12. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסחרי להשיג C57BL / 6 עכברים. השג C57BL / 6 עכברים שנשאו אללים Klf5 מוקף אתרים loxP (L f Klf5 / f l). עכברים אלו תוארו בעבר 21 ובתנאים באדיבות ד&quot;ר Ryozo נגאי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש C57BL / 6 עכברים נושאים את גן recombinase Cre מושרה לפי תקנה של אמרגן Lgr5 (עכברי Lgr5-EGFP / CreERT2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להקים Lgr5-EGFP / קואל T2 / Klf5 עכברים f l / f l, לחצות Klf5 fl / f עכברים l עם Lgr5-EGFP / עכברים קואל T2 ואז הכלאה לאחור הצאצא Klf5 fl / f l </sup&gt; עכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים Treat עם טמוקסיפן לפי הפרוטוקול שתואר לעיל 22. להזריק בן 8 שבועות עכברי הניסוי והבקרה intraperitoneally (IP) עם 1 מ&quot;ג טמוקסיפן (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל), מומס בשמן תירס סטרילי, במשך 5 ימים רצופים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 14 לאחר הזרקת טמוקסיפן הראשונה, להקריב בעכברים באמצעות מחנק CO 2 על ידי הצבת בתא המחובר ל- CO מקור גז 2. אפשר הגז לזרום לתוך התא עד העכברים הם לא מודעים וכל התנועה נפסקת. כדי להבטיח המתת חסד לבצע פריקה צוואר הרחם. </li></ol> 2. רקמות הכנה שוויצרי רולינג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש לנתיחת מלקחיים ומספריים, לחתוך חתך בעור של צד הבטן. עם זוג מלקחיים, להחזיק את העור על החתך ומשוך בעדינות מן הרקמה שרירי הבטן. השתמש זוג מספריים כדי לחתוך את העור בטן ולחשוף את שרירי הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזק ולמשוך את PEritoneum עם מלקחיים. הקפד לא להיות מחזיק ומושך את המעיים. בזהירות עושים חתך ברקמת הצפק ולהמשיך חיתוך משם את העור כדי לחשוף את שרירי הבטן. בזהירות עושים חתך את שרירי הבטן ולהמשיך חיתוך משם להם לחשוף את המעיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את המעי הגס ואת עקבות אל הקצה הדיסטלי במקום בו נמצא החיבור החלחולת / פי הטבעת. עם זוג מספרי, לחתוך קרוב ככל לפתיחה האנאלית ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את הקיבה ואת העקבות שבו הוא מצטרף עם המעי הדק. עם זוג מספריים, שניתקה המעי על 1 ס&quot;מ מן הבטן. מעבירים את אורכו של המעי הדק והמעי הגס משוחררים לצלחת נקייה פטרי המכילות בופר פוספט (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביד אחת או זוג מלקחיים, להחזיק את הקצה הדיסטלי של המעי הגס ולהשתמש מצד שני לפענח את אורכו בעדינות של המעי הגס מכל רקמת החיבור ו / או שומן mesenteric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את cecum(כיס קטן בין המעי הקטן וגדול) וחותך שבו cecum ואת המעי הגס להצטרף (סוף הפרוקסימלי של המעי הגס) כדי לשחרר את המעי הגס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביד אחת או זוג מלקחיים, להחזיק את המעי הדק ולהשתמש מצד שני לפענח את אורכו בעדינות של המעי הדק מכל רקמת החיבור ו / או שומן mesenteric. לחתוך את cecum וזורק אם אין צורך בכך. הערה: התהליך יכול להיפסק כאן על ידי דוגרים המעיים גזור החוצה מקבע שונה של Bouin (50% אתנול / 5% חומצה אצטית ב O DH 2) לילה ולהמשיך בהליך למחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול קטע אחד של המעי (מעי או מעי גס קטנים), למלא מזרק 10 מיליליטר עם המקבע השונה של Bouin ולצרף מחט gavage אליו. הכנס את המחט כחצי סנטימטר בפתיחה הקדמית של קטע המעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את מחט gavage בתוך קטע המעי על ידי הפעלת לחץ משרד עם מכשירעל קטע המעי. בעזרת היד השנייה מחזיקה את המזרק, להפעיל לחץ עדין אך עקבי כדי לשטוף את התוכן של קטע המעי באמצעות המקבע השונה של Bouin. שלב זה מאפשר ניקוי סימולטני של קטע מעי קיבעון מיידי. השתמש בצלחת פטרי כדי לאסוף את פסולת זרימת דרך. קיבוע ניתן להבחין לפי צבע הנקודות ההפיכים אטום. הערה: ודא שלא להפעיל לחץ רב מדי במהלך שטיפה או קטע המעי עלול נפרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים, לחתוך את קטע המעי longitudinally לאורך קו mesenteric. תחזיק את זה עם זוג מלקחיים ולשטוף אותו בקצרה בצלחת פטרי המכילות PBS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את המעי הדק לתוך 3 חלקים שווים: הפרוקסימלי, באמצע, ואת דיסטלי. מגזר הפרוקסימלי הוא אחד מיד לאחר הקיבה, ומגזר דיסטלי הוא אחד שערב המעי הגס. המגזר הפרוקסימלי שווה אל התריסריון, אמצע אל מְעִי צָם, ואת דיסטליהמעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל מגזר לציון הפרוקסימלי ואת הקצה הדיסטלי. סוף הפרוקסימלי הוא זה במקור הצביע לכיוון הבטן, ואת דיסטלי הצביע לעבר המעי הגס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש גבי צלחת פטרי למקם את קטע המעי ניקה ופתח. מניחים את קטע המעי עם הצד luminal פונה כלפי מעלה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור המעי הגס, לזהות את הצד luminal ידי רבגוניות / רכסים לרוץ על פני רוחב שלה נמצאים בסוף הפרוקסימלי. האזורים באמצע הדיסטלי יש כמה רבגוניות שמופעלים longitudinally. עבור המעי הדק, לזהות את הצד luminal ידי משטח המופיעים-מחוספס, אשר מסמן את villi. הערה: המעי הדק, אין תיחום אנטומיים מקרוסקופית חיצוני של הפרוקסימלי, באמצע ואזורי דיסטלי. עם זאת באזורים אלו ניתן יכולים מזוהים בסעיפים תחת מיקרוסקופ. Villi הם הארוך ביותר באזור הפרוקסימלי ולהיות בהדרגה קצר distally היכן הם נמצאיםהקצר באורך. מיקרוסקופי, המאורות הגסים הם קצרים ביותר באזור הפרוקסימלי אשר יכול גם להיות מזוהה על ידי הנוכחות של רכסים. המאורות הגסים הם גבוהים במותנים וקצרים באזור דיסטלי ועדיין גבוהים באזור הפרוקסימלי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך עם השוויצרי לגלגל את המעי הגס: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את המעי הגס שטוח פתוח ולמשוך אותו עם מלקחיים מהקצה הפרוקסימלי שלה לעבר הקצה של צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור בצד לומינל פונה כלפי מעלה ומחזיק את הקצה הפרוקסימלי עם המלקחיים ביד אחת ועם היד השנייה חזק קיסם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוטף את הקצה של הקצה הפרוקסימלי ברחבי הקיסם באמצעות המלקחיים מעט לצבוט את הקצה העטוף נגד הקיסם כדי להחזיקו במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות ולאט לאט מתחילים לגלגל את הקיסם עם האצבעות כדי לגלגל את המעי הגס ברחבי קיסם ליצירת רולדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אורך המעי הגס כולו כבר מופשלים, להשתמש זוג מלקחיים כדי להחליק את ג בזהירותOlon רולדה את הקיסם לתוך קלטת רקמות עיבוד / -embedding. מניחים את קלטת בפורמלין 10% שנאגרו הלילה בטמפרטורת החדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך עם השוויצרי לגלגל את המעי הדק: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול קטע אחד בכל פעם, לשמור על הפלח שטוח פתוח עם צד luminal עד ולמשוך אותו עם מלקחיים מהקצה הפרוקסימלי שלה לעבר הקצה של צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך עם גלגול שוויצרי כמתואר עבור המעי הגס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך עם עיבוד רקמות קבוע פורמלין להטבעת פרפין. פעל באופן הבא: הערה: השתמש מעבד אוטומטי (ראו חומרים וציוד של לפרטים נוספים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד רקמות נמצאות את הקלטת, לשטוף רקמה עם PBS עד המקבע נמחק לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשי רקמות באמצעות אתנול לפי הסדר הבא: אתנול 50% במשך 10 דקות, 70% אתנול למשך 10 דקות, 80% אתנול למשך 10 דקות, 95% אתנול למשך 10 דקות, אתנול 100% במשך 10 דקות, אתנול 100% במשך 10 דקות , ו 100% אתנול למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת אתנול עם קסילן לפי הסדר הבא: 2: 1 אתנול: קסילן במשך 10 - 15 דקות, 1: 1 אתנול: קסילן במשך 10 - 15 דקות, 1: 2 אתנול: קסילן במשך 10 - 15 דקות, 100% קסילן במשך 10 - 15 דק &#39;, קסילן 100% במשך 10 - 15 דקות, ו -100 קסילן% במשך 10 - 15 דקות. זהירות: קסילן הוא מפגע בריאותי, וכך במקום העבודה צריכה להיות מצויד אוורור יניקה מקומי עם ברדס ראוי לבין ציוד המגן הנכון צריך להיות לבש ידי אדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת קסילן עם פרפין. בצע את השלבים הבאים בוואקום להגדיר בתנור 54 - 58 ° C: 2: פרפין למשך 30 דקות, 1:: קסילן 1 1 קסילן: פרפין למשך 30 דקות, 1: 2 קסילן: פרפין למשך 30 דקות, 100% פרפין 1 - 2 שעות, פרפין 100% עבור 1 - 2 שעות או למשך הלילה. הערה: אל תתנו פרפין יעלה על 60 מעלות צלזיוס במשך תקופות ממושכות של זמן, כי זה יהיה לבזות את הפולימרים פרפין ולהפוך אותו קשה ופריך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבץ רקמה חדשה פרפין אוריינט טרי כמו דההוליד לפני פרפין מתקשה. עבור הלחמניות השויצריות, בעקבות רקמות paraffinization, חשוב למקם כל גליל על צידו במהלך הטבעת פרפין. הדבר מבטיח כי במהלך חיתוך, קטעי האורך של כל גליל יופקו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים, לחתוך חלקים עבים 5 מיקרומטר באמצעות microtome. אסוף בסעיפים בשקופיות טעונים ומייבשים אותם (לאפות) בתוך 65 ° C בתנור למשך הלילה; ומצננים לטמפרטורת החדר ולאחר מכן השתמשו בהם מכתים. הערה: זמן האפייה יכול להתקצר 1 - 2 שעות תלוי כמה טרי חתוך השקופיות. אם פחות מחודש מאז חתך, אז רצוי לאפות לילה. אם זה כבר יותר מחודש, אז 1 - 2 שעות של אפייה מספיקה כדי לחסוך זמן. אם הולך ואוזל הזמן, גיבוי לילה תמיד ניתן להשתמש. </li></ol> 3. ניתוח היסטולוגית ו Immunofluorescence מכתים ביצוע ניתוח היסטולוגית immunofluמכתים orescence כפי שתואר לעיל 23,24, עם שינויים. עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת (EGFP) immunofluorescence: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופים את השקופיות בתנור C 65 מעלות במשך שעה 1 כדי להשבית פעילות phosphatase אלקליין אנדוגני ובהמשך deparaffinize קסילן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפים דגירה באמבט של מי חמצן 3% מתנול לחסום peroxidases רקמות אנדוגני; אז רעננותם על ידי הדגירה בסדרה אמבטיה אלכוהול ירידה (100%, 95%, 70%) ואחריו אחזור אנטיגן בתמיסה חיץ ציטראט (10 מ&quot;מ נתרן ציטרט, 0.05% Tween-20, pH 6.0) ב 125 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות באמצעות תא decloaking. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר עיגול סביב סעיפי רקמות באמצעות סימון בעט מספק מחסום הידרופובי דגירת קטעים עם חסימת חיץ (אלבומין בסרום שור 2.5% [BSA] ב-Tween TBS) למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ואז עם נוגדן ראשוני נגד EGFP (דילול 1 : 500) בשעה 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה בתא humidified תוך רעד בעדינות.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף סעיפי דגירה עם נוגדנים משני ניאון מתויג בריכוז המתאים למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות לאחר גרעיני טיפול כתם נוגדנים משני עם Hoechst ו הר עם תקשורת גוברת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת Klf5 / EGFP / Ki-67 שיתוף מכתים, מגלשות תהליך כמתואר בשלבים 3.1 - 3.3 ו לבצע מכתים Klf5 ידי דוגרים עם נוגדן Klf5 (דילול 1: 150) לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל איתור פולימר ארנב AP לשקופיות לפי פרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף Klf4 מכתים באמצעות מכתים immunohistochemical אַב צֶבַע לפי פרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע elution נוגדן באמצעות פרוטוקול שתואר לעיל 25. דגירה השקופיות ב 50 מעלות צלזיוס גליצין-SDS (pH 2.0) פתרון עם תסיסה במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מחליק היטב במים מזוקקים דגירה עם חסימת חיץ (BSA 2.5% ב-Tween TBS) למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף Ki-67 (דילול 1: 500) ו EGFP (דילול 01:500) נוגדנים זמנית ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע זיהוי ניאון עם נוגדנים משני המתאים לפני צביעה עם Hoechst (מידע לא מוצג) ואת הר עם הרכבה בינונית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו מורפולוגיה היסטולוגית של הרקמות על מכתים סעיפים 5-מיקרומטר עם hematoxylin ו eosin (H &amp; E) 26. לקבלת תמונות ניאון, להשתמש אורכי גל הפליטה של ​​535, 646, ו -700 לדמיין EGFP, Klf5, ו קי-67 מכתים, בהתאמה. </li></ol>

<ol>
	<li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+self-renewal,+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium.">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).</li><li>Bjerknes, M., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+isolation+of+intact+epithelium+from+the+mouse+intestine.">Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine.</a> Anat Rec. 199, 565-574 (1981).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5.">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).</li><li>van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OLFM4+is+a+robust+marker+for+stem+cells+in+human+intestine+and+marks+a+subset+of+colorectal+cancer+cells.">OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells.</a> Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).</li><li>van der Flier, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+achaete+scute-like+2+controls+intestinal+stem+cell+fate.">Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stem cell fate.</a> Cell. 136 (5), 903-912 (2009).</li><li>Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1+is+expressed+in+vivo+in+intestinal+stem+cells.">Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells.</a> Nat Genet. 40 (7), 915-920 (2008).</li><li>Montgomery, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+telomerase+reverse+transcriptase+(mTert)+expression+marks+slowly+cycling+intestinal+stem+cells.">Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 179-184 (2011).</li><li>Takeda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interconversion+between+intestinal+stem+cell+populations+in+distinct+niches.">Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches.</a> Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).</li><li>May, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+putative+gastrointestinal+stem+cell+and+adenoma+stem+cell+marker,+doublecortin+and+CaM+kinase-like-1,+following+radiation+injury+and+in+adenomatous+polyposis+coli/multiple+intestinal+neoplasia+mice.">Identification of a novel putative gastrointestinal stem cell and adenoma stem cell marker, doublecortin and CaM kinase-like-1, following radiation injury and in adenomatous polyposis coli/multiple intestinal neoplasia mice.</a> Stem Cells. 26 (3), 630-637 (2008).</li><li>Powell, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pan-ErbB+negative+regulator+Lrig1+is+an+intestinal+stem+cell+marker+that+functions+as+a+tumor+suppressor.">The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor.</a> Cell. 149 (1), 146-158 (2012).</li><li>Pearson, R., Fleetwood, J., Eaton, S., Crossley, M., Bao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+transcription+factors:+a+functional+family.">Kruppel-like transcription factors: a functional family.</a> Int J Biochem Cell Biol. 40 (10), 1996-2001 (2008).</li><li>McConnell, B. B., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Kruppel-like+factors+in+health+and+diseases.">Mammalian Kruppel-like factors in health and diseases.</a> Physiol Rev. 90 (4), 1337-1381 (2010).</li><li>McConnell, B. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functions+of+Kruppel-like+factors+4+and+5+in+epithelial+biology+and+pathobiology.">The diverse functions of Kruppel-like factors 4 and 5 in epithelial biology and pathobiology.</a> Bioessays. 29 (6), 549-557 (2007).</li><li>Nandan, M. O., Ghaleb, A. M., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+5+is+essential+for+proliferation+and+survival+of+mouse+intestinal+epithelial+stem+cells.">Kruppel-like factor 5 is essential for proliferation and survival of mouse intestinal epithelial stem cells.</a> Stem Cell Res. 14 (1), 10-19 (2015).</li><li>Gelberg, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy,+physiology,+and+mechanisms+of+disease+production+of+the+esophagus,+stomach,+and+small+intestine.">Comparative anatomy, physiology, and mechanisms of disease production of the esophagus, stomach, and small intestine.</a> Toxicol Pathol. 42 (1), 54-66 (2014).</li><li>De Robertis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AOM/DSS+murine+model+for+the+study+of+colon+carcinogenesis:+From+pathways+to+diagnosis+and+therapy+studies.">The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies.</a> J Carcinog. 10 (9), (2011).</li><li>Magnus, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+presence+of+intestinal+epithelium+in+the+gastric+mucosa.">Observations on the presence of intestinal epithelium in the gastric mucosa.</a> The Journal of Pathology and Bacteriology. 44 (2), 389-398 (1937).</li><li>Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+"Swiss+roll":+a+simple+technique+for+histological+studies+of+the+rodent+intestine.">The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine.</a> Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).</li><li>Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+practical+'swiss+roll'+method+of+preparing+tissues+for+paraffin+or+methacrylate+embedding.">A simple, practical 'swiss roll' method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding.</a> J Microsc. 145, 115-120 (1987).</li><li>Summersgill, B., Clark, J., Shipley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+and+chromogenic+in+situ+hybridization+to+detect+genetic+aberrations+in+formalin-fixed+paraffin+embedded+material,+including+tissue+microarrays.">Fluorescence and chromogenic in situ hybridization to detect genetic aberrations in formalin-fixed paraffin embedded material, including tissue microarrays.</a> Nat Protoc. 3 (2), 220-234 (2008).</li><li>Takeda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+are+essential+for+the+adaptive+response+of+the+murine+heart+to+pressure+overload.">Cardiac fibroblasts are essential for the adaptive response of the murine heart to pressure overload.</a> J Clin Invest. 120 (1), 254-265 (2010).</li><li>el Marjou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+and+inducible+Cre-mediated+recombination+in+the+gut+epithelium.">Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium.</a> Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).</li><li>McConnell, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+5+is+important+for+maintenance+of+crypt+architecture+and+barrier+function+in+mouse+intestine.">Kruppel-like factor 5 is important for maintenance of crypt architecture and barrier function in mouse intestine.</a> Gastroenterology. 141 (4), 1302-1313 (2011).</li><li>Nandan, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+5+is+a+crucial+mediator+of+intestinal+tumorigenesis+in+mice+harboring+combined+ApcMin+and+KRASV12+mutations.">Kruppel-like factor 5 is a crucial mediator of intestinal tumorigenesis in mice harboring combined ApcMin and KRASV12 mutations.</a> Mol Cancer. 9 (63), (2010).</li><li>Pirici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+elution+method+for+multiple+immunohistochemistry+on+primary+antibodies+raised+in+the+same+species+and+of+the+same+subtype.">Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype.</a> J Histochem Cytochem. 57 (6), 567-575 (2009).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

הטכניקה מתגלגלת השויצרית היא שיטה חזקה להכנת רקמת מעי להערכה היסטולוגית וצורנית בקנה מידה גדול. בניגוד לטכניקת Swiss-מתגלגלת שתוארה לעיל, אשר פותחה במקור עבור הכנת החלקים קפואים 18,19, הנוהל שהוצג כאן מאפשר הכנת רקמת מעי ללא דיחוי וללא קיבעון קיבעון פורמלין והטבעת ...

אפיתל יונקי המעי מהווה שכבת תאים אחת עמודים. במעי הדק, תאי שגשוג מתוחמי המאורות בעוד תאים ממוינים לכבוש באזור הסיסי. עם זאת, כי אין villi ב המעי הגס, תאי השגשוג הם נקודה לחלק התחתון של המאורות ותאי בדיל לכבוש את האזור העליון של המאורות. אפיתל המעי עובר חידוש מהיר (כ 3 - 5 ימים), כי הוא מונע על ידי חלוקה רציפה של תאי השגשוג בתוך המאורות. תאי השגשוג של המאורות אינם אוכלוסייה הומוגנית מחולקים נוסף לתוך תאי גזע הגברה במעבר (ת&quot;א) תאים 1. תאי הגזע מתגוררים בתחתית הקריפטה, בתוך 4 הראשונים - התאים 5 מן מאוד תחתון 2. המודל הנוכחי תומך בקיומו של שני סוגים של תאי גזע: עמודי בסיס הקריפטה תאים גזע (CBC) ותאי גזע שקטים מילואים. ה- CBC sתאים TEM הם מתרבים באופן פעיל מסומנים על ידי G- חלבון בשילוב המכילים חוזרים לאוצין עשיר קולטן 5 (Lgr5) 3, 4 Olfactomedin (Olfm4) 4 ו Achaete scute דמוי 2 (Ascl2) 5. מצד שני, תאי גזע שקט מילואים מסומנים על ידי אתר אינטגרציה וירוס לוקמיה בעכברים תא ספציפי B Moloney 1 (Bmi1) 6, טלומרז העכבר הפוכה transcriptase (mTert) 7, HOP Homeobox (Hopx) 8, Doublecortin דמוי קינאז CAM כמו ב- 1 (Dclk1) 9, ו לאוצין-ריץ &#39;שחוזר אימונוגלובולין-כמו תחומים 1 (Lrig1) 10. תאי הגזע מתרבים באופן פעיל להצמיח תאי ת&quot;א ואז לעבור התמיינות נוספת לתאים קליטים (enterocytes) ותאי הפרשה (enteroendocrine, גביע, פנט, ותאי Tuft). חלוקת תא רציפה באזור שגשוג תוצאת מהלך עליות של תאי אפיתל לאורך ציר מרתף השליה עד שהם מגיעים עליונים של villi, שם הם עוברים אפופטוזיס והםהשליך מעליו מפני השטח של האפיתל. הסוגים השונים של תאי האפיתל במעי מסומנים על ידי הביטוי של חלבונים נפרדים (לדוגמא, תאי גביע במעי יכולים להיות מוכרים על ידי צביעה עם נוגדן נגד תאי Muc2 ו פנט עם נוגדן נגד ליזוזים). אנו ללמוד את התפקיד של Krüppel דמויי גורמים (KLFs) ב הומאוסטזיס pathobiology של האפיתל במעי 11-13. התוצאות המוצגות כאן לתמוך את הכדאיות של טכניקת Swiss-מתגלגל שונה מבוססות על מחקרים קודמים של התפקיד של גורם Krüppel הדמוי 5 (KLF5) בשמירה על תאי הגזע אפיתל במעי מתרבים באופן פעיל 14. KLF5 הוא גורם שעתוק אבץ אצבעות כי מבוטא בכמות גבוהה בגזע המעיים הפעיל ותא ת&quot;א 12. מחקרים קודמים הראו כי KLF5 הוא שיתוף הביע עם Ki-67, סמן שגשוג ידוע מאורות המעיים. Tr העיכול<html> מעשה אינו רקמות מבנית או תפקודית הומוגנית. המעי הדק מחולק תריסריון, מְעִי צָם, ואת מעי ואת המעי הגס לתוך cecum ומעי גס, עם האחרון נוסף מחולק הפרוקסימלי, אמצע חלקים דיסטלי. לכל אחד מהחלקים הללו תכונות היסטולוגית ייחודיות והיא ממלאת תפקידים ברורים 15. ככזה, את ההשפעות של עלבונות ואת מידת התגובה של האפיתל במעי תלויה באזור של רקמה למדה 16. בנוסף, זני עכברים שונים להפגין מגוון של התגובה ברמה היסטולוגית בהתאם לסוג של עלבון השתמש במחקרים 16. לכן, כיאה הכנת רקמה יש צורך להתיר היסטולוגית מתאים וניתוח מולקולרי של רקמות מעי. ככזה, ניתוח מענקי טכניקה-רולדה של האורך המלא של האפיתל במעי בבת אחת ובכך הוכיח מסקנות מושכלות על בסיס מידע רחב. e_content &quot;&gt; הטכניקה-רולדה הוזכר לראשונה על ידי מגנוס 17, ותיאר בפרוטרוט על ידי Moolenbeck ו Ruitenberg ופארק et al. כשיטה להכנת רקמות וביצוע היסטולוגית מנתח של המעי מכרסם 18,19, בהתאמה. הפרוטוקול שמסומן בפרסום זה מציג גרסה משופרת של השיטה המקורית המאפשרת עבור הכנת הרקמה עדכני ואמין למטרות אבחון. טכניקה שונה זה מאפשר אוספים והכנת יעיל של האפיתל במעי טכניקות בשימוש אוניברסלית, כגון אימונוהיסטוכימיה, immunofluorescence, כמו גם כמו כלאה באתרו (פלורסנט 20 chromogenic). יתר על כן, הרקמה השונה דגימת שיטת הכנה מנצלת זמינים וזולים יחסית ריאגנטים תוך שהיא מציעה שיטה של קיבעון רקמות מהירה מאפשרת התאוששות של החלבון, DNA, RNA להערכה נוספת. תפוס יחד, תיהטכניקה של מצוין הערכה מקיפה של histopathological, פתולוגי, ומולקולרית תכונות של האפיתל במעי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1016">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Stainless Steel Dissecting Kits</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25640-002</td>
			<td style="width:403px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Decloaking Chamber</td>
			<td style="width:179px;">Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Syringe 10ml</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td>89215-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:316px;">Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid</td>
			<td style="width:179px;">Simport</td>
			<td>M515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Superfrost Plus Slides [size: 25x75x1mm]</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Manual Slide Staining Set</td>
			<td style="width:179px;">Tissue-Tek/Sakura</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Staining Dish Green</td>
			<td style="width:179px;">Tissue-Tek/Sakura</td>
			<td>4456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Staining Dish White</td>
			<td style="width:179px;">Tissue-Tek/Sakura</td>
			<td>4457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">24-Slide Slide Holder with Detachable Handle</td>
			<td style="width:179px;">Tissue-Tek/Sakura</td>
			<td>4465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Oven</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td>6243</td>
			<td>for baking slides at 65 degree</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:179px;">Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:179px;">Nikon</td>
			<td>Eclipse 90i</td>
			<td>Bright and fluoerescent light, with objectives: 10x, 20x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td>DAI-PAP-S-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Ethanol 200 proof</td>
			<td style="width:179px;">AAPR</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Methanol</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:179px;">AAPR</td>
			<td>281000ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Xylene</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td>X5P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Hydrogen peroxide 25% solution in water</td>
			<td style="width:179px;">ACROS</td>
			<td>202465000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">10% bufered formalin</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-026-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Bovine serum fraction V, heat shock</td>
			<td style="width:179px;">Roche</td>
			<td>3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Tween 20</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Gavage needle</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20068-624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Rabbit anti Klf5 antibody</td>
			<td style="width:179px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-22797</td>
			<td>Dilution 1: 150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Chicken anti EGFP antibody</td>
			<td style="width:179px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">AB16901</td>
			<td>Dilution 1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Rabbit anti Ki67 antibody</td>
			<td style="width:179px;">Biocare Medical</td>
			<td style="width:119px;">CRM325B</td>
			<td>Dilution 1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Mach3 rabbit AP polymer detection kit</td>
			<td style="width:179px;">Biocare Medical</td>
			<td style="width:119px;">M3R533L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Warp red chromogen kit</td>
			<td style="width:179px;">Biocare Medical</td>
			<td style="width:119px;">WR806 H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Lgr5-EGFP/CreERT2 mice&#160;</td>
			<td>Jackson labs</td>
			<td>008875&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Automated processor</td>
			<td style="width:179px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">Leica TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

הטכניקה מתגלגלת השויצרית בשילוב עם מכתים immunohistochemical מאפשרת ניתוח מקיף של רקמת מעי קטנה או גדולה. הדוגמא של צביעת H &amp; E של מעי גס של עכבר C57BL / 6 (איור 1) היא המחשה של ההיתכנות ואת האפקטיביות של הטכניקה הזו. כפי שניתן לראות בתרשים 1, התמו...

Watch this Scientific Journal Video about Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses at JoVE.com

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

זיהוי מדויק ומיקום של תאי אפיתל לאורך רירית רירית המעי חיוני להגדיר שושלות תאים שונות. הדמיה תקינה של רקמות מעי היא קריטית לזיהוי דפוסי ביטוי חלבון עם רזולוציה מקסימלית. מחקר זה נועד להתוות שיטות האופטימליות ותנאי רקמות מעי עכבר עיבוד.

טכניקה Swiss-מתגלגל משופר עבור הכנת רקמת המעי עבור immunohistochemical ו ניתוח Immunofluorescent

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

improved-swiss-rolling-technique-for-intestinal-tissue-preparation

Research

JoVE Journal

Biology

68.0K Views.  Stony Brook University School of Medicine.  זיהוי מדויק ומיקום של תאי אפיתל לאורך רירית רירית המעי חיוני להגדיר שושלות תאים שונות. הדמיה תקינה של רקמות מעי היא קריטית לזיהוי דפוסי ביטוי חלבון עם רזולוציה מקסימלית. מחקר זה נועד להתוות שיטות האופטימליות ותנאי רקמות מעי עכבר עיבוד. 

Video: Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

לחץ לליטוש pipettes עבור Patch-clamp הקלטה משופרים

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are analyzed. Established methods to detect cell division include direct visualization by continuous microscopy in cell culture, dilution of vital dyes such as carboxy&#64258;uorescein di-aetate succinimidyl ester (CFSE), immuno-detection of mitogenic antigens such as ki67 or PCNA, and thymidine analogues. Thymidine analogues can be detected by a variety of methods including radio-detection for tritiated thymidine, immuno-detection for bromo-deoxyuridine (BrdU), chloro-deoxyuridine (CldU) and iodo-deoxyuridine (IdU), and chemical detection for ethinyl-deoxyuridine (EdU). We have derived a strategy to detect sequential incorporation of different thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice. Our method allows investigators to accurately quantify two successive rounds of cell division. By optimizing immunostaining protocols our approach can detect very low dose thymidine analogues administered via the drinking water, safe to administer to mice for prolonged periods of time. Consequently, our technique can be used to detect cell turnover in very long-lived tissues. Optimal immunofluoresent staining results can be achieved in multiple tissue types, including pancreas, skin, gut, liver, adrenal, testis, ovary, thyroid, lymph node, and brain. We have also applied this technique to identify oncogenic transformation within tissues. We have further applied this technique to determine if transit-amplifying cells contribute to growth or renewal of tissues. In this sense, sequential administration of thymidine analogues represents a novel approach for studying the origins and survival of cells involved in tissue homeostasis.

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

We have derived a strategy to detect sequential incorporation of thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice to quantify two successive rounds of cell division. This strategy is useful to detect cell turnover of long-lived tissues, oncogenic transformation, or transit-amplifying cells.

איתור Immunofluorescent של שני אנלוגים Thymidine (CldU ו IdU) ברקמה ראשי

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

הוצאת הקרביים של הזגוגיות עכבר רשתית עבור ניתוח proteomic

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

טכניקה פשוטה ויעילה להכנת השעיות תא אשכים

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Trajectory Data Analyses for Pedestrian Space-time Activity Study

It is well recognized that human movement in the spatial and temporal dimensions has direct influence on disease transmission1-3. An infectious disease typically spreads via contact between infected and susceptible individuals in their overlapped activity spaces. Therefore, daily mobility-activity information can be used as an indicator to measure exposures to risk factors of infection. However, a major difficulty and thus the reason for paucity of studies of infectious disease transmission at the micro scale arise from the lack of detailed individual mobility data. Previously in transportation and tourism research detailed space-time activity data often relied on the time-space diary technique, which requires subjects to actively record their activities in time and space. This is highly demanding for the participants and collaboration from the participants greatly affects the quality of data4.
Modern technologies such as GPS and mobile communications have made possible the automatic collection of trajectory data. The data collected, however, is not ideal for modeling human space-time activities, limited by the accuracies of existing devices. There is also no readily available tool for efficient processing of the data for human behavior study. We present here a suite of methods and an integrated ArcGIS desktop-based visual interface for the pre-processing and spatiotemporal analyses of trajectory data. We provide examples of how such processing may be used to model human space-time activities, especially with error-rich pedestrian trajectory data, that could be useful in public health studies such as infectious disease transmission modeling.
The procedure presented includes pre-processing, trajectory segmentation, activity space characterization, density estimation and visualization, and a few other exploratory analysis methods. Pre-processing is the cleaning of noisy raw trajectory data. We introduce an interactive visual pre-processing interface as well as an automatic module. Trajectory segmentation5 involves the identification of indoor and outdoor parts from pre-processed space-time tracks. Again, both interactive visual segmentation and automatic segmentation are supported. Segmented space-time tracks are then analyzed to derive characteristics of one's activity space such as activity radius etc. Density estimation and visualization are used to examine large amount of trajectory data to model hot spots and interactions. We demonstrate both density surface mapping6 and density volume rendering7. We also include a couple of other exploratory data analyses (EDA) and visualizations tools, such as Google Earth animation support and connection analysis. The suite of analytical as well as visual methods presented in this paper may be applied to any trajectory data for space-time activity studies.

A suite of spatiotemporal processing methods are presented to analyze human trajectory data, such as that collected using a GPS device, for the purpose of modeling pedestrian space-time activities.

ניתוח נתונים תלולים מסלול לחקר חלל פעילות הולכי רגל בזמן

It is well recognized that human movement in the  spatial and temporal dimensions has direct influence on disease transmission1-3.  An infectious disease ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

שיטת Immunofluorescent לאפיון של תאי הוושט של בארט

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

פרוטוקול לlentiviral התמרה וניתוח במורד הזרם של המעיים Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

הכין ליבות רקמות פרפין מוטבע פורמלין-קבועות הוא רנ&quot;א הפקת DNA

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

-Cut ההיברידי: שיטת חתך משופרת עבור דוגמאות רקמות צמח סרבן

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

הפיוניות הקלטת-פיל: שיטה משופרת עבור הכנת הדוגמא משמר תא

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...