Name: improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses
Uploaded: 2016-07-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
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We would like to thank Ainara Ruiz de Sabando for providing H&amp;E images. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (DK052230, DK093680 and CA172113) awarded to Dr. Vincent W. Yang.

1. 마우스 <ol><li> 마우스와 관련된 모든 연구는 스토니 브룩 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 마우스는 12시 12분 시간의 명암주기를 유지 하였다. <ol><li> 상업적으로 C57BL / 6 마​​우스를 얻을 수 있습니다. 에 loxP 사이트에 의해 형벌 Klf5 대립 유전자 (Klf5 f를 L / F 리터)을 들고 C57BL / 6 마우스를 얻습니다. 이 마우스는 이전에 (21)을 설명하고 우아 박사 료조 나가이에 의해 제공되었다. </li></ol></li><li> Lgr5 프로모터 (Lgr5-EGFP / CreERT2 마우스)의 규정에서 유도 Cre 호텔의 재조합 효소 유전자를 운반하는 C57BL / 6 마​​우스를 구입하십시오. </li><li> Lgr5-EGFP / CreER T2 / Klf5 f를 L / f를 리터 마우스를 설정하려면, 교차 Klf5 FL / F Lgr5-EGFP / CreER T2 마우스와 다음 Klf5 FL / F 리터의 자손을 역 교배 리터 마우스 </SUP&gt; 마우스. </li><li> 프로토콜에 따라 타목시펜으로 치료 마우스는 이전 22 설명했다. 연속 5 일 동안 멸균 옥수수 기름에 용해 타목시펜 1 밀리그램 (10 ㎎ / ㎖) 8 주령의 실험 및 대조군 마우스의 복강 (IP)을 주입한다. </li><li> 첫 번째 타목시펜 주사 후 14 일에서 2 가스 소스를 CO에 연결 챔버에 배치하여 CO 2 질식을 사용하여 마우스를 희생. 마우스 의식하고 모든 움직임이 중단 될 때까지 가스가 챔버로 유입 할 수 있습니다. 안락사는 자궁 경부 전위를 수행 할 수 있도록합니다. </li></ol> 2. 조직 준비 및 스위스 롤링 <ol><li> 해부 집게와 가위를 사용하여 복부 쪽의 피부에 절개를 잘라. 포셉 한 쌍으로, 절개 부위의 피부를 잡고 부드럽게 떨어져 복부 근육 조직에서 빼냅니다. 복부 근육을 복부 피부를 잘라 노출 가위를 사용합니다. </li><li> 잡고 흥을 끌어포셉으로 ritoneum. 잡고 창자에서 당겨 할 수 없습니다 있는지 확인하십시오. 조심스럽게 복막 조직의 절개를하고 복부 근육을 노출 피부를 멀리 절단을 계속합니다. 조심스럽게 복부 근육의 절개를하고 장을 노출을 멀리 절단을 계속합니다. </li><li> 콜론를 확인하고는 직장 / 항문을 조인 말단부에 추적. 가위로, 가능한 한 항문에 가깝게 잘라. </li><li> 위를 확인하고는 소장과 결합 위치를 추적. 가위로 약 1cm 떨어진 위장에서 소장 무료 잘라. 인산염 완충 식염수 (PBS)를 포함하는 깨끗한 페트리 접시에 해제 소장과 대장의 전체 길이를 전송합니다. </li><li> 한 손 또는 집게 쌍으로 결장의 말단부를 잡고있는 장간막 부드럽게 결합 및 / 또는 지방 조직에서 콜론의 전체 길이를 해명 한편을 사용한다. </li><li> 맹장을 식별(작은 크고 작은 창자 사이 파우치)과 맹장과 결장은 대장을 무료로 (콜론의 기단부)에 가입 위치를 잘라. </li><li> 한 손이나 집게 한 쌍으로, 소장을 잡고 조심스럽게 모든 장간막 결합 및 / 또는 지방 조직에서 소장의 전체 길이를 해명하기 위해 다른 손을 사용합니다. 맹장을 절취하고 필요가없는 경우 버린다. 밤새 처리가 DH (2 O 50 % 에탄올 / 5 % 아세트산)의 변형 Bouin 정착액의 밖으로 해부 창자 배양하여 여기에 정지 될 수 있고, 다음 날의 절차를 계속 참고. </li><li> 소장 (소장 또는 대장)의 하나의 세그먼트를 처리, 수정 Bouin의 정착과 함께 10 ML의 주사기를 작성하고 그것에 위관 바늘을 연결합니다. 장 세그먼트 (segment)의 전방 구멍에 반 센티미터에 대해 바늘을 삽입합니다. </li><li> 악기에 확실히 압력을인가함으로써 장 구간 안에 위관 니들을 잡아장 세그먼트. 한편 주사기 채 수정 Bouin의 정착액을 이용하여 장 구간의 내용을 플러시 완만하지만 일관된 압력을 적용한다. 이 단계는 장 세그먼트 즉시 고정 동시에 청소를 할 수 있습니다. 플로우를 통해 폐기물을 수집하는 페트리 접시를 사용합니다. 고정 불투명 선회 결장 색으로 관찰 할 수있다. 참고 : 세척하거나 장 세그먼트가 오픈 버스트 수있는 동안 너무 많은 압력을 가하지 않도록해야합니다. </li><li> 가위를 사용하여 장간막 라인을 따라 길이 방향으로 장 세그먼트를 열 잘라. 한 쌍의 겸자로 잡아하고 PBS를 함유하는 페트리 접시에 간단히 린스. <ol><li> 근위부, 중간 및 원위부 : 3과 동일 세그먼트로 소장을 잘라. 근위 세그먼트는 위 다음 바로 하나이며, 말단 부분은 콜론 전에 즉시 하나입니다. 근위 세그먼트에 십이지장, 소장의 중간 및 말단에 해당회장. </li><li> 각 세그먼트의 근위 및 원위 단부를 표시한다. 선단부는 원래 위를 향해 가리키는 된 하나는 콜론으로 지적 말단이다. </li></ol></li><li> 세정 및 열 장 세그먼트를 배치하는 페트리 접시의 상단을 사용합니다. 내강면이 위를 향하도록 장 세그먼트를 배치합니다. <ol><li> 콜론의 경우, 그것의 폭을 가로 질러 실행 variegations / 능선에 의해 내강면을 식별하고 기단부에 존재한다. 중간 및 말단 영역은 길이 방향으로 실행 일부 variegations 있습니다. 소장의 경우, 융모를 표시하는 거친 나타나는 표면에 의해 내강 측을 식별합니다. 참고 : 작은 창자를 들어, 근위부, 중간 및 말단 영역의 외부 육안 해부학 적 경계가 없습니다. 그러나이 지역은 현미경 섹션에서 확인 할 수있다. 그들이 곳 융모는 말단 점차 짧아 인접 지역에서 가장 오래되고이 될길이가 짧은. 미시적으로는 결장 음와은 리지의 존재에 의해 식별 될 수있는 인접 영역의 최단이다. 대장 지하실 아직 인접 지역에 비해 여전히 키가 말초 지역의 중앙부에서 가장 높은 짧은이다. </li></ol></li><li> 스위스 결장 롤링 진행합니다 : <ol><li> 평면 오픈 콜론을 유지하고 페트리 접시의 가장자리를 향해 그 기단부에서 집게로 잡아 당깁니다. </li><li> 이 위를 향하도록 내강면을 유지하고 한 손으로 집게로 근위 끝을 잡고 다른 손으로 이쑤시개를 개최합니다. </li><li> 집게를 사용하여 이쑤시개 주위의 기단부의 가장자리를 감싸 약간 제자리에 고정하기 위해 이쑤시개에 랩 가장자리를 끼. </li><li> 부드럽게 천천히 스위스 롤을 형성하기 위해 이쑤시개 주위에 결장 롤 손가락으로 이쑤시개를 압연 시작합니다. </li><li> 전체 대장의 길이가 겹쳐서되면, 조심스럽게 C를 슬라이드 집게 한 쌍을 사용하여이쑤시개 오프 및 조직 처리 / -embedding 카세트에 olon 스위스 롤. 실온에서 하룻밤 동안 10 % 포르말린에 카세트를 놓습니다. </li></ol></li><li> 스위스 소장 롤링 진행합니다 : <ol><li> 한 번에 하나의 세그먼트를 처리, 내강면이 평면 오픈 세그먼트를 주기적으로 업데이트하여 페트리 접시의 가장자리를 향해 그 기단부에서 집게로 잡아 당깁니다. </li><li> 대장에 기재 한 바와 같이 스위스 압연을 진행합니다. </li></ol></li><li> 파라핀 삽입에 대한 포르말린 고정 조직을 처리를 진행합니다. 다음과 같이 진행하십시오 : 참고 : (자세한 내용은 자재 및 장비의 참조) 자동화 된 프로세서를 사용합니다. <ol><li> 조직 카세트 중일 고착성이 완전히 제거 될 때까지, PBS로 조직을 헹군다. </li><li> 다음 순서에 따라 에탄올을 이용하여 조직을 탈수 : 50 %의 에탄올을 10 분, 70 % 에탄올에서 10 분, 80 % 에탄올에서 10 분, 10 분, 95 % 에탄올, 10 분 동안 100 % 에탄올, 100 % 에탄올 10 분간 , 110 분 00 % 에탄올. </li><li> 다음 순서 자일 렌과의 교류 에탄올 : 2 : 1의 에탄올 : 10 자일 렌 - 15 분, 1 : 1 에탄올 : 10 자일 렌 - 15 분, 1 : 2 에탄올 : 10 자일 렌 - 10 15 분, 100 % 크실렌 - 15 분 10 100 % 크실렌 - 15 분 10 100 % 크실렌 - 15 분. 주의 : 크실렌 따라서 직장이 적절한 후드와 직원이 착용해야 적절한 보호 장비와 국소 배기 장치가 장착되어 있어야 건강에 유해하다. </li><li> 파라핀과의 교류 크실렌. 2 : 1 크실렌 30 분간 파라핀, 1 : 1 크실렌 30 분간 파라핀, 1 : 1 크실렌 30 분간 파라핀, 100 % 파라핀 58 °의 C - 오븐 (54)에 설정된 진공에서 다음 단계를 수행 1 - 2 시간, 1 100 % 파라핀 - 2 시간 또는 하룻​​밤. 참고 :이 파라핀 중합체를 분해하고 단단하고 부서지기 쉬운 것 때문에 파라핀 시간의 연장 기간 동안 60 ° C를 넘지 않도록하십시오. </li><li> 드 신선한 새로운 파라핀과 동양 조직에 포함파라핀이 경화되기 전에 희망하는. 스위스 롤의 경우, 조직 paraffinization 다음, 파라핀 삽입하는 동안 옆에 각 롤의 위치를​​ 변경하는 것이 중요합니다. 이 절단시 각 롤의 전체 길이의 부분이 생성 될 것임을 보장한다. </li></ol></li><li> 염색의 경우, 마이크로톰을 사용하여 5 μm의 두께 부분을 잘라. ; 충전 슬라이드에 섹션을 수집하고 오븐에서 밤새 65 ° C에서 그 (빵)을 건조 실온에 시원하고 연속적으로 염색을 위해 그들을 사용 할 수 있습니다. 주 : 소성 시간은 1로 단축 할 수있다 - 슬라이드 얼마나 갓 절단에 따라 2 시간. 절편 이후 한 달 미만의 경우는 하룻밤 구워하는 것이 좋습니다. 한 달 이상 되었다면, 1 - 2 시간의 소성 시간을 저장하기에 충분하다. 시간이 부족하면, 밤새 백업은 항상 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. 조직 학적 분석 및 면역 형광 염색법 조직 학적 분석 및 immunoflu를 수행orescence 염색은 이전의 수정, 23, 24을 설명했다. 강화 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 면역의 경우 : <ol><li> 1 시간 동안 65 ° C 오븐에서 슬라이드 구워 내생 알칼리 포스 파타 아제 활성을 비활성화하고 이후 자일 렌에 deparaffinize. </li><li> 내인성 퍼 옥시다아제 조직을 차단 메탄올 중 3 % 과산화수소 욕 섹션을 인큐베이션; 다음 10 분 동안 125 ° C에서 구연산 완충액 항원 회수 하였다 감소 알코올 욕 시리즈 (100 %, 95 %, 70 %)에서 배양 (10 mM의 시트르산 나트륨, 0.05 % 트윈 20, pH를 6.0) 재수 decloaking 챔버를 사용하여. </li><li> 소수성 장벽을 제공 펜을 표시하여 조직 섹션 주위에 원을 그리고 (EGFP에 대한 일차 항체로 다음 희석 한을 37 ° C에서 30 분 동안 (TBS-트윈 2.5 % 소 혈청 알부민 [BSA]) 버퍼를 차단과 함께 섹션을 품어 : 밤새 가습 실에서 4 ° C에서 500) 부드럽게 흔들어 섞으면.</li><li> 부분을​​ 세척하고 37 ℃에서 30 분 동안 적절한 농도로 형광 표지 된 이차 항체와 함께 품어. </li><li> 훽스트 2 차 항체 처리 및 얼룩 핵 후 슬라이드를 세척하고 설치 미디어를 탑재합니다. <ol><li> Klf5 / EGFP / 기-67 공동 염색의 경우, 프로세스 슬라이드 단계 3.1에 ​​설명 된대로 - 3.3 Klf5 항체 (희석 1 : 150)을 배양하여 Klf5 염색을 수행 하룻밤. </li><li> 프로토콜에 따라 슬라이드에 토끼 AP 폴리머 검출을 적용합니다. </li><li> Klf4는 제조 업체의 프로토콜에 따라 발색 면역 조직 화학 염색을 이용하여 염색 알 수있다. </li><li> 이전에 기술 된 프로토콜 25을 사용하여 항체 용출을 수행합니다. 글리신 - SDS에서 50 ° C (산도 2.0) 1 시간 동안 교반 솔루션에서 슬라이드를 품어. </li><li> 세척하고 증류수로 충분히 슬라이드 및 37 ° C에서 30 분 동안 (TBS 트윈 - 2.5 %의 BSA) 블로킹 완충액으로 배양한다. </li><li> 기-67 추가 (희석 1 : 500)와 EGFP (희석 1시 50분0) 동시에 항체 및 1 시간 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> (데이터는 도시하지 않음) 훽스트 염색하기 전에 적절한 보조 항체와 형광 검출을 수행하고 매체를 장착 마운트. </li></ol></li><li> 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E) 26 5 μm의 섹션을 염색에 조직의 조직 학적 형태를 관찰한다. 형광 이미지의 각각 EGFP, Klf5 및 기-67 염색을 시각화 535, 646, 700의 방출 파장을 사용합니다. </li></ol>

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A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

스위스의 압연 기술은 대규모 조직 학적 및 형태 학적 평가 소장 조직을 제조하기위한 강력한 방법이다. 원래 동결 절편 (18, 19)의 제조를 위해 개발 된 전술 스위스 압연 기술과는 대조적으로, 여기에서 제시된 방법은 포르말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직에 대한 신속한 장 준비 및 고정 할 수있다. 냉동 된 조직과 비교 FFPE 조직 훨씬 긴 수명을 갖고 있기 때문에 더 조직 무결성 조직 학적...

포유류 장 상피 원주 세포의 단일 층을 포함한다. 분화 된 세포가 융모의 영역을 차지하면서 소장에서 증식 세포 지하실에 국한된다. 대장에는 융모 없기 때문에 그러나 증식 세포 지하실의 바닥에 지역화 및 분화 세포 소낭의 상부 영역을 차지한다. 지하실 내 증식 성 세포의 연속 분할에 의해 구동된다 - (5 일 3) 장 상피 신속한 보급을 겪는다. 지하실의 증식 성 세포는 균질 집단 아니며 상기 줄기 세포와 교통 증폭 (TA) 셀 (1)로 세분화된다. 이 바로 아래에서 5 세포 - 줄기 세포는 제 4 내 토굴 하단에 상주. 굴베이스 기둥 (CBC) 줄기 세포 및 예비 정지 줄기 세포 : 현재의 모델은 두 가지 줄기 세포 유형의 존재를 지원한다. CBC의템 세포는 활발하게 증식하고 류신이 풍부한 반복 포함하는 G 단백질 결합 수용체 5 (Lgr5) 3, Olfactomedin 4 (Olfm4) 4 Achaete의 방패 꼴의 뼈 조각 같은 2 (Ascl2) (5)로 표시됩니다. 한편, 예비 정지 줄기 세포는 B 세포 특이 몰 로니 뮤린 백혈병 바이러스 통합 위치 1 (BMI1) 6 마우스 텔로 머라 제 역전사 (mTert) (7)에 의해 표시되어, HOP 호 메오 박스 (Hopx) 8 Doublecortin 형 캠 키나제 -like 1 (Dclk1) (9), 및 류신이 풍부한 반복 및 면역 글로불린 같은 도메인 1 (Lrig1) 10. 능동적 증식 줄기 세포를 흡수 셀 (장 세포) 및 분비 세포 (장 내분비, 잔, Paneth 및 다발 세포)로 분화를 더 받아야 TA 세포 일으킨다. 그들은 세포 사멸을 받아야하고있는 융모의 상단에 도달 할 때까지 증식 영역에서 지속적인 세포 분열은 토굴-융모 축을 따라 상피 세포의 상향 이동 결과상피의 표면으로부터 벗겨진. 장 상피 세포의 종류 (예를 들어, 장 배 세포가 리소자임에 대한 항체 및 MUC2 Paneth 세포에 대한 항체로 염색하여 인식 할 수있다) 별개의 단백질의 발현에 의해 표시된다. 우리는 장 상피 11-13의 항상성 및 병리 생물학에서 크 룹펠 같은 요인 (KLFs)의 역할을 연구한다. 변형 스위스 - 롤링 방법의 타당성을 지원 여기에 제시된 결과는 활발히 증식 장내 상피 줄기 세포 (14)의 유지 보수 크 룹펠 형상 인자의 역할 5 (KLF5)의 이전 연구에 기초한다. KLF5는 매우 활성 장 줄기와 TA 세포 (12)로 표현된다 아연 손가락 전사 인자이다. 이전 연구는 KLF5이 기-67, 장 지하실에서 알려진 증식 마커와 공동으로 표현되는 것을 보여 주었다. 위장 TR<html> 행위는 구조적으로 또는 기능적으로 균일 한 조직이 아니다. 소장은 근위부, 중간, 말단 부분으로 나누어 후자의 추가와 함께, 십이지장, 공장 및 회장과 맹장과 결장으로 대장으로 구분된다. 이 섹션은 각각 고유의 조직 학적 특징을 가지고 있으며, 서로 다른 역할 (15)을한다. 이와 같이, 욕설 효과 및 장 상피 세포의 반응의 정도를 연구 조직 (16)의 영역에 의존 할 수있다. 또한, 다양한 마우스 균주는 시험 16에 사용 모독의 유형에 기초하여 조직 학적 수준의 응답의 다양성을 증명한다. 따라서, 티슈 제조 어울리는하여 적절한 조직 학적 및 장 조직의 분자량 분석을 허용 할 필요가있다. 이와 같이, 스위스 롤 기술을 부여 한 번에 장 상피 세포의 전체 길이의 분석 따라서 포괄적 인 정보를 기반으로 박식 한 결론을 확인한다. e_content &quot;&gt; 스위스 롤 기법 제 매그너스 (17)에 의해 언급 한 Moolenbeck 및 Ruitenberg 및 공원 등에 의해 상세하게 설명 하였다. 조직을 준비하고 조직학을 수행하는 방법은 쥐 소장 18,19 각각. 프로토콜 분석으로 진단 목적을위한 적절하고 신뢰성있는 티슈 제조 허용 일본어 방법의 개선 된 버전이 공보에 제시 묘사. 이러한 변형 기술은 효율적인 수집 및 면역 조직 화학, 면역뿐만 아니라 세계적으로 사용되는 기술에 대한 장 상피 세포의 제조를 허용 추가 평가를 위해 (형광 및 발색 20) 현장 하이브리드에있다. 또한, 제조 방법 표본 수정 된 조직은 신속한 조직 고정하는 방법을 제공하는 동안 쉽게 사용 가능하고 상대적으로 저렴한 시약을 이용하여 단백질, DNA의 복구를 위해 수 있으며, RNA. 카메라 함께 생의 기술은 장 상피 세포의 조직 병리학 병리학, 분자 기능의 종합 평가 우수하다.

<table><tbody><tr><td>Stainless Steel Dissecting Kits</td><td>VWR</td><td>25640-002</td><td></td></tr><tr><td>Decloaking Chamber</td><td>Biocare Medical</td><td>DC2012</td><td></td></tr><tr><td>Syringe 10 ml</td><td>VWR</td><td>89215-218</td><td></td></tr><tr><td>Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid</td><td>Simport</td><td>M515</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides [size: 25 x 75 x 1 mm]</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Manual Slide Staining Set</td><td>Tissue-Tek/Sakura</td><td>4451</td><td></td></tr><tr><td>Staining Dish Green</td><td>Tissue-Tek/Sakura</td><td>4456</td><td></td></tr><tr><td>Staining Dish White</td><td>Tissue-Tek/Sakura</td><td>4457</td><td></td></tr><tr><td>24-Slide Slide Holder with Detachable Handle</td><td>Tissue-Tek/Sakura</td><td>4465</td><td></td></tr><tr><td>Oven</td><td>Thermo Scientific</td><td>6243</td><td>for baking slides at 65 degree</td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000C</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 90i</td><td>Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X</td></tr><tr><td>PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini</td><td>Fisher Scientific</td><td>DAI-PAP-S-M</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>AAPR</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>AAPR</td><td>281000ACS</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>X5P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide 25% solution in water</td><td>ACROS</td><td>202465000</td><td></td></tr><tr><td>10% bufered formalin</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-026-213</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum fraction V, heat shock</td><td>Roche</td><td>3116956001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279</td><td></td></tr><tr><td>Gavage needle</td><td>VWR</td><td>20068-624</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti Klf5 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-22797</td><td>Dilution 1:150</td></tr><tr><td>Chicken anti EGFP antibody</td><td>Millipore</td><td>AB16901</td><td>Dilution 1:500</td></tr><tr><td>Rabbit anti Ki67 antibody</td><td>Biocare Medical</td><td>CRM325B</td><td>Dilution 1:500</td></tr><tr><td>Mach3 rabbit AP polymer detection kit</td><td>Biocare Medical</td><td>M3R533L</td><td></td></tr><tr><td>Warp red chromogen kit</td><td>Biocare Medical</td><td>WR806 H</td><td></td></tr><tr><td>Lgr5-EGFP/CreER&lt;sup&gt;T2&lt;/sup&gt; mice&amp;nbsp;</td><td>Jackson labs</td><td>008875&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Automated processor</td><td>Leica</td><td>Leica TP1020</td><td></td></tr></tbody></table>

improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

면역 조직 화학 염색과 함께 스위스 압연 기술은 작거나 큰 장 조직의 포괄적 인 분석이 가능합니다. C57BL / 6 마우스 (그림 1)의 대장의 H &amp; E 염색의 예는 타당성의 그림과이 기술의 효과이다. 근위, 중간 및 말단도 1에 도시 된 바와 같이, 화상이 대장 모든 부분을 캡쳐 할 수있다. 따라서, 광범위한 조직 학적 평가를 허용한다. 스위스 롤과 크고 ?...

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Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

정확한 식별 및 장 점막 안감을 따라 상피 세포의 위치는 다른 세포 계보를 정의하는 것이 필수적이다. 장 조직의 적절한 촬상 최대 해상도 단백질 발현 패턴을 식별하기 위해 중요하다. 이 연구는 처리 마우스 장 조직을위한 최적의 방법과 조건을 서술하는 것을 목표로하고있다.

면역 조직 화학적 및 면역 형광 분석을위한 창자 조직 준비를위한 향상된 스위스 압연 기술

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

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Research

JoVE Journal

Biology

68.4K 조회수.  Stony Brook University School of Medicine.  정확한 식별 및 장 점막 안감을 따라 상피 세포의 위치는 다른 세포 계보를 정의하는 것이 필수적이다. 장 조직의 적절한 촬상 최대 해상도 단백질 발현 패턴을 식별하기 위해 중요하다. 이 연구는 처리 마우스 장 조직을위한 최적의 방법과 조건을 서술하는 것을 목표로하고있다. 

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Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS)

Colitis can occur from viral or bacterial infections, ischemic insult, or autoimmune disorders; most notably Ulcerative Colitis and the colonic variant of Crohn&rsquo;s Disease - Crohn&rsquo;s Colitis. Acute colitis may present with abdominal pain and distention, malabsorption, diarrhea, hematochezia and mucus in the stool. We are beginning to understand the complex interactions between the environment, genetics, and epithelial barrier dysfunction in Inflammatory Bowel Disease and animal models of colitis have been essential in advancing our understanding of this disease. One popular model involves supplementing the drinking water of mice with low-molecular weight Dextran Sodium Sulfate (DSS), resulting in epithelial damage and a robust inflammatory response in the colon lasting several days 1.Variations of this approach can be used to model acute injury, acute injury followed by repair, and repeated cycles of DSS interspersed with recovery modeling chronic inflammatory diseases 2. After a single four-day treatment of 3% DSS in drinking water, mice show signs of acute colitis including weight loss, bloody stools, and diarrhea. Mice are euthanized at the conclusion of the treatment course and at necropsy dissected colons are processed and can be 'Swiss rolled" 3 to allow microscopic analysis of the entire colon or infused with formalin as "sausages" to allow macroscopic analysis. Tissue is then embedded in paraffin, sectioned, and stained for histologic review.

Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium DSS

Dextran sulfate sodium (DSS) administered in the drinking water is an established murine inflammatory injury model of acute colitis. This protocol outlines the method for DSS treatment and the preparation of tissues.

Dextran의 황산 나트륨 (DSS)를 사용 Murine 대장염 모델링

Colitis can occur from viral or bacterial infections, ischemic insult, or autoimmune disorders; most notably Ulcerative Colitis and the colonic variant of ...

연구

생물학

A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe the use of a simple device to cut and &#8216;roll&#8217; mouse intestines to rapidly prepare whole mount preparations of superior and uniform quality to that which can be achieved by hand. The device comprises a base that holds 4 stainless steel rods and a top, which acts a cutting guide. The rods are inserted into the lumen of the small intestine [divided into thirds] and the colon. The rods and samples are then placed over a piece of filter paper or card into the holding slots in the base of the device. The top of the device is then positioned and serves as a cutting guide. The two angled sections in the center of the top piece are used to guide a knife or scalpel and cut the intestines longitudinally on the top of the rods. Once the intestinal sections have been cut, the top is removed and the card,&#160;tissue and rods gently removed from the device and placed on the bench. The rods are then gently rolled sideways to flatten and stick the intestinal segments onto the underlying piece of filter paper or card. The final preparation can then be examined or fixed and stored for later analysis. The preparations are invaluable for the study of intestinal changes in normal or genetically modified mouse models. The preparations have been used for the study and quantification of the effects of inflammation (colitis), damage, pre-cancerous lesions (aberrant crypt foci (ACFs) and mucin depleted foci (MDFs)) and polyps or tumors.

The use of a simple device to cut and &#8216;roll&#8217; mouse intestines to rapidly prepare whole mount preparations is described.

간단한 장치는 빠르게 마우스 소장의 전체 마운트를 준비하는 방법

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe ...

의학

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

신선한 냉동 인간 조직에서 장의 중추의 격리에 대 한 레이저 캡처 서의 최적화

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

신경과학

Systematic Scoring Analysis for Intestinal Inflammation in a Murine Dextran Sodium Sulfate-Induced Colitis Model

Murine colitis models are tools that are extensively employed in studies focused on understanding the pathobiology of inflammatory intestinal disorders. However, robust standards for objective and reproducible quantification of disease severity remain to be defined. Most colitis analysis methods rely on limited histological scoring of small segments of intestine, leading to partial or biased analyses. Here, we combine high-resolution image acquisition and longitudinal analysis of the entire colon to quantify intestinal injury and ulceration in the dextran sodium sulfate (DSS) induced model of murine colitis. This protocol allows for the generation of objective and reproducible results without extensive user training. Here, we provide comprehensive details on sample preparation and image analysis using examples of data from DSS induced colitis. This method can be easily adapted to other models of murine colitis that have significant inflammation associated with mucosal injury. We demonstrate that the fraction of inflamed/injured and eroded/ulcerated mucosa relative to the complete length of the colon closely parallels clinical findings such as weight loss amid DSS-induced disease progression. This histological protocol provides a reliable time and cost-effective aid to standardize analyses of disease activity in an unbiased way in DSS colitis experiments.

Systematic scoring of intestinal inflammation using a free computer-assisted system is a powerful tool to quantitatively compare histopathological changes in colitis models characterized by the presence of ulcers and inflammatory changes. Histological colitis score evaluation strengthens clinical observations and facilitates data interpretation.

뮤린 Dextran 나트륨 황산염 유도 대장염 모형에 있는 장 염증을 위한 체계적인 채점 분석

Murine colitis models are tools that are extensively employed in studies focused on understanding the pathobiology of inflammatory intestinal disorders. ...

면역학 및 감염병학

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota and the vertebrate gut. The spatial landscape of the gut microbiota is tightly controlled by physical features - intestinal mucus, crypts, and folds - and is affected by host-controlled properties such as pH, oxygen availability, and immune factors. These properties limit the ability of commensal microbes and pathogens alike to colonize the gut stably. At the micron-scale, microbial organization determines the close-range interactions between different microbes as well as the interactions between microbes and their host. These interactions then affect large-scale organ function and host health.
This protocol enables the visualization of the gut microbiota spatial organization from distances between cells to organ-wide scales. The method is based on fixing gut tissues while preserving intestinal structure and mucus properties. The fixed samples are then embedded, sectioned, and stained to highlight specific bacterial species through fluorescence in situ hybridization (FISH). Host features, such as mucus and host cell components, are labeled with fluorescently labeled lectins. Finally, the stained sections are imaged using a confocal microscope utilizing tile-scan imaging at high magnification to bridge the micron to centimeter length scales. This type of imaging can be applied to intestinal sections from animal models and biopsies from human tissues to determine the biogeography of the microbiota in the gut in health and disease.

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

This streamlined protocol details a workflow to detect and image bacteria in complex tissue samples, from fixing the tissue to staining microbes with fluorescent in situ hybridization.

시투 혼성화, 렉틴 염색 및 이미징에서 형광을 통한 장내 미생물군유립 상호 작용의 시각화

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota ...

Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice

With the increase of incidence, inflammatory bowel diseases (IBD), which are chronic diseases affecting the gastrointestinal tract, impose a considerable health and financial burden on individuals and society. Therefore, it is critical to investigate the mechanisms underlying the pathogenesis and development of IBD. Here, a gut microbiota antigen-specific T cell transfer colitis model is described. CBir1 flagellin has been recognized as the immunodominant gut bacterial antigen in experimental colitis and patients with Crohn&#39;s disease. CBir1 TCR transgenic na&#970;ve CD4+ T cells, specific to CBir1 flagellin, can induce chronic colitis after adoptive transfer into immune-deficient Rag1-/- mice. The disease severity is assessed by histopathology. The CD4+ T cell phenotypes in colonic lamina propria are also determined. This model closely resembles the development of IBD, which provides an ideal murine model for investigating the mechanisms driving the pathogenesis of IBD and testing the potential drugs for treating IBD.

Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice

In this protocol, a gut microbiota antigen-specific T cell adoptive transfer colitis model is described. CD4+ T cells are isolated from CBir1 TCR transgenic mice. These are specific for an immunodominant gut microbiota antigen CBir1 flagellin, which is transferred into recipient Rag1-/- mice, leading to intestinal inflammation.

CBir1 TCR 형질 전환 CD4+ T 세포의 입양 전달에 의한 장 염증유도

With the increase of incidence, inflammatory bowel diseases (IBD), which are chronic diseases affecting the gastrointestinal tract, impose a considerable ...

Use of Anti-phospho-girdin Antibodies to Visualize Intestinal Tuft Cells in Free-Floating Mouse Jejunum Cryosections

The actin binding protein girdin is a cytosolic protein that is required for actin remodeling to trigger cell migration in various tissues. Girdin is phosphorylated by both receptor and non-receptor tyrosine kinases at tyrosine 1798. Omori et al. developed site- and phosphorylation status-specific antibodies against human girdin at tyrosine-1798 (pY1798), which specifically bind to phosphorylated tyrosine-1798, but not to unphosphorylated tyrosine-1798. pY1798 antibodies have been used to specifically label tuft cells (TCs) that are present in mammalian gastrointestinal tissues, but the function of these cells is unclear. This protocol allows the robust visualization of TCs in the jejunum using pY1798 antibodies and immunofluorescence. To ensure successful and simple TC visualization, this protocol includes two histological techniques: production of free-floating cryosections from gelatin-filled jejunum tissue, and low-temperature antigen retrieval at 50 &#176;C for 3 h. Filling the jejunum with gelatin maintains the shape of free-floating sections throughout the staining procedure, whereas low-temperature antigen retrieval ensures robust signals from TCs. Successful use of this protocol results in pY1798 staining of TCs distributed from villus tip to crypt. Stained TCs have a spool-shaped soma and fluorescent signals condense at the lumenal tip, which corresponds to the protruding &#39;tuft.&#39;&#160;Phalloidin staining colocalized with pY1798-positive TCs at the thickened brush border, and corresponds to a rootlet mass extending from the TC tuft. This protocol could be used to examine TCs in human biopsy samples collected with gastrointestinal endoscopes. Furthermore, TCs were recently reported to accumulate following parasite infection in mice, suggesting that this protocol could have applications for diagnosis of parasite infections in the human gut.

Kuga et al. discovered that phosphorylation-status specific antibodies against the actin binding protein girdin phosphorylated at tyrosine 1798 (pY1798) can be used to label tuft cells (TCs). This protocol allows robust visualization of TCs using immunofluorescent staining of free-floating jejunum cryosections with pY1798 antibodies.

장 술 셀 부동성 마우스 공장 Cryosections에 시각화에 안티 인 girdin 항 체의 사용

The actin binding protein girdin is a cytosolic protein that is required for actin remodeling to trigger cell migration in various tissues. Girdin is ...

Evaluation and Quantification of Micro Epithelial Gaps in the Colonic Mucosa using Immunofluorescence Staining

Epithelial cells lining the intestinal mucosa create a physical barrier that separates the luminal content from the interstitium. Epithelial barrier impairment has been associated with the development of various pathologies such as inflammatory bowel diseases (IBD). In the inflamed mucosa, superficial erosions or micro-erosions that corrupt epithelial monolayers correspond to sites of high permeability. Several mechanisms have been implicated in the formation of micro-erosions including cell shedding and apoptosis. These micro-erosions often represent microscopic epithelial gaps randomly distributed in the colon. Visualization and quantification of those epithelial gaps has emerged as an important tool to investigate intestinal epithelial barrier function. Here, we describe a new method to visualize the specific location of where transcellular and paracellular permeability is enhanced in the inflamed colonic mucosa. In this assay, we apply a 10 kDa fluorescent dye conjugated to a lysine fixable dextran to visualize high permeability regions (HPR) in the colonic mucosa. Additional use of cell death markers revealed that HPR encompass apoptotic foci where epithelial extrusion/shedding occurs. The protocol described here provides a simple but effective approach to visualize and quantify micro-erosions in the intestine, which is a very useful tool in disease models, in which the intestinal epithelial barrier is compromised.

<meta charset="utf8"></head><body>Evaluation and Quantification of Micro Epithelial Gaps in the Colonic Mucosa using Immunofluorescence Staining

Here, we describe a new method to visualize the specific location of where transcellular and paracellular permeability is enhanced in the inflamed colonic mucosa. In this assay, we apply a 10 kDa fluorescent dye conjugated to a lysine fixable dextran to visualize high permeability regions (HPR) in the colonic mucosa.

Epithelial cells lining the intestinal mucosa create a physical barrier that separates the luminal content from the interstitium. Epithelial barrier ...

장 조직의 고품질 면역염색을 위한 효율적인 Swiss Roll Method

Optimized Protocol for Intestinal Swiss Rolls and Immunofluorescent Staining of Paraffin Embedded Tissue

The intestine is a complex organ composed of the small and the large intestines. The small intestine can be further divided into duodenum, jejunum, and ileum. Each anatomical region of the intestine has a unique function that is reflected by differences in cellular structure. Investigating changes in the intestine requires an in-depth analysis of different tissue regions and cellular alterations. To study the intestine and visualize large pieces of tissue, researchers commonly use a technique known as intestinal Swiss rolls. In this technique, the intestine is divided into each anatomical region and fixed in a flat orientation. Then, the tissue is carefully rolled and processed for paraffin embedding. Proper tissue fixation and orientation is an often-overlooked laboratory technique but is critically important for downstream analysis. Additionally, improper Swiss rolling of intestinal tissue can damage the fragile intestinal epithelium, leading to poor tissue quality for immunostaining. Ensuring well-fixed and properly oriented tissue with intact cellular structures is a crucial step that ensures optimal visualization of intestinal cells. We present a cost-effective and simple method for making Swiss rolls to include all sections of the intestine in a single paraffin-embedded block. We also describe optimized immunofluorescence staining of intestinal tissue to study various aspects of the intestinal epithelium. The following protocol provides researchers with a comprehensive guide to obtaining high-quality immunofluorescence images through intestinal tissue fixation, Swiss-roll technique, and immunostaining. Employing these refined approaches preserves the intricate morphology of the intestinal epithelium and fosters a deeper understanding of intestinal physiology and pathobiology.

저자 스포트라이트: 장 세포 생물학 연구를 위한 효과적인 면역형광 염색 프로토콜

The intestine is vital for digestion and absorption. Each region-duodenum, jejunum, ileum, colon-serves distinct functions due to unique cellular structures. Studying intestinal physiology demands meticulous tissue analysis. This protocol outlines tissue fixation and processing using the Swiss roll technique, ensuring accurate immunostaining through proper tissue preservation and orientation.

Intestinal Swiss Rolls 및 파라핀 포매 조직의 면역형광 염색에 최적화된 프로토콜

The intestine is a complex organ composed of the small and the large intestines. The small intestine can be further divided into duodenum, jejunum, and ...

면역 조직 화학적 및 면역 형광 분석을위한 창자 조직 준비를위한 향상된 스위스 압연 기술

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Dextran의 황산 나트륨 (DSS)를 사용 Murine 대장염 모델링

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뮤린 Dextran 나트륨 황산염 유도 대장염 모형에 있는 장 염증을 위한 체계적인 채점 분석

시투 혼성화, 렉틴 염색 및 이미징에서 형광을 통한 장내 미생물군유립 상호 작용의 시각화

CBir1 TCR 형질 전환 CD4⁺ T 세포의 입양 전달에 의한 장 염증유도

장 술 셀 부동성 마우스 공장 Cryosections에 시각화에 안티 인 girdin 항 체의 사용

Evaluation and Quantification of Micro Epithelial Gaps in the Colonic Mucosa using Immunofluorescence Staining

Evaluation and Quantification of Micro Epithelial Gaps in the Colonic Mucosa using Immunofluorescence Staining

Intestinal Swiss Rolls 및 파라핀 포매 조직의 면역형광 염색에 최적화된 프로토콜