מחברים במיוחד רוצה להודות ד&quot;ר פאולו פרחי, במחלקה כירורגית, רפואיים לפתולוגיה מולקולרית Critical Care Medicine, אוניברסיטת פיזה, למתן דגימות מח עצם ובקיאותו-אבות osteo אדם

הערה: לאחר הסכמה בכתב, דגימות HBM התקבלו במהלך ניתוח אורתופדי עבור החלפת מפרק הירך. מיד לאחר osteotomy בצוואר הירך ולפני הירך קודחות מזרק 20 מ&quot;ל המכיל 500 UI של הפרין, שימש לשאוב בע&quot;מ טריים. הפרוטוקול הוא ייחשב נרחב החלים על כל מקור בע&quot;מ. 1. בידוד של תאים mononuclear מח האדם עצם (HBM-MNCs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 5 - 10 מ&quot;ל של BM טרי 50 מ&quot;ל, החלת פתרון בופר פוספט של Dulbecco (D-PBS) ומערבבים על ידי היפוך. לא פחות להפיץ 25 מ&quot;ל בשני צינורות חרוטי חדש 50 מ&quot;ל, להוסיף 25 מ&quot;ל של D-PBS על צינור אחד ומערבבים על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הצינורות לעמוד במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר, להפרדת שברי עצם ושומן מפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות שומן צף עם ההשעיה תא פיפטה ולסנן פסטר סטרילית דרך 70 מיקרומטר מסננים מבלי להפריע גלולה שבר העצם. </li> &lt;li&gt; הגדר ארבעה צינורות 50 מ&quot;ל עם 15 מ&quot;ל של מדיום עבור צנטריפוגה שיפוע צפיפות רציפה (1.077 גרם / מ&quot;ל). ודא כי המדיום הזה הוא בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות שכבה 20 - 25 מ&quot;ל של בדילול BM על גבי בינוני שיפוע צפיפות. בצע פעולה זו בזהירות, לתת זרזיף השעית תא על קירות הצינור כדי למנוע שכבות ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע צנטריפוגה שיפוע צפיפות ב 400 XG במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם הבלם נכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את הטבעת לבנבן של תאים הממוקמים בין שני השלבים בעזרת פיפטה פסטר סטרילי ולהעביר אותו צינור 50 מ&quot;ל טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם מדיום תרבות טרי: גלוקוז נמוך, אדום ללא פנול (1,000 מ&quot;ג / ליטר) הבינוני הנשר השונה של Dulbecco (DMEM), 10% (v / v) ואקווה א.ב. בסרום סוג האדם (PhABS), 2 מ&quot;מ L- גלוטמין ו אנטיביוטיקה (DMEM / 10% PhABS). צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant מחדש להשעות גלולה ב 5 - 10 מ&quot;ל של DMEM טריים / 10% PhABS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך ספירת תאים.לקבוע את מספר תאי הדם הלבנים ע&quot;י 1: 1 דילול trypan. זה החל על hemocytometer, ולבחון תחת מיקרוסקופ לעומת שלב. אל תכלול אריתרוציטים קטן ומעוגל מושלם ותאים מתים כחולים מוכתם מן ספירת התאים. הערה: מומלץ מאוד כדי אצוות מסך PhABS לביצועים שלהם בהחלמה MPC. PhABS ממקורות ארה&quot;ב נתן תוצאות הטובות ביותר בעוד רוב סר ממוצא שונה הביא תרבויות MPC עם אחוזים גבוהים של תאי MSC הדמויים. </li></ol> בידוד 2. של MPCs מ-MNCs HBM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר צלוחיות T-75 הידרופובי עם 15 מ&quot;ל של PhABS טרי DMEM / 10% ולתת לאזן pH וטמפרטורה ידי הדגירה טרום ב 37 ° C ב 5% CO 2 למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 זרע - 6 x 10 7 HBM-MNCs לכל בקבוק לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 למשך 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק תאים בינוניים שאינם חסיד צלוחיות. הוסף 15 מ&quot;ל של PhABS DMEM / 10% טרי לדגור על 37 מעלות צלזיוסב 5% CO 2. לשמור על תרבויות למשך 6 - 8 ימים, שינוי בינוני כל 48 שעות. אופציונאלי: כדי להגדיל את תשואת MPC, לא חסידי תאי 2.3 יכולים להיות מחדש מצופים בבקבוק התרבות חדש ומתוחזק כמתואר עבור התרבויות העיקריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק בינוני צלוחיות, לשטוף עם DMEM טריים להוסיף 2 מ&quot;ל של פרוטאז חינם בעלי חיים ניתוק פתרון. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 - 15 דקות (למנוע דגירה ממושכת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של PhABS טרי DMEM / 10%, לשאוב את ההשעיה תא צנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק supernatant מחדש להשעות גלולה ב 1 - 2 מ&quot;ל של DMEM טריים / 10 PhABS%. המשך ספירת תאים כמתוארים בשלב 1.10. הערה: אל תשתמש טריפסין / EDTA כמו ניתוק מגיב. MPCs הוא טריפסין עמיד. הקרנה מורפולוגי של התרבויות, לפני קטיף תא, מומלצת מאוד כדי להעריך הנוכחות של תאי MSC הדמוי דמוי כישור. בסכום תיקים רב של תאי MSC הדמויים הם דetected, להגדיל את הטוהר של מוצר התא על ידי הסרת התאים המזוהמים באופן סלקטיבי. לשם כך, עיכול טריפסין יכול להתבצע לפני קצירת MPC, על ידי הוספת 2 מ&quot;ל של טריפסין / EDTA 0.05% למשך 2 דקות. תרבויות שטפו פעמיים עם 5 מ&quot;ל של DMEM / 10% PhABS, ולאחר מכן להמשיך פרוטאז טיפול כנ&quot;ל. </li></ol> אפיון Cell 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדר דגימות כפולות של 10 תאים 5 טריים מנותקים בתמיסת כביסה: D-PBS בתוספת 0.5% (v / v) אלבומין בסרום שור (BSA) ו- 0.02% (w / v) יזיד הנתרן. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות. זהירות: אזיד הנתרן הוא רעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות כדורים ב 200 μl של פתרון כביסה ולהוסיף אנטי CD90, אנטי CD45, אנטי CD73 נוגדנים נגד CD31 מצומדות עם צבעי ניאון ( &quot;TEST&quot;); במקביל להגדיר בקרת isotype ( &quot;CTRL&quot;). הערה: סכומים של מכתים נוגדנים צריכים להיקבע על ידי טיטרציה או אקורדינג להוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת דגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות. Re להשעות תאי 500 μl של פתרון כביסה ולרכוש לפחות 5 x 10 4 אירועים על תזרים ססגוני cytometer 7 9 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את התוצאות על ידי חלקות-נקודה ולהשתמש &quot;CTRL&quot; אירועים שנרשמו להגדיר רביעים. הערה: על מנת להגדיר את התרבות כתרבות MPC אחוז CD73 נג CD90 נג CD45 + CD31 + תאים צריך להיות מעל 95%. עבור יישומים ספציפיים מסוימים, כלומר, ניתוח ביטוי גנים, חתוכי ההתאוששות צריך להיות מוגברים עד 97 - 98%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי Nestin וניתוח ארגון F- אקטין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט MPCs טרי הפרד, שקופיות קאמרית תרבות (20,000 / 2 ס&quot;מ). אפשר תאים לדבוק ידי דגירת לילה בשעה 37 ° C ב 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים בתמיסה וסיבי כביסהx ב 4% (w / v) פסקה פורמלדהיד בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. כדי להסיר מקבע ולהוסיף פתרון כביסה, דגירה במשך 2 דקות ויוצקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור כביסה פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Permeabilize ברה-PBS בתוספת 0.05% (v / v) טריטון X-100 במשך 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצוות ידי משפר אות בחינם חלבון (30 דקות &#39;ב RT) או פתרון חסימה סטנדרטי (D-PBS בתוספת 3% (w / v) BSA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר משפר אות / חסימת פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 7 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​(w / v) של נוגדן ראשוני nestin אנטי אנושי דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה בתא humidified. במקביל, השתמש נוגדנים לשלוט isotypic להעריך אותות קרינה ספציפיים לא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות על ידי הוספת D-PBS, להשאיר למשך 2 דקות ויוצקים. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​(w / v) של נוגדנים משני מצומדות צבע פלואורסצנטי דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מחליק כנ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף Phalloidin ניאון (5 UI / ml), לעזוב ב RT במשך 30 מ &#39;ב בחושך לשטוף 3 פעמים ב D-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקירות קאמריים הר שקופיות במדיום הרכבה מימית בתוספת antifade מגיב 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לגילוי גרעינים. המשך הדמיה 7 9 10. </li></ol></li></ol> 4. בידול Mesengenic של MPCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 2 x 10 4/2 ס&quot;מ MPCs מבודדים טרי צלוחיות תרבות T75 TC שטופלו ולתת תאים לדבוק לילה DMEM / 10% PhABS על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף DMEM / 10% PhABS עם המדיום סרום מופחת רגיל, כ -200 μl / 2 ס&quot;מ, המיועד (בינוני MSC-RS) הרחבת התא סטרומה mesenchymal. לגדל תאים כדי מפגש (P1-MSCs), בדרך כלל 7 עד 10 ימים מיום האינדוקציה. רענן בינוני כל 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק בינוני צלוחיות, לשטוף עם המדיום MSC-RS טריים להוסיף 2 מ&quot;ל של פרוטאז חינם בעלי חיים ניתוק פתרון. לדגור על 3776; צלזיוס למשך 5 - 15 דקות (למנוע דגירה ממושכת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של מדיום MSC-RS טריים, לשאוב את ההשעיה תא צנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant מחדש להשעות גלולה ב 1 - 2 מ&quot;ל של מדיום MSC-RS טריים. המשך ספירת תאים כמתואר בשלב 1.10 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך-תת תרבות להם על ידי זריעת 3 - 5 x 10 תאים 3/2 ס&quot;מ. לגדל תאים כדי מפגש (P2-MSCs). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים על ידי עיכול פרוטאז כמתואר משלב 4.3 לשלב 4.5 והמשך אפיון כמפורט בסעיף 3. הערה: אחוז של CD73 + CD90 + CD45 נג תאי CD31 נג נמוך מ -95% היה מצביע רק בידול חלקי ודורש מעבר תרבות נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> P2-MSCs פלייט ב 2 x 10 4 / cm 2 בשישה גם צלחות TC שטופלו ולגדול מפגש במדיום MSC-RS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מארק שתי בארות כמו &quot;אין הבדל&quot; ולרענן בינוני MSC-RS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מארק שני גםים כמו &quot;osteo&quot; ולהחליף בינוני עם 200 μl / 2 ס&quot;מ של מדיום osteogenic סטנדרטי, שתוכננה במיוחד עבור בידול MSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מארק שתי בארות כמו &quot;Adipo&quot; ולהחליף בינוני עם 200 μl / 2 ס&quot;מ של מדיום adipogenic סטנדרטי, שתוכננה במיוחד עבור בידול MSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על תרבויות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 על ידי שינוי התקשורת כולה כל 48 שעות. הערה: מומלץ מאוד להשתמש תקן זמינה מסחרי מדיה הבחנה עבור שחזור מבחן. אחרי 2/3 שבועות בתנאי הבחנה, משקעי סידן להופיע בתרבויות מושרות osteogenic, תוך הצטברות טיפות שומנים תאיות ניכרת בתא מושרה adipogenic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק תקשורת ותרבות ולאחר מכן לשטוף עם D-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן התרבויות על ידי הוספת 1 מ&quot;ל של 4% (w / v) פסקה פורמלדהיד במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר מקבע להוסיף D-PBS, דגירה במשך 2 דקות ויוצקים. חזור כביסהפעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם אחד &quot;אין הבדל&quot; יחד עם שני &quot;osteo&quot; מסומן בארות בתמיסת ניאון ספציפית hydroxyapatite ואחד &quot;אין הבדל&quot; יחד עם שני &quot;Adipo&quot; מסומן בארות 200 פתרון אדום ננומטר הנילוס. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר 11,12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מכתים פתרונות ולשטוף D-PBS פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר D-PBS, להוסיף D-PBS בתוספת 50% (v / v) גליצרין והמשך הדמיה 7 9 10. </li></ol> 5. MPC אליפטית Assay הנבטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצר spheroids 3D, שכב 20 טיפות μl של השעיה MPC מבודדים טרי (1.5 x 10 4 תאים / ירידה) על המשטח הפנימי של מכסה צלחת פטרי. הערה: ככל טיפות טיפול עלולות להוביל לקרע שלהם, זה מאוד לא מומלץ להניח להם עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להשתמש במכסה כדי לסכם בצלחת פטרי המכילות D-PBS כדי למנוע תלוי טיפות אידוי. לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2לילה כדי לאפשר לתאים המצרפי spheroids 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדר ג&#39;ל סמיך של מטריקס בעכברים (ECM) חלבונים על ידי הוספת 300 aliquots μl של חלבוני ECM סטנדרטיים צלחת תרבות מראש בקירור 24 גם, ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להתהפך מכסת צלחת פטרי בעדינות להרים את spheroids בעזרת פיפטה פסטר סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נח spheroids על ג&#39;ל חלבון ECM, להוסיף 700 aliquots μl של מדיום גידול תא האנדותל VEGF-עשיר רגיל ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות ו 7 ימים של תרבות, לצלם את תרבויות 3D בהספק הגדלת 4X. להעריך מבצבצות spheroids החלת תוכנת ניתוח תמונה על ידי מדידת המרחק הרדיאלי בין תא הפולש האחרון והקצה אליפטית. צעדים חזרו יחד לפחות 20 בכיוונים שונים. המרחק הממוצע הוא ייחשב כחיובי כאשר 50 מיקרומטר או מעל. </li></ol>

<ol>
	<li>Stoltz, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+and+Regenerative+Medicine:+Myth+or+Reality+of+the+21th+Century.">Stem Cells and Regenerative Medicine: Myth or Reality of the 21th Century.</a> Stem Cells Int. 2015, 734731 (2015).</li><li>Pacini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+and+stochastic+approaches+in+the+clinical+application+of+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs).">Deterministic and stochastic approaches in the clinical application of mesenchymal stromal cells (MSCs).</a> Front Cell Dev Biol. 2, 50 (2014).</li><li>Galvez, P., Clares, B., Hmadcha, A., Ruiz, A., Soria, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+cell-based+medicinal+product:+regulatory+structures+in+the+European+Union.">Development of a cell-based medicinal product: regulatory structures in the European Union.</a> Br Med Bull. 105, 85-105 (2013).</li><li>Herberts, C. A., Kwa, M. S., Hermsen, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+in+the+development+of+stem+cell+therapy.">Risk factors in the development of stem cell therapy.</a> J Transl Med. 9, 29 (2011).</li><li>Petrini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+purification+of+mesodermal+progenitor+cells+from+human+adult+bone+marrow.">Identification and purification of mesodermal progenitor cells from human adult bone marrow.</a> Stem Cells Dev. 18 (6), 857-866 (2009).</li><li>Trombi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+culture+of+mesodermal+progenitor+cells.">Selective culture of mesodermal progenitor cells.</a> Stem Cells Dev. 18 (8), 1227-1234 (2009).</li><li>Pacini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+expression+of+pluripotency-associated+genes+in+mesodermal+progenitor+cells+(MPCs).">Constitutive expression of pluripotency-associated genes in mesodermal progenitor cells (MPCs).</a> PLoS One. 5 (3), 9861 (2010).</li><li>Pacini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+integrin+expression+is+associated+with+podosome-like+structures+on+mesodermal+progenitor+cells.">Specific integrin expression is associated with podosome-like structures on mesodermal progenitor cells.</a> Stem Cells Dev. 22 (12), 1830-1838 (2013).</li><li>Fazzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesodermal+progenitor+cells+(MPCs)+differentiate+into+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+by+activation+of+Wnt5/calmodulin+signalling+pathway.">Mesodermal progenitor cells (MPCs) differentiate into mesenchymal stromal cells (MSCs) by activation of Wnt5/calmodulin signalling pathway.</a> PLoS One. 6 (9), 25600 (2011).</li><li>Tormin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD146+expression+on+primary+nonhematopoietic+bone+marrow+stem+cells+is+correlated+with+in+situ+localization.">CD146 expression on primary nonhematopoietic bone marrow stem cells is correlated with in situ localization.</a> Blood. 117 (19), 5067-5077 (2011).</li><li>Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+red:+a+selective+fluorescent+stain+for+intracellular+lipid+droplets.">Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets.</a> J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).</li><li>Wang, Y. H., Liu, Y., Maye, P., Rowe, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+mineralized+nodule+formation+in+living+osteoblastic+cultures+using+fluorescent+dyes.">Examination of mineralized nodule formation in living osteoblastic cultures using fluorescent dyes.</a> Biotechnol Prog. 22 (6), 1697-1701 (2006).</li><li>Horwitz, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarification+of+the+nomenclature+for+MSC:+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 7 (5), 393-395 (2005).</li><li>Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+mesenchymal+stem+cells.">Clinical applications of mesenchymal stem cells.</a> J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).</li><li>Si, Y. L., Zhao, Y. L., Hao, H. J., Fu, X. B., Han, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSCs:+Biological+characteristics,+clinical+applications+and+their+outstanding+concerns.">MSCs: Biological characteristics, clinical applications and their outstanding concerns.</a> Ageing Res Rev. 10 (1), 93-103 (2011).</li><li>Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+expression+and+immunologic+properties+of+differentiated+and+undifferentiated+mesenchymal+stem+cells.">HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells.</a> Exp Hematol. 31 (10), 890-896 (2003).</li><li>Phinney, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+heterogeneity+of+mesenchymal+stem+cell+populations:+clues+to+their+therapeutic+efficacy.">Biochemical heterogeneity of mesenchymal stem cell populations: clues to their therapeutic efficacy.</a> Cell Cycle. 6 (23), 2884-2889 (2007).</li><li>Phinney, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+mesenchymal+stem+cells:+implications+for+cell+therapy.">Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: implications for cell therapy.</a> J Cell Biochem. 113 (9), 2806-2812 (2012).</li><li>Tolar, J., Le Blanc, K., Keating, A., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+hitting+the+right+spot+with+mesenchymal+stromal+cells.">Concise review: hitting the right spot with mesenchymal stromal cells.</a> Stem Cells. 28 (8), 1446-1455 (2010).</li><li>Corselli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tunica+adventitia+of+human+arteries+and+veins+as+a+source+of+mesenchymal+stem+cells.">The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Dev. 21 (8), 1299-1308 (2012).</li><li>Bieback, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+alternatives+to+fetal+bovine+serum+for+the+expansion+of+mesenchymal+stromal+cells+from+bone+marrow.">Human alternatives to fetal bovine serum for the expansion of mesenchymal stromal cells from bone marrow.</a> Stem Cells. 27 (9), 2331-2341 (2009).</li><li>Watson, L., Elliman, S. J., Coleman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+isolation+to+implantation:+a+concise+review+of+mesenchymal+stem+cell+therapy+in+bone+fracture+repair.">From isolation to implantation: a concise review of mesenchymal stem cell therapy in bone fracture repair.</a> Stem Cell Res Ther. 5 (2), 51 (2014).</li><li>Pacini, S., Petrini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+MSCs+angiogenic+cells?+New+insights+on+human+nestin-positive+bone+marrow-derived+multipotent+cells.">Are MSCs angiogenic cells? New insights on human nestin-positive bone marrow-derived multipotent cells.</a> Front Cell Dev Biol. 2, 20 (2014).</li></ol>

The authors have no competing financial interests or other conflicts of interest.

In the last decades, MSCs have been extensively researched and pre-clinically evaluated for possible application in the treatment of various bone/articular, immunological, neurological, cardiovascular, gastrointestinal and hematological disorders14,15. The easy and inexpensive isolation of multipotent MSCs, from many different tissues, together with their lack of significant immunogenicity16, contribute to make these cells one of the most interesting cell population to be applied in cell based therapies. Nonetheless, the very low frequency in the tissue of origin represents a great limitation to the MSCs application in clinics, forcing the expansion of these cells, in vitro, before the infusion or transplantation. 
Expanded MSC cultures have revealed high grades of heterogeneity and variability17-19 making it difficult to reach a consensus about MSC production and characterization protocols. Moreover, recent investigations suggested the presence of multiple in vivo MSC ancestors in a wide range of tissues, which contribute to culture heterogeneity10,20. In fact, it has been proposed that particular culture conditions possibly select or simply promote specific sub-populations of MSCs progenitors present, in various percentages, in "crude" and unprocessed samples like bone marrow (hBM-MNCs) or adipose tissues (stromal vascular fraction)2. Thus, the variability in MSC-initiating cell populations together with the great number of different enrichment/isolation and culture protocols applied, represent a great obstacle to the definition of feasible MSC-based therapies.
A crucial factor affecting heterogeneity of MSC cultures is serum supplementation21. In our hands replacement of FBS with PhABS in primary cultures from hBM-MNCs, combined with high density seeding on hydrophobic plastics, led to the isolation of a novel highly adherent cell population with distinct biological features named MPCs5,6. We observed that the addition of small percentages of PhABS to FBS primary cultures also allowed MPC isolation, suggesting the presence of MPC inducing agents in the human serum6. At the moment, the MPC isolation/characterization protocol is a unique method available to obtain almost pure MPCs. The protocol has been carefully adjusted and it is highly reproducible for quality screening of MPC preparations before further applications.
MPCs could be used as a source for MSC production, thus limiting the variability introduced by use of unfractionated starting material. The precise definition of the multiple steps characterizing MPC mesengenic differentiation reported9 would allow synchronized mesenchymal cell expansion. Nonetheless, this latest condition could be realized exclusively applying highly purified MPC population, as a consequence the characterization of the cell products obtained by the protocol described here, results of crucial importance. This isolating method has been reported allowing MPC recovery with purity generally around 95%. However, donor/patient variability together with the variability related to the different batches of human pooled serum applied, could lead to a significant percentage of MSC-like cells co-isolated together with MPCs, under selective conditions. 
It is not clear if these "contaminating" MSC-like cells could arise from the other different in vivo progenitors described in bone marrow22 or from uncontrolled and spontaneous MPC differentiation. In any case, a consistent percentage of MSC-like cells in the MPC products nullify the possibility to applying these cells as homogeneous starting material for the MSC expansion. Thus, here it has been suggested a simple and inexpensive method, based on the MPC resistance to trypsin digestion, increasing the purity of the MPC products. Similar or even better results in purifying MPC cultures could be achieved by fluorescent or magnetic cell sorting performing CD73 and/or CD90 depletion, but significantly prolonging the process time and increasing the costs.
Moreover, MPCs showed expression of pluripotency-associated markers and Nestin, all rapidly lost during mesengenic differentiation7. Sprouting assay revealed MPC ability to invade murine ECM protein gel. Taken together these results indicate that MPCs have to be considered a more immature progenitor, retaining angiogenic potential. Nonetheless, the initial enthusiasm about mesodermal differentiation potential of MPCs is actually waning. In fact, after more than 7 years of studies on MPCs, mesengenic and angiogenic potential have been extensively described5-9, but differentiation toward any other cells of mesodermal origin is still lacking. Thus, here we propose a new, and more rigorous, definition of these cells as "Mesangiogenic Progenitor Cells", maintaining the acronym MPCs.
We also believe that most controversies about MSC angiogenic potential could be related to the heterogeneous composition of expanded cultures consisting of sub-populations of MPCs and MSCs in variable percentages23.
Finally, MPCs could also play a crucial role for the implementation of CBMPs applicable for tissue reconstruction, as these cells could also support the neo-vascularization. In fact, future studies on regeneration should take in consideration that the newly formed tissue growth should be supported by concomitant neo-angiogenesis. The co-existence of mesengenic and angiogenic potential in MPCs could significantly improve the regeneration potential of new therapeutic approaches that involve these interesting cells.

תאים סטרומה mesenchymal (MSCs) הם בעלי ערך קליני רלוונטי עבור קיבולת בידול רב השושלת שלהם ואת יכולתם לתמוך hemopoiesis, להפריש גורמי גדילה / ציטוקינים כמו גם לשחק תפקיד immunoregulation 1. בהגדרה של ייצור ויישום תא טיפולים מבוססים MSC כבר מושא המחקר קליני הנרחב טרום קליני 2, תוך שימת דגש מיוחד ברגולציה בינלאומית ספציפית את הבטיחות והיעילות של תא מבוסס מוצר רפואי (CBMP) טיפולים 3. MSCs אדם מתורבתים בהרחבה בתקשורת המכיל תוספי ריאגנטים מן החי, כגון בסרום שור העובר (FBS) טריפסין שור. לכן, לצד סיכונים זיהומיות הקשורות מניפולצית תא, חולים גם להתמודד עם חשיפת פריון וכן סיכונים אימונולוגיים צמודים חלבונים, פפטידים או ביומולקולות אחרות מן החי שיכולים נמשך לאחר תא קציר transplantation 4. כדי לעקוף את הבעיה, אנחנו מתורבתי מח עצמות אדם (HBM) MSCs -derived במדיום חיה ללא, החלפת FBS עם סרום סוג AB אדם אסף (PhABS). בתנאים אלה, לצד MSCs גדל זיהינו אוכלוסיית תא רומן. תאים אלה היו מורפולוגית phenotypically שונה MSCs והראו פרופיל ביטוי גנים ייחודי וכן נכסי הידבקות מאפיין גידול /. הם שמרו הוא mesengenic ו angiogenic פוטנציאל ולכן נקראו תאי mesodermal ובתאים (MPCs) 5. בהמשך לכך, הצלחנו להגדיר תנאי תרבות סלקטיבית לשחזור כדי ליצור MPCs על ציון גבוה של טוהר 6. בנוסף, אנו חקרנו את תכונות מורפולוגיות ביולוגיות של MPCs. MPCs הראה להיות nestin החיובי, איטי ב אופניים, Ki-67-שליליים, ועם הכרומוזומים מאופיינים טלומרים ארוכים 5. הם הביעו plurשעתוק הקשורים ipotency גורמי אוק-4 ו Nanog ולא רגולטורים MSC Runx2 ו Sox9 7. Phenotypically, MPCs הביע endoglin (CD105) ברמה נמוכה יותר מאשר MSCs כאשר לא היתה להם mesenchymal סמנים CD73, CD90, CD166. MPCs גם הראה בדפוס ייחודי של מולקולות הדבקה מאופיין ביטוי עקבי של PECAM (CD31), integrins αL (CD11a), αM (CD11b), αX (CD11c) וכן β2 integrin (CD18) באופן ספציפי ומקיים מבנים podosome דמוי 8 . במדיה הרחבים MSC סטנדרטיים, MPCs הבדיל מייד לתוך MSCs דרך שלב ביניים המציג את הפעלת תא Wnt5 / calmodulin איתות 9. MPCs גם שומרים על תכונותיהם angiogenic, כפי שהוכח על ידי יכולתם צומחים מתוך spheroids ב מטריקס בעכברים (ECM) תרבויות 3D חלבון. פוטנציאל angiogenic אבד במהירות לאחר בידול MPC לאורך שושלת mesengenic. כאן אנו מציגים פרוtocols אופטימיזציה לבודד ולאפיין MPCs נקיים במיוחד מדגימות דם HBM. פרוטוקולים לשחזור עבור mesengenic MPC והבחנה angiogenic מתוארים גם.

<table><tbody><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td><td>BD Bioscience (San Jose, CA-USA)</td><td>354230</td><td>Murine ECM proteins&lt;br/&gt; Stock Concentration: 100% (9 - 12 mg/ml)&lt;br/&gt; Final Concentration: 100%</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS)</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m Filters</td><td>Miltenyi Biotec (BergischGladbach, Germany)</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare (Uppsala, Sweden)</td><td>17-5442-03</td><td>medium for discontinuos density gradient centrifugation</td></tr><tr><td>Pooled human AB type serum (PhABS)</td><td>LONZA (Walkersville MD-USA)</td><td>14-490E</td><td>Final Concentration: 10%</td></tr><tr><td>Glutamax-I</td><td>ThermoFisher (Waltham,&amp;nbsp; MA USA)</td><td>35050-038</td><td>Stabilized L-Glutamine&lt;br/&gt; Stock Concentration: 100x&lt;br/&gt; Final Concentration: 2 mM</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>A8412</td><td>Stock Concentration: 7.5%&lt;br/&gt; Final Concentration: 0.5%</td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>S8032</td><td>Final Concentration: 0.02%</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (Pen Strep)</td><td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td><td>15070-063</td><td>Antibiotics&lt;br/&gt; Stock Concentration: 5,000 UI/ml penicillin, 5,000 &amp;#956;g/ml Streptomycin&lt;br/&gt; Final Concentration: 50 UI/ml penicillin, 50 &amp;#956;g/ml Streptomycin</td></tr><tr><td>T-75 culture flask for suspension cultures</td><td>Greiner Bio-one&amp;nbsp; (Frickenhausen, Germany)</td><td>658 190</td><td></td></tr><tr><td>T-75 culture flask TC treated</td><td>Greiner Bio-one&amp;nbsp; (Frickenhausen, Germany)</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select</td><td>ThermoFisher (Waltham,&amp;nbsp; MA USA)</td><td>12563-011</td><td>Animal-free proteases detaching solution&lt;br/&gt; Stock Concentration: 1x&lt;br/&gt; Final Concentration: 1x</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>ThermoFisher (Waltham,&amp;nbsp; MA USA)</td><td>15400-054</td><td>Phenol red free&lt;br/&gt; Stock Concentration: 0.5%&lt;br/&gt; Final Concentration: 0.25%</td></tr><tr><td>anti-CD90 APC antibody&amp;nbsp; (CD90)</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td><td>130-095-402</td><td>Final Concentration: 1:40</td></tr><tr><td>anti-CD45 APC-Vio770 antibody (CD45)</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td><td>130-096-609</td><td>Final Concentration: 1:40</td></tr><tr><td>anti-CD73 PE antibody (CD73)</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td><td>130-095-182</td><td>Final Concentration: 1:40</td></tr><tr><td>anti-CD31 PE Vio-770 antibody (CD31)</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td><td>130-105-260</td><td>Final Concentration: 1:40</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 APC antibody</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td><td>130-098-846</td><td>Final Concentration: 1:40</td></tr><tr><td>Mouse IgG2a APC Vio770 antibody</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td><td>130-096-637</td><td>Final Concentration: 1:40</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 PE antibody</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td><td>130-098-845</td><td>Final Concentration: 1:40</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 PE Vio-770 antibody</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td><td>130-098-563</td><td>Final Concentration: 1:40</td></tr><tr><td>Low Glucose Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium&amp;nbsp; (DMEM)</td><td>ThermoFisher (Waltham,&amp;nbsp; MA USA)</td><td>13-1331-82</td><td>Phenol red-free minimal essential medium&lt;br/&gt; Stock Concentration: 1,000 mg/L glucose</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp; (FBS)</td><td>ThermoFisher (Waltham,&amp;nbsp; MA USA)</td><td>10500</td><td>Stock Concentration:0.2 mg/ml&lt;br/&gt; Final Concentration: 2 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade reagent with 4&amp;rsquo;,6-diamidino-2-phenylindole</td><td>Invitrogen (Waltham, MA,&amp;nbsp; USA)</td><td>P-36931</td><td>Aqueous mounting medium + DAPI&lt;br/&gt; Final Concentration: 1x</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>P6148</td><td>Fixative&lt;br/&gt; Final Concentration: 4%</td></tr><tr><td>LAB-TEK two-well chamber slides</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>C6682</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nestin antibody [clone 10C2]</td><td>Abcam (Cambridge, UK)</td><td>ab2035</td><td>Stock Concentration: 1 mg/ml&lt;br/&gt; Final Concentration: 7 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Phalloidin</td><td>ThermoFisher (Waltham,&amp;nbsp; MA USA)</td><td>A34055</td><td>Stock Concentration: 200 UI/ml&lt;br/&gt; Final Concentration: 5 UI/ml</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Euroclone (Milan, Italy)</td><td>EMR237500</td><td>Final Concentration: 0.05%</td></tr><tr><td>MesenPRO RS Medium&amp;nbsp; (MSC-RS medium)</td><td>ThermoFisher (Waltham,&amp;nbsp; MA USA)</td><td>12746-012</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-mouse SFX kit</td><td>ThermoFisher (Waltham,&amp;nbsp; MA USA)</td><td>A31619</td><td>Goat anti-mouse secondary antibody + Signal enhancer&lt;br/&gt; Stock Concentration: 2 mg/ml&lt;br/&gt; Final Concentration: 2 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Pasteur Pipette</td><td>Kartell Labware&amp;nbsp; (Noviglio (MI), ITALY )</td><td>329</td><td></td></tr><tr><td>StemMACS AdipoDiff&amp;nbsp; Media</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td><td>130-091-679</td><td></td></tr><tr><td>StemMACS OsteoDiff&amp;nbsp; Media</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td><td>130-091-678</td><td></td></tr><tr><td>Osteoimage Bone mineralization Assay</td><td>LONZA (Walkersville MD-USA)</td><td>PA-1503</td><td>Hydroxyapatite specific fluorescent staining solution</td></tr><tr><td>50 ml Polystyrene conical tube</td><td>Greiner bio-one (Kremsm&amp;uuml;nster&lt;br/&gt; Austria)</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Nile Red</td><td>ThermoFisher (Waltham,&amp;nbsp; MA USA)</td><td>N1142</td><td>Fluorescent staining solution for lipids&lt;br/&gt; Stock Concentration: 100 mM&lt;br/&gt; Final Concentration: 200 Nm</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>G2289</td><td>Final Concentration: 50%</td></tr><tr><td>Polistirene Petri dishes</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>P5606</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates TC-treated</td><td>Greiner Bio-one GmbH (Frickenhausen, Germany)</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Growth Medium, EGM-2 BulletKit&amp;nbsp; (EGM-2)</td><td>LONZA (Walkersville MD-USA)</td><td>CC-3162</td><td>VEGF-rich endothelial cell growth medium</td></tr><tr><td>Leica Qwin Image Analisys Software</td><td>Leica (Wetzlar, Germany)</td><td></td><td>Image analysis software</td></tr></tbody></table>

isolating mesangiogenic progenitor cells (mpcs) from human bone marrow

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel cell population specifically selected for growth in human serum supplemented medium. These cells are characterized by morphological, phenotypic, and molecular features distinct from MSCs and we named them Mesodermal Progenitor Cells (MPCs). MPCs are round, with a thick highly refringent core region; they show strong, trypsin resistant adherence to plastic. Failure to expand MPCs directly revealed that they are slow in cycling. This is as also suggested by Ki-67 negativity. On the other hand, culturing MPCs in standard medium designed for MSC expansion, gave rise to a population of exponentially growing MSC-like cells. Besides showing mesenchymal differentiation capacity MPCs retained angiogenic potential, confirming their multiple lineage progenitor nature. Here we describe an optimized highly reproducible protocol to isolate and characterize hBM-MPCs by flow cytometry (CD73, CD90, CD31, and CD45), nestin expression, and F-actin organization. Protocols for mesengenic and angiogenic differentiation of MPCs are also provided. Here we also suggest a more appropriate nomenclature for these cells, which has been re-named as "Mesangiogenic Progenitor Cells".

התנאים תרבות סלקטיבית המתואר כאן אפשרו את הבידוד של רומן חסיד וכמעט חַד צוּרָתִי אוכלוסיית תאים כמו 1.0% של HBM-MNCs (0.5 - 2.0 x 10 6 HBM-MNCs מן 5 - 10 מ&quot;ל של דגימות BM טרי) 5,6 . זיהינו הגדולות האלה (40 - 60 מיקרומטר קוטר), מעוגל, שוקט, תאים Ki-67-שליליים כמו MPCs 5. מורפולוגית, הם מאופיינים בכושר-ביצת עין ייחודי עם אזור ליבה עבה מוקף בפריפריה דקה שטוחה מראה המון filopodia בהספק בהגדלה גבוה יותר (חצים לבנים ב א 1. איור 1). התארכות פולאר של גבול התא החיצוני הוא נצפה לעיתים קרובות (חיצים שחורים ב א 1. איור 1). מורפולוגיה כזו היא שונה בבירור מן מראה תא סטרומה mesenchymal הטיפוסי בצורת הכישור דיווח בתרבויות MSC סטנדרטיות. Cytometry זרימה הראתה מעל 95% של MPCs המבודד טרי להביע CD31 ו CD45 בעוד מ &#39;esenchymal סמנים הקשורים CD90 ו CD73 13 היו (א .2 איור 1) לגילוי. אנו רואים קבוצה המוגבלת הזאת של ארבעה אנטיגנים כמו אינדיקציות על MPCs. בהמשך סימני ההיכר של MPCs הם הפצה המקווקו F- אקטין חושף מספר מבנים דמויי podosome (אדום באיור 1 א .3) וביטוי אינטנסיבי של nestin (ירוק באיור 1 א .3), אשר לא זוהה בתאים מוכתם נוגדן שליטה isotypic (מידע לא מוצג). MPCs Culturing ב RS סטנדרטי שנועד בינוני עבור תוצאות הרחבה MSC התמיינות מהירה לתאים MSC דמוי גדל באופן אקספוננציאלי (איור 1 ב&#39;1). לאחר שני קטעים תאים לבסוף לעבור הפנוטיפ שלהם CD73 נג CD90 נג CD45 + CD31 + כדי CD73 + CD90 + CD45 נג CD31 נג (איור 1 ב .2). תוך כדי כך, MPCs מחדש organize F- אקטין לתוך סיבי מתח תוך ביטוי nestin הופך מרותק כמה תאים נדירים (איור 1 ב .3). בידול MPC mesengenic לתוך פנוטיפ MSC הדמוי מובהק מתרחש באמצעות שני צעדים ברורים שעולים מורפולוגיה תאים שונות. לאחר שבוע במדיום MSC RS אוכלוסייה שיורית של תאים דמויי MPC עדיין לזיהוי בתוך שכבת ומחוברות של שטוח, תאים רב-קנים מצולעים (P1-MSCs באיור 2 א). קטע נוסף נדרש כדי להשיג תרבות חַד צוּרָתִי כמעט של תאי MSC הדמוי דמוי כישור (P2-MSCs באיור 2 א). אקספוננציאלית גדל אלה תאים יכולים להתמיין אוסטאובלסטים או adipocytes בקלות כאשר מועברים לתוך התקשורת סלקטיבית עבור 2 שבועות לפחות, ובכך אישר הטבע MSC שלהם. בתרבויות מושרות osteogenic, משקעי סידן יכולים להיות מזוהים על ידי או כתם Alizarin-S colorimetric או צבעי ניאון ספציפיים (ירוק B איור 2). לאחר תאים אינדוקציה adipogenicלהראות הצטברות אגל השומנים כפי שעולה גם כתם אדום אדום שמן colorimetric או פלורסנט הנילוס (אדום B איור 2). הקלדת MPC אושרה על ידי הנבטת assay אנגיוגנזה. MPCs הראה יכולתם לפלוש (למעלה מ -50 מיקרומטר) ג&#39;ל murine ECM חלבון מן spheroids 3D לאחר 24 שעות VEGF-גירוי (איור 2 ג). לאחר תאים פולשים שבוע התגלו ב 300 - 600 מרחק מיקרומטר. לעומת זאת, יכולת פלישה אבדה P2-MSCs לאחר בידול mesengenic (איור 2 ד). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54225/54225fig1.jpg" /> איור 1. MPCs מבודדים טרי יש מאפיינים ייחודיים. Culturing HBM-MNCs ב DMEM / 10% PhABS במשך שבעה ימים מוליד אוכלוסייה של MPCs שקט (א) להבחין בקלות בין MSCs (B) </strong&gt; מבחינת מורפולוגיה (א .1, ב&#39;1, ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר), פנוטיפ (א .2, ב .2), הפצה F- אקטין (אדום א .3, ב .3), ו ביטוי nestin (ירוק A.3, ב .3, ברים בקנה מידה = 20 מיקרומטר). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54225/54225fig1large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54225/54225fig2.jpg" /> איור 2. MPCs להתמיין MSCs Standard ו- הצג הנבטה אנגיוגנזה במבחנה. החלפת DMEM / PhABS עם RS זמינים מסחרית שנועדה בינוני להרחבת MSC מפעילה אינדוקציה mesengenic של MPCs. אחרי שבוע בתרבות כמה MPCs שיורית עדיין לגילוי (P1-MSCs) תוך מעבר נוסף במדיום MSC-RS מוביל אוכלוסייה של תאים MSC דמוי ומחוברות (P2-MSCs, ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר). P2-MSCs סופני להתמיין osteocytes או adipocytes תחת הגירוי הנכון, כפי שהיא מתגלה על ידי בתצהיר סידן (ירוק B) וצבירת אגל השומנים (אדום B, ברים בקנה מידה = 200 מיקרומטר), בהתאמה. MPCs להראות הנבטה עקבית spheroids ב ג&#39;ל חלבון murine ECM (C) בשעה הבדל עם P2-MSCs (D, ברים בקנה מידה = 1.0 מ&quot;מ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54225/54225fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow at JoVE.com

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

תאי בידוד ובתאי Mesangiogenic (MPCs) מן האדם מח עצם

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

isolating-mesangiogenic-progenitor-cells-mpcs-from-human-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

8.0K Views.  University of Pisa. Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

Video: Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase - a clinically approved and readily available thrombolytic drug &#8211; clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

שיטה אנזימתי להציל תאי גזע mesenchymal מדוגמאות קרשו מח העצם

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34- pericytes and vascular CD34+CD146- adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Human cardiac tissue harbours multipotent perivascular precursor cell populations that may be suitable for myocardial regeneration. The technique described here allows for the simultaneous isolation and purification of two multipotent stromal cell populations associated with native blood vessels, i.e. CD146+CD34- pericytes and CD34+CD146- adventitial cells, from the human myocardium.

בידוד של אוכלוסיות תאי perivascular מולטיפוטנטיים המבשרים מרקמות אדם לב

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

בידוד של אנדותל ובתאים של דם טבורי אנושי

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

בידוד, תרבות, התמיינות של תאי סטרומה מח עצם ו אוסטאוקלסט אבות של עכברים

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

בידוד בעלי חיים הרחבת חינם סרום של טבורי האדם נגזר תאים סטרומה mesenchymal (MSCs) ו האנדותל יצירת המושבה ובתאים (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Biology

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

זיהוי ובידוד של Oligopotent, ביצע לשושלת אבות מיאלואידית ממח העצם העכבר

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Immunology and Infection

Isolation and Culture of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells from the Human Mandible

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) have shown great potential in bone regeneration, immune modulation, and treating refractory chronic diseases. Various origins have been found to obtain hMSCs recently, while bone marrow was still considered the main source. Bone marrow-derived MSCs (BMSCs) from different donor bone sites have distinct characteristics due to microenvironmental factors. Studies have shown that BMSCs from maxillofacial bone may have greater proliferative and osteogenic capacities than BMSCs from long bones or the iliac crest. And maxillofacial BMSCs were considered more suitable for stem cell therapy in the maxillofacial tissues. The mandible, especially the ascending ramal area with sufficient marrow, was a feasible donor site for harvesting BMSCs. This study described a protocol for harvesting, isolating, and culturing human mandibular bone marrow-derived MSCs (hmBMSCs). Furthermore, immunophenotyping of hmBMSCs, proliferation assays, and in vitro induction of osteogenic, adipogenic, and chondrogenic differentiation was performed to identify the cultured cells. Applying this protocol can help the researchers successfully obtain enough high-quality hmBMSCs, which is necessary for further studies of the biological function, microenvironmental effects, and clinical applications.

The present protocol describes an efficient procedure for isolating and culturing of human mandibular bone marrow-derived mesenchymal stem cells using the whole bone marrow adherence method. The cultured cells were identified by cell proliferation assays, flow cytometry, and multilineage differentiation induction.

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) have shown great potential in bone regeneration, immune modulation, and treating refractory chronic diseases. Various ...

Bioengineering

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

בידוד של דם המופק מכולים multipotent מבשרים משרירי שלד אדם

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Identification of Porcine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells and their Derived Extracellular Vesicles

With the development of stem cell therapy in translational research and regenerative medicine, bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs), as a kind of pluripotent stem cells, are favored for their instant availability and proven safety. It has been reported that transplantation of BM-MSCs is of great benefit to repairing injured tissues in various diseases, which might be related to modulating the immune and inflammatory responses via paracrine mechanisms. Extracellular vesicles (EVs), featuring a double-layer lipid membrane structure, are considered to be the main mediators of the paracrine effects of stem cells. Recognized for their crucial roles in cell communication and epigenetic regulation, EVs have already been applied in vivo for immunotherapy. However, similar to its maternal cells, most of the studies on the efficacy of transplantation of EVs still remain at the level of small animals, which is not enough to provide essential evidence for clinical translation. Here, we use density-gradient centrifugation to isolate bone marrow cells (BMC) from porcine bone marrow at first, and get porcine BM-MSCs (pBM-MSCs) by cell culture subsequently, identified by the results of observation under the microscope, induced differentiation assay, and flow cytometry. Furthermore, we isolate EVs derived from pBM-MSCs in cell supernatant by ultracentrifugation, proved by the techniques of transmission electron microscopy (TEM), nanoparticle tracking analysis (NTA), and western blotting successfully. Overall, pBM-MSCs and their derived EVs can be isolated and identified effectively by the following protocols, which might be widely used in pre-clinical studies on the transplantation efficacy of BM-MSCs and their derived EVs.

This article elaborates a method to isolate and identify porcine bone marrow mesenchymal stem cells (pBM-MSCs) and extracellular vesicles (EVs) derived from them, providing a methodological basis for the pre-clinical evaluation of transplantation efficacy of BM-MSCs and their derived EVs.

With the development of stem cell therapy in translational research and regenerative medicine, bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs), as a kind of ...

Medicine

בידוד מבוסס נישה של תאי גזע מזנכימליים מעצם לסת חולדה

Technique for Isolation and Culture of Rat Jaw Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

Bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) are a type of stem cell with multi-directional differentiation potential. Compared with BMMSCs derived from appendicular bones, BMMSCs derived from the jaw have greater proliferative and osteogenic differentiation ability, gradually becoming important seed cells for jaw defect repair. However, the mandible has a complex bony structure and less cancellous content than appendicular bones. It is difficult to acquire a large number of high-quality jaw-derived marrow mesenchymal stem cells using traditional methods. This study presents a &#39;niche-based approach on stemness&#39; for isolating and culturing rat jaw bone marrow mesenchymal stem cells (JBMMSCs). Primary rat JBMMSCs were isolated and cultured using the whole bone marrow adherent method combined with the bone slice digestion method. The isolated cells were identified as JBMMSCs through cell morphology observation, detection of cell surface markers, and multi-directional differentiation induction. The cells extracted by this method exhibit a &#39;fibroblast-like&#39; spindle shape. The cells are long, spindle-shaped and fibroblast-like. The flow cytometry analysis shows these cells are positive for CD29, CD44, and CD90 but negative for CD11b/c, CD34, and CD45, which is congruent with BMMSCs characteristics. The cells show strong proliferation capacity and can undergo osteogenic, adipogenic, and chondrogenic differentiation. This study provides an effective and stable method for obtaining enough high-quality JBMMSCs with strong differentiation ability in a short time, which could facilitate further studies of the exploration of biological function, regenerative medicine, and related clinical applications.

מחבר זרקור: יישום תאי גזע מזנכימליים של מח עצם לסת ברמת טוהר גבוהה בהנדסת רקמות

Mesenchymal stem cells from the jaw bone marrow have significant functions in diverse differentiation, self-renewal, and immune modulation. They have emerged as a crucial reservoir of precursor cells in gene therapy, tissue engineering, and regenerative medicine. Here, we present a unique method for isolating jaw bone marrow mesenchymal stem cells in rats.

טכניקה לבידוד ותרבית של תאי גזע מזנכימליים של מח עצם לסת חולדה

Bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) are a type of stem cell with multi-directional differentiation potential. Compared with BMMSCs derived from ...