The evolution of the device started with somewhat different cutting prototype demonstrated at the Imperial Cancer Research Fund (ICRF) mouse club by Bass Hassan, following this there were several discussions with Rob Rudling and Nikki Mandir in the containment facility at ICRF Clare Hall. Jo Kitau of the mechanical workshop at ICRF constructed the initial versions and Andy Lucas designed and perfected the final model in the CRUK workshop in Oxford.

הפרוצדורות השונות והמתת החסד ההומנית מאושרים על ידי הוועדה האתית מוסדות מארחים ועל ידי הגופים רגולטוריים המתאימים. המתת חסד מושגת בדרך כלל באמצעות CO 2 מחנק ואחריו נקע בצוואר הרחם. 1. התקן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכונת החלק העיקרי של הבסיס של המכשיר מחוץ לגוש מוצק של שרף אצטיל צפיפות גבוהה, כפי שתוארו בכתב היד הזה. בכל קצה ליצור רצועות 3 מ&quot;מ גבוה גבוהות, וחלק מכונה מתוך 2.5 מ&quot;מ מטעים אלה לקחת את המוטות (ראה איור 2 ואיור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך מוטות מפלדת אל-חלד בקוטר 2.4 מ&quot;מ עם קצוות מעוגלים. הערה: המסגרת העיקרית של המכסה הייתה במכונה מתוך צלחת duralumin. מספר מוגבל של מכשירים סיימו זמינים ד&quot;ר Goodlad. </li></ol> 2. שימוש במכשיר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את המעי הדק ומעי גס מחלל הבטן באמצעות מספרייםואצבעות בכפפות. הסר את לפדר על ידי מחזיק אותו עם מלקחיים מעוקלים ומשייכתו בעדינות מהמעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את המעיים עם נאגר מלוח פוספט הקר (PBS, pH 7.4) באמצעות קצה פיפטה סוג Gilson, שנכרת בסופו של הדבר הרחב יותר שלה, כך שניתן להתאים אותו מזרק פלסטיק הולם 10 או 20 מיליליטר luer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המעי דק (SB) לגיליון של נייר מגבת ומתחלקים לשלושה חלקים שווים באורך (הפרוקסימלי, אמצע, ודיסטלי - SB1, SB2 וSB3) באמצעות מספריים. הסר את cecum ולפרוס את המעי הגס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך כמה חתכים קטנים מאוד למגזרי מעיים עם מספריים כדי לאפשר הנוזל לברוח והנח גיליון של נייר מגבת על המעיים ובעדינות לרוץ אצבע על ההכנות לסחוט את הנוזל ולמחוק יבשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את החלקים ולהכניס את מוטות הנירוסטה שהרטיבו בעבר על ידי שריה בכוס של פוספט שנאגרו מלוח. הערה: המעי יכול להיות בverted אם כך רצוי (הפוך לחלוטין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית חתיכה לחתוך נייר כרטיס או מסנן לגודל שיתאים לבסיס של המכשיר. העיפרון הוא הטוב ביותר, כפי שהוא אינו מושפע על ידי כמעט כל הפתרונות. תאריך נתיחה שלאחר המוות, קוד ניסיוני ומספר זיהוי של בעלי החיים שהציע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הכרטיס או נייר סינון לתוך הבסיס של המכשיר. הכנס את המוטות ומעיים לתוך החריצים בבסיס של המכשיר. ודא שהקצה הפרוקסימלי של המגזרים ממוקם באופן אחיד. הקצוות הפרוקסימלי צריכים להיות ליד תוויות הכרטיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החתיכה של המכשיר על הבסיס העליונה. השתמש בברים בזווית כדי להדריך את להב סכין מנתחים לחתוך longitudinally הסעיפים. הערה: אם זה עוזר לי הרקמה היא בעדינות ובזהירות שנערכה עם אצבע כדי לוודא שהוא לא זז עם הסכין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חתיכת המכשיר העליונה. מוציא בזהירות את נייר הסינון ורקמות (עדיין על המוטות שלהם). הערה: פיסת נוקשה כרטיס ממוקמת מתחת לfilנייר ter יסייע להרמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעט רטוב (עם אצבע עטויה בכפפה הטבולה בPBS) המגזרים. מגלגל את המוט, צד לצד כדי לפתוח את הבטן ולהפיץ אותו שטוח. אז הרקמה תדבק נייר הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחינה ויזואלית לבחון את ההיערכות לכל נגעי ברוטו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הרקמה דבקה נייר הסינון למקבע מכיל אמבטיה רדודה (או תיבת כריך). הערה: לאחר הרקמות שומרת על נייר הסינון או לכרטיס הוא יישאר מחובר היטב. מגוון רחב של fixatives יכול לשמש כדי לשמר את ההכנה. מומלץ שהנוזל של Carnoy צריך לשמש למחקר של proliferations תא המעיים 6, המהווה את הקיבעון האידיאלי לשיטות התפשטות תאים הטובות ביותר; עם זאת פורמלין או יכול לשמש גם רב fixatives אחר אם נקודות קצה אחרות נדרשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקיבוע (3 שעות בדרך כלל), להעביר את ההכנות לאתנול 70%. אז יכולות להיות מאוחסנות הדגימות עד נדרשת. הכנות גלהיחקר en פנים ו / או המשמש להכנת דגימות היסטולוגית עבור H &amp; E או טכניקות צביעה היסטולוגית אחרות, אימונוהיסטוכימיה ו / או הכלאה באתר. הערה: קיבעון ממושך יכול להפחית תגובתיות immunohistochemical ו / או בתגובתיות הכלאה באתר. תיבות כריך פוליפרופילן הן אידיאליים לאחסון מספר רב של ההכנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם נדרש רקמות קבועות מהמגזרים השונים במערכת העיכול יכול להפוך להיות &quot;לחמניות שוויצרי &#39;ומוכתם במגוון השלם של שיטות היסטולוגית 6 כוללים אלה שתוארו לעיל. כדי להפוך &#39;רול שוויצרי&#39; מגזרי המעיים יוסרו מנייר הסינון, התגלגל מקל קוקטייל או קיסם, מאובטח עם סיכת אנטומולוגיה ומעובד לשעוות הטבעת 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם נדרש, להכתים את הרקמה בתפזורת עם תילן הכחול לדמיין מוקדי קריפטה הסוטים 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציון ההכנות קבועות בפנאי. </li></ol>

<ol><li>Goodlad, R. A. Cancer Handbook. Alison, M. R. , John Wiley and Sons, Ltd. 243-262 (2007).</li>
<li>Ward, J. M., Treuting, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+intestinal+epithelial+carcinogenesis%3A+pathology+and+preclinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Rodent intestinal epithelial carcinogenesis: pathology and preclinical models.</a> Toxicol Pathol. 42, 148-161 (2014).</li>
<li>Sundberg, J. P., Hogenesch, H., Nikitin, A. Y., Treuting, P. M., Ward, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Training+mouse+pathologists%3A+ten+years+of+workshops+on+the+Pathology+of+Mouse+Models+of+Human+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Training mouse pathologists: ten years of workshops on the Pathology of Mouse Models of Human Disease.</a> Toxicol Pathol. 40, 823-825 (2012).</li>
<li>Wasan, H. S., Novelli, M., Bee, J., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+fat+influences+on+polyp+phenotype+in+multiple+intestinal+neoplasia+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acade+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dietary fat influences on polyp phenotype in multiple intestinal neoplasia mice.</a> Proc Natl Acade Sci USA. 94, 3308-3313 (1997).</li>
<li>Rudling, R., Hassan, A. B., Kitau, J., Mandir, N., Goodlad, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+device+to+rapidly+prepare+whole+mounts+of+murine+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">A simple device to rapidly prepare whole mounts of murine intestine.</a> Cell Prolif. 39, 415-420 (2006).</li>
<li>Alferez, D., Goodlad, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+best+measure+cell+proliferation+in+samples+from+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">To best measure cell proliferation in samples from the intestine.</a> Cell Prolif. 40, 231-240 (2007).</li>
<li>Park, H. S., Goodlad, R. A., Wright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+incidence+of+aberrant+crypt+foci+and+colonic+carcinoma+in+dimethylhydrazine-treated+rats+varies+in+a+site-specific+manner+and+depends+on+tumor+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The incidence of aberrant crypt foci and colonic carcinoma in dimethylhydrazine-treated rats varies in a site-specific manner and depends on tumor histology.</a> Cancer Res. 57, 4507-4510 (1997).</li>
<li>Park, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+epidermal+growth+factor+and+dimethylhydrazine+on+crypt+size%2C+cell+proliferation%2C+and+crypt+fission+in+the+rat+colon.+Cell+proliferation+and+crypt+fission+are+controlled+independently%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Effects of epidermal growth factor and dimethylhydrazine on crypt size, cell proliferation, and crypt fission in the rat colon. Cell proliferation and crypt fission are controlled independently.</a> Am J Pathol. 151, 843-852 (1997).</li>
<li>Femia, A. P., Dolara, P., Caderni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucin-depleted+foci+%28MDF%29+in+the+colon+of+rats+treated+with+azoxymethane+%28AOM%29+are+useful+biomarkers+for+colon+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Mucin-depleted foci (MDF) in the colon of rats treated with azoxymethane (AOM) are useful biomarkers for colon carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 25, 277-281 (2004).</li>
<li>Ruehl-Fehlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--part+1%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).</li>
<li>Goodlad, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+vascular+endothelial+growth+factor+receptor-2+signaling+reduces+tumor+burden+in+the+ApcMin%2F%2B+mouse+model+of+early+intestinal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Inhibiting vascular endothelial growth factor receptor-2 signaling reduces tumor burden in the ApcMin/+ mouse model of early intestinal cancer.</a> Carcinogenesis. 27, 2133-2139 (2006).</li>
<li>Mandir, N., Englyst, H., Goodlad, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistant+carbohydrates+stimulate+cell+proliferation+and+crypt+fission+in+wild-type+mice+and+in+the+Apc%28Min%2F%2B%29+mouse+model+of+intestinal+cancer%2C+association+with+enhanced+polyp+development%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Resistant carbohydrates stimulate cell proliferation and crypt fission in wild-type mice and in the Apc(Min/+) mouse model of intestinal cancer, association with enhanced polyp development.</a> Br J Nutr. 100, 711-721 (2008).</li>
</ol>

The authors have nothing to disclose.

המכשיר מאוד מאיץ את התהליך, כך ששני מפעילים יכולים נתיחה לאחר מוות בעכבר באופן מלא בתוך 6 דקות. זה יכלול בדיקה חזותית לנגעי ברוטו ברורים ומשקל ותיקון האיברים העיקריים. זה גם יאפשר למפעילים לשטוף, למחוק ולשקול את הקיבה, מעי אטום, מעי דק ומעי גס ולהכין את כל mounts. הרקמה שיט...

העכבר והעכבר המהונדס גנטי 1-3 הם מודל לא יסולא בפז ללימוד פתולוגיות שונות במיוחד סרטן והקשר שלה לדלקת במערכת העיכול. זה בדרך כלל דורש ההכנה של mounts של המעי דק ו / או מעי גס כולו. ההכנה של כל mounts ניתן לעשות עם זוג דיוק מספריים לקזז אבל זה יכול לקחת כ -20 דקות לכל עכבר 4. זה לא מעשי מאוד למחקרים השוואתיים, הדורשים כמות משמעותית של עכברים (10 אומרים לנושא הקבוצה לניתוח סטטיסטי). בנוסף, אורך הזמן שלוקח מגביר את הסיכון של השפלה רקמה. ניסיון להקל על בעיה זו הוביל למשפטו של עזרי הכנת חיתוך שונים. הראשון היה מבוסס על סדרה של לוחות מתכת, עם מטעי חיתוך, אבל הצלחות טשטשו את הרקמה והחיתוך היה קשה ובכך לשלוט. Conventionaעיפרון שישה-צדדי l לבסוף סיפק השראה למכשיר החיתוך, כפי שאנו יכולים לראות כיצד צורת חצי עיפרון תעשה מדריך טוב לאזמל (איור 1). זה הביא לעיצוב מסגרת עם ארבעה מדריכי חיתוך 5. היעילות של מכשיר זה הייתה דרמטית כמו ההכנות באיור 4 מדגימות את ההבדל בין הכנת המספריים והכנת ההתקן. צמרות המכשירים המקוריים נבנו מכמה חתיכות של מתכת, אך מאוחר יותר אלה, והמודל הנוכחי מכונה מתוך פיסת duralumin מוצקה. הבסיס היה במכונה מתוך שרף בצפיפות גבוהה באיכות הגבוהה ביותר. המכשיר הוכיח להיות תועלת רבה להכנת mounts של מעי עכבר כל שהיא במידה רבה מאיצה את ומשפרת את האיכות ועקביות של ההכנות, שיש מגוון רחב של יישומים.

<table><tbody><tr><td>Delrin</td><td>Ryan Plastics, Earls Barton, UK</td><td></td><td>High-density acetal resin similar material would suffice</td></tr><tr><td>Duralumin plate</td><td>Metal Supplies Ltd, Park Road,Dukinfield. SK16 5LP UK</td><td></td><td>Aluminium allow dating back to 1909 so alterative suppliers are available&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Finished device(s) ready for use</td><td>Contact Dr Goodlad&amp;nbsp; r.goodlad@imperial.ac.uk</td><td></td><td>Contact&amp;nbsp; r.goodlad@imperial.ac.uk for supply details</td></tr></tbody></table>

a simple device to rapidly prepare whole mounts of the mouse intestine

הכנת mounts של מעי הדק ומעי גס עכבר לניתוח או כימות שלאחר מכן כל יכולה להיות זמן רב וקשה. אנו מתארים את השימוש במכשיר פשוט לחתוך ומעיים עכבר &#39;גליל&#39; להכין במהירות הכנות הר שלמות של איכות מעולה ואחידה לזה שיכול להיות מושגת על ידי יד. המכשיר כולל בסיס שמחזיק 4 מוטות נירוסטה ועליונה, הפועל מדריך חיתוך. המוטות מוכנסות לתוך חלל המעי הקטן [מחולק לשלישים] והמעי הגס. המוטות והדגימות לאחר מכן הניחו על פיסת נייר סינון או כרטיס לחריצי ההחזקה בבסיס של המכשיר. חלקיו העליונים של המכשיר ולאחר מכן ממוקם ומשמש כמדריך חיתוך. שני הסעיפים בזווית במרכז פיסה העליונה משמשים כדי להנחות את סכין או אזמל ולחתוך את המעיים longitudinally בחלק העליון של המוטות. ברגע שחלקי המעי קוצצו, העליון מוסר ואת הכרטיס, TissUE ומוטות להסיר בעדינות את המכשיר והניח על הספסל. המוטות אז בעדינות התגלגלו הצידה כדי לשטח ואת מקל מגזרי מעיים על פיסת נייר סינון או כרטיס הבסיסית. ההכנה הסופית ואז ניתן לבדוק או קבועה ומאוחסנות לניתוח מאוחר יותר. ההכנות רבות ערך לחקר שינויים במעי במודלים של עכברים נורמלים או מהונדסים גנטי. ההכנות כבר בשימוש למחקר וכימות של ההשפעות של דלקת (דלקת המעי הגס), נזק, נגעים טרום סרטניים (מוקדי קריפטה הסוטים (ACFs) וmucin מדולדלים מוקדים (MDFs)) ופוליפים או גידולים.

פוליפים הם קלים לזהות תחת סטראו עם מקור אור קר לצד להאיר את הרקמה (איור 4). זה מועיל כדי לסמן את הכרטיס עם סימני עיפרון כאשר פוליפ הוא ציין כדי שהניקוד ניתן לדון בהמשך ומפעילים שונים יכולים להגיע להסכם. הרקמה יכולה להיות גם בתפזורת מוכתמת [עם מתילן הכחול] לזהות ...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine at JoVE.com

A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

The use of a simple device to cut and &#8216;roll&#8217; mouse intestines to rapidly prepare whole mount preparations is described.

מכשיר פשוט להכין במהירות mounts כל ממעי העכבר

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe ...

a-simple-device-to-rapidly-prepare-whole-mounts-of-the-mouse-intestine

Research

JoVE Journal

Medicine

19.6K Views.  National Institutes of Health. The use of a simple device to cut and ‘roll’ mouse intestines to rapidly prepare whole mount preparations is described.

Video: A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a population of rapidly cycling intestinal stem cells (ISCs) characterized by their expression of the Lgr5 gene. These are supported by a quiescent stem cell population, marked by Bmi-1 expression, capable of replacing them in the event of injury. Investigating the interactions between these populations is crucial to understanding their roles in disease and cancer. The ISCs exist within crypts on the intestinal surface, these niches support the ISC in replenishing the epithelia. The interaction between active and quiescent ISCs likely involves other differentiated cells within the niche, as it has previously been demonstrated that the &#8216;&#8216;stemness&#8217;&#8217; of the Lgr5 ISC is closely tied to the presence of their neighboring Paneth cells. Using conditional cre-lox mouse models we tested the effect of deleting the majority of active ISCs in the presence or absence of the Paneth cells. Here we describe the techniques and analysis undertaken to characterize the intestine and demonstrate that the Paneth cells play a crucial role within the ISC niche in aiding recovery following substantial insult.

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Intestinal epithelial stem cells (ISCs) are intermingled with Paneth cells. These cells are differentiated progeny of the ISC, which support the ISCs and provide antibacterial protection. Here we demonstrate how we used transgenic conditional mouse models to establish that Paneth cells play a crucial role in maintaining the intestinal epithelia.

פרוטוקולים לניתוח תפקידם של תאי פנט התחדשות Murine המעי באמצעות מותנה<em&gt; Cre-לקס</em&gt; מודלי עכבר

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Developmental Biology

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the complex cellular and molecular of intestinal pathology. Although the tunica mucosa is often the organ of interest in many inflammatory diseases, recent works demonstrated that the muscularis externa (ME) is also a highly immunocompetent organ that harbours a dense network of resident immunocytes.1,2 These works were performed within the standardized model of intestinal manipulation (IM) that leads to inflammation of the bowel wall, mainly limited to the ME. Clinically this inflammation leads to prolonged intestinal dysmotility, known as postoperative ileus (POI) which is a frequent and unavoidable complication after abdominal surgery.3 The inflammation is characterized by liberation of proinflammatory mediators such as IL-64 or IL-1&beta; or inhibitory neurotransmitters like nitric oxide (NO).5 Subsequently, tremendous numbers of immunocytes extravasate into the ME, dominated by polymorphonuclear neutrophils (PMN) and monocytes and finally maintain POI.2 Lasting for days, this intestinal paralysis leads to an increased risk of aspiration, bacterial translocation and infectious complications up to sepsis and multi organ failure and causes a high economic burden.6
In this manuscript we demonstrate the standardized model of IM and in vivo assessment of gastrointestinal transit (GIT) and colonic transit. Furthermore we demonstrate a method for separation of the ME from the tunica mucosa followed by immunological analysis, which is crucial to distinguish between the inflammatory responses in these both highly immunoactive bowel wall compartments. All analyses are easily transferable to any other research models, affecting gastrointestinal function.

Postoperative ileus (POI) is a complication of abdominal surgery leading to increased morbidity and a prolonged hospital stay. Because prophylactic or therapeutic strategies are lacking intensified research is necessary. Therefore we established a standardized and feasible mouse model to investigate the pathophysiology of POI and to study potential therapeutic options.

הערכה תפקודית של תנועתיות מעיים ודלקת דופן מעי במכרסמים: ניתוח בדגם סטנדרטי של מניפולצית מעיים

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological questions in cell and developmental biology. In addition, organoids together with recent technical advances in gene editing and viral gene delivery promises to advance medical research and development of new drugs for treatment of diseases. Organoids grown in vitro in basement matrix provide powerful model systems for studying the behavior and function of various proteins and are well suited for live-imaging of fluorescent-tagged proteins. However, establishing the expression and localization of the endogenous proteins in ex vivo tissue and in in vitro organoids is important to verify the behavior of the tagged proteins. To this end we have developed and modified tissue isolation, fixation, and immuno-labeling protocols for localization of microtubules, centrosomal, and associated proteins in ex vivo intestinal tissue and in in vitro intestinal organoids. The aim was for the fixative to preserve the 3D architecture of the organoids/tissue while also preserving antibody antigenicity and enabling good penetration and clearance of fixative and antibodies. Exposure to cold depolymerizes all but stable microtubules and this was a key factor when modifying the various protocols. We found that increasing the ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) concentration from 3 mM to 30 mM gave efficient detachment of villi and crypts in the small intestine while 3 mM EDTA was sufficient for colonic crypts. The developed formaldehyde/methanol fixation protocol gave very good structural preservation while also preserving antigenicity for effective labeling of microtubules, actin, and the end-binding (EB) proteins. It also worked for the centrosomal protein ninein although the methanol protocol worked more consistently. We further established that fixation and immuno-labeling of microtubules and associated proteins could be achieved with organoids isolated from or remaining within the basement matrix.

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

We present protocols for isolation of intestinal 3D structures from in vivo tissue and in vitro basement matrix embedded organoids, and detail different fixation and staining protocols optimized for immuno-labeling of microtubule, centrosomal, and junctional proteins as well as cell markers including the stem cell protein Lgr5.

חיסונית-פלורסנט תיוג של Microtubules וחלבונים Centrosomal Vivo לשעבר רקמת המעי ו 3D במבחנה Organoids מעיים

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

ה<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גירוי קולטן הכרת תרבות תבנית של עכבר המעיים Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Immunology and Infection

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves required for peristalsis and mediate neuronal input from the enteric nervous system1. Different subtypes of ICC form distinct networks in the muscularis of the GI tract 2,3. Loss or injury to these networks is associated with a number of motility disorders4. ICC cells express the KIT receptor tyrosine kinase on the plasma membrane and KIT immunostaining has been used for the past 15 years to label the ICC network5,6. Importantly, normal KIT activity is required for ICC development5,6. Neoplastic transformation of ICC cells results in gastrointestinal stromal tumor (GIST), that frequently harbor gain-of-function KIT mutations7,8. We recently showed that ETV1 is a lineage-specific survival factor expressed in the ICC/GIST lineage and is a master transcriptional regulator required for both normal ICC network formation and for of GIST tumorigenesis9. We further demonstrate that it cooperates with activating KIT mutations in tumorigenesis. Here, we describe methods for visualization of ICC networks in mice, largely based on previously published protocols10,11. More recently, the chloride channel anoctamin 1 (ANO1) has also been characterized as a specific membrane marker of ICC11,12. Because of their plasma membrane localization, immunofluorescence of both proteins can be used to visualize the ICC networks. Here, we describe visualization of the ICC networks by fixed-frozen cyrosections and whole mount preparations.

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are the pacemaker cells of the gastrointestinal (GI) tract. They form complex networks between smooth muscle cells and post-ganglionic neuronal fibers to regulate GI contractility. Here, we present immunofluorescence methods cross-sectional and whole-mount visualization of murine ICC networks.

ויזואליזציה של תאים ביניים של רשת (ICC) קחאל ב עכברים

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Biology

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

מערכת תרבות עכבר העוברי שלם מעי ל<em&gt; Ex Vivo</em&gt; מניפולציה של מסלולי איתות והדמית חיה תלת ממדית של פיתוח שליה

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

<meta charset="utf8"></head><body>מודל מורין לחקר אילאוס לאחר הניתוח באמצעות מניפולציה במעיים

Postoperative Ileus Murine Model

Most patients experience postoperative ileus (POI) after surgery, which is associated with increased morbidity, mortality, and hospitalization time. POI is a consequence of mechanical damage during surgery, resulting in disruption of motility in the gastrointestinal tract. The mechanisms of POI are related to aberrant neuronal sensitivity, impaired epithelial barrier function, and increased local inflammation. However, the details remain enigmatic. Therefore, experimental murine models are crucial for elucidating the pathophysiology and mechanism of POI injury and for the development of novel therapies.
Here, we introduce a murine model of POI generated via intestinal manipulation (IM) that is similar to clinical surgery; this is achieved by mechanical damage to the small intestine by massaging the abdomen 1-3 times with a cotton swab. IM delayed gastrointestinal transit 24 h after surgery, as assessed by FITC-dextran gavage and fluorescence detection of the segmental digestive tract. Moreover, tissue swelling of the submucosa and immune cell infiltration were investigated by hematoxylin and eosin staining and flow cytometry. Proper pressure of the IM and a hyperemic effect on the intestine are critical for the procedure. This murine model of POI can be utilized to study the mechanisms of intestinal damage and recovery after abdominal surgery.

<meta charset="utf8"></head><body>מודל Ileus Murine לאחר הניתוח

We describe a murine model of postoperative ileus generated via intestinal manipulation. Gastrointestinal transit function, pathologic changes, and immune cell activation were assessed 24 h after surgery.

מודל Ileus Murine לאחר הניתוח

Most patients experience postoperative ileus (POI) after surgery, which is associated with increased morbidity, mortality, and hospitalization time. POI ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Accurate identification and location of epithelial cells along the intestinal mucosal lining are essential to define different cell lineages. Proper imaging of intestinal tissues is crucial for identification of protein expression patterns with maximum resolution. This study aims to delineate the optimal methods and conditions for processing mouse intestinal tissues.

טכניקה Swiss-מתגלגל משופר עבור הכנת רקמת המעי עבור immunohistochemical ו ניתוח Immunofluorescent

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

מכשיר פשוט להכין במהירות mounts כל ממעי העכבר

Summary

Explore More Videos

פרוטוקולים לניתוח תפקידם של תאי פנט התחדשות Murine המעי באמצעות מותנה

הערכה תפקודית של תנועתיות מעיים ודלקת דופן מעי במכרסמים: ניתוח בדגם סטנדרטי של מניפולצית מעיים

חיסונית-פלורסנט תיוג של Microtubules וחלבונים Centrosomal Vivo לשעבר רקמת המעי ו 3D במבחנה Organoids מעיים

ה

ויזואליזציה של תאים ביניים של רשת (ICC) קחאל ב עכברים

מערכת תרבות עכבר העוברי שלם מעי ל

מודל Ileus Murine לאחר הניתוח

מודל Ileus Murine לאחר הניתוח

מודל Ileus Murine לאחר הניתוח

טכניקה Swiss-מתגלגל משופר עבור הכנת רקמת המעי עבור immunohistochemical ו ניתוח Immunofluorescent