עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (R01 AR061164-01A1).

כל ההליכים ניסיוני אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה-מכון המחקר מיין מרכז רפואי.
1. אוסף מנורות הכנה
<ol><li>להפוך את המדיה תרבות BMSC על ידי שכשהם בינוני חיוני מינימום α (MEM α) עם 10% סרום שור בעובר ו 1% של פניצילין/סטרפטומיצין.</li>
	<li>מקום µL 100 BMSC תרבות המדיה 1.5 mL microcentrifuge צינורות. 3 עצמות יתאימו בדרך כלל באחד צינור בודד אז התכוננו בהתאם.</li>
	<li>חותכים את הקצוות של 200 µL פיפטה טיפים מספיק כדי שיתאימו את החצוצרות שלה צנטריפוגה. הוסף את הטיפים בתוך הצינורות ולהבטיח כי המכסים יכולים לסגור לפני הנחת הצינורות על קרח. הערה: לחלופין, 0.75 מ ל צינורות microcentrifuge עם קצוות החתך יכול להיות מוכנס לתוך הצינור microcentrifuge 1.5 mL.</li>
</ol>2. הקציר של עצמות של עכברים
<ol><li>המתת חסד החיות באמצעות CO2 ואחריו נקע בצוואר הרחם, לרסס אותם עם 70% אתנול. הערה: ודא כי משמשים בעלי חיים מאותו המין, רצוי באותו הגיל. אנו משתמשים באופן שגרתי חיות בגילאי 7-8 שבועות. אנו ממליצים באגירת תאים בעלי חיים לפחות 3 לכל קבוצות ניסיוני להניב אוכלוסיה תא נציג, לשחזור טוב יותר.</li>
	<li>
הנח את העכבר לאללה על גבו על קרש החיתוך. נורא. להשתמש מלקחיים ליצירת אוהל של העור על הבטן. עושים חתך קטן (בערך 1 ס מ) בעזרת מספריים ויבתר סטרילי. לקלף העור לעבר הגפיים ואת כפות הרגליים של החתך כדי לחשוף את הבטן התחתונה ואת הרגליים.
	<ol>
<li>לחתוך מתחת לקרסול משותפת כדי להסיר את כף הרגל. חתך לאורך האגן-הירך. כדי להפריד את הראש של עצם הירך עצם הכסל. בעוד העכבר הוא עדיין על גבו, לעשות חתך באמצע עצם הכסל כדי להפריד בין שתי העצמות iliac.</li>
	</ol>
</li>
	<li>באמצעות מגבונים ללא מוך, הסר בזהירות את השריר מן עצמות הירך, tibias, ו- iliac עצמות. הערה: חיתוך באותה מידה של גידים, שרירים מן העצם כמו גורם אפשרי הניקוי למהירה וקלה עם המחיקות נטולת מוך (למשל, kimwipes). פעל בזהירות בעת הדחת את העצמות כפי שהם נוטים לשבור בקלות, ניתן להגדיל את השבריריות שלהם עם אחרים מסוימים.</li>
	<li>ברגע שיש כבר גזור כל הדגימות, למקם אותם ב- PBS בקרח ולהעביר אל ברדס תרבות סטרילי עבור השלבים הנותרים של בידוד. הערה: עובד גילוח ורחיצה כירורגית ככל האפשר יקטין את פוטנציאל זיהום בתרבויות.</li>
	<li>לבצע חתכים קטנים (כ 1-2 מ"מ) בשני קצותיו לקרע, העצמות לפני הכנסתם הטיפים משרטוטי בתוך הצינורות צנטריפוגה. הערה: ודא לחתוך מספיקה כך מח יכול להיות centrifuged עם זאת, יש לנקוט כדי למנוע חיתוך מדי כמו תא אוכלוסיות נוטים להשתנות בהתבסס על הקרבה בתוך החלל מח.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 10,000 x g 15 s בטמפרטורת החדר. ודא כי כל לשד סמוקות, מגורען בחלק התחתון של צינור 1.5 mL אמנם העצמות בתוך השרוול (גם 200 µL pipet עצה או 0.75 מ ל microcentrifuge tube). לאחר כל לשד נאסף, הסר את הכיסויים עם העצמות הצינורות אוסף. הערה: אם כל לשד התרוקן, העצמות יופיעו לבן. עם זאת, אם מח נותר בעצמות מסוימות, חיתוך הקצוות שוב ולנסות צנטריפוגה.</li>
</ol>3. תא השעיה
<ol><li>באמצעות מחט 25 גרם, למשוך התא. גללים למעלה ולמטה לאט לשבור את הגושים, לשלב את כל הדגימות לתוך צינור חרוטי בודד 15 מ"ל. להוסיף 10 מ של BMSC תרבות המדיה לכל µL 500 דוגמאות.</li>
	<li>מקום מסנן מיקרומטר 70 על גבי צינור חרוטי 50 מ ל, עוברים התליה תא במסנן זה כדי להסיר את שברי העצם אפשרי.</li>
</ol>4. ציפוי והתרבות של אוכלוסיות מעורבות של תאים במח העצם (כולל BMCs)
הערה: תאים מתורבתים ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור עם 5% CO2.
<ol><li>לחשב את מספר התאים, צלחת אותם ב- 1.0 x 10 תאים/ס מ6 2 בתקשורת תרבות. לאפשר 72 h של מעורב תרבות עבור תאים לצרף. הערה: אנו ממליצים דילול תא ההשעיה x 20 תרבות בתקשורת ודילול שוב ב- trypan כחול לפני ספירת התאים באמצעות hemocytometer. עבור עכברים C57Bl6/J זכר בן שבוע 7, אנחנו באופן שגרתי תשואות מספר התא בסביבות 50 x 106 תאים אבל גיל, מין ו זן יכול להשפיע על מספר הטלפון הנייד באופן משמעותי. הערה: אוכלוסיה מיקס של תאים צריך לצרף בחלק התחתון של התרבות היטב.</li>
	<li>לאחר 72 h, מסיר את המדיה ולהחליף אותו עם מדיה טריים. להמשיך לשנות את המדיה כל יום, בדוק אם confluency אחרים. כאשר התאים מגיעים 80-100% confluency, הם מוכנים בידול. הערה: כי תרבות זו הוא מעורב עם BMSCs וגם HSCs, זה יכול ישירות לשמש osteoblastogenesis, adipogenesis, כמו גם osteoclastogenesis.</li>
</ol>5. ציפוי והתרבות של האוכלוסייה פיצול של BMSCs (BMSCs חסיד)
הערה: תאים מתורבתים ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור עם 5% CO2.
<ol><li>צלחת כל התאים שנאספו מן עצמות הירך, tibias, עצמות iliac עכבר אחד לתוך תבשיל תרבות 10 ס מ (55 ס מ2 של תרבות). הערה: בעת צירוף 2-3 C57BL/6J עכברים, אנחנו צלחת בדרך כלל אוכלוסייה זו 'סה כ' מח עצם בבקבוקון2 150 ס"מ.</li>
	<li>לאחר 48 שעות של תרבות מעורבת, מסיר את המדיה תרבות (המכיל את הלא-מחסידי HSCs). אם osteoclastogenesis ניסויים שיש לבצע, להגדיר את אוכלוסיית תאים שאינם מחסידי הצידה (ראו סעיף 7), אם לא, וביופסיה ולמחוק את התאים האלה.</li>
	<li>לשטוף את הבקבוק/הצלחת עם PBS בזהירות כדי לא להפריע את התאים המצורפת.</li>
	<li>הסר PBS והרם את התאים על ידי הוספת 0.25% טריפסין המקננת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1-3 מינימלית כבאות טריפסין על-ידי הוספת מדיה תא התליה תא. בשלב זה, BMSCs, אשר מוסרות כעת, ניתן לספור (שלב קודם לכן בוצע ב 4.1) מצופה לניסויים עתידיים.</li>
	<li>לחשב את מספר התאים הדרושים עבור ציפוי. Centrifuge הנפח הנדרש של תא ההשעיה-1000 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: תאים הם בדרך כלל מצופה בהתבסס על ניסויים מובילים. לדוגמה, אם חלבון/רנ א היא להיות מבודד אנחנו בדרך כלל לוחית רישוי-צפיפות גבוהה יותר (~1.0-2.0 x 106 תאים/טוב בצלחת. ובכן 6).</li>
	<li>הסר את המדיה, resuspend בגדר תא בהיקף של תרבות התקשורת לצורך ציפוי. צלחת התאים בתקשורת תרבות על פי הניסויים ולאפשר להם לצרף לכמה ימים. כאשר BMSCs מגיעים confluency, להמשיך לבצע בידול.</li>
</ol>6. הבידול של BMSCs
<ol><li>
תאי העצם
	<ol>
<li>לבצע אוסטאובלסט בידול מדיה על-ידי הוספת µL 800 של 1 מ' β-גליצרול פוספט PBS ו 200 µL של 0.5 M חומצה אסקורבית ב- PBS 99 מ של BMSC תרבות המדיה (ראה צעד 1.1 ההרכב של התקשורת התרבות BMSC).<ol>
<li>לאחר BMSCs תרבויות (סה כ BMCs מ שלב 4.3) או מחסידי BMSCs מהשלב 5.6 confluent, להבדיל אותם לתוך תאי העצם על ידי מיתוג התקשורת תרבות אוסטאובלסט בידול מדיה.</li>
		</ol>
</li>
		<li>החלף את המדיה בידול בכל יום אחר. התאים להתחיל בהפקת גושים לבנים של מינרליזציה. דמיינו אותם בעין בלתי מזוינת בתחתית הבאר; תהליך זה יכול להתרחש תוך מספר ימים עד שלושה שבועות.<ol>
<li>על מנת להעריך osteoblastogenesis, לבצע צביעת phosphatase אלקליין ו/או פון Kossa מכתים בכל הנוגע לבארות כמתואר בסעיף 8. הערה: לשנות את התקשורת בקפידה על-ידי הטיית הלוחות בזווית קלה על מנת למנוע שיבוש טפט תא.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipocytes
	<ol>
<li>הפוך מדיה הבסיס adipocyte על ידי ערבוב יחד 90 מ"ל של גלוקוז גבוהה Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM), 10 מ של העובר סרום שור, 1 מ"ל של פניצילין/סטרפטומיצין, 100 µL 20 מ מ רוזיגליטזון 100 µL של 2 מ מ אינסולין. אם יש צורך, לאחסן מדיה זו ב 4 מעלות צלזיוס במשך השבוע במהלך הניסוי בידול.</li>
		<li>להפוך את המדיה אינדוקציה adipocyte על-ידי הוספת µL 200 של 62.5 מ מ 3-איזובוטיל-1-methylxanthine (IBMX), µL 25 של 1 מ מ דקסמתזון 25 מ של Adipocyte בסיס מדיה.</li>
		<li>לאחר BMSCs תרבויות (סה כ BMCs מ שלב 4.3) או מחסידי BMSCs מהשלב 5.6 confluent, לשנות את המדיה מדיה אינדוקציה adipocyte. שקול את? היום הזה 0 של בידול.</li>
		<li>לאחר 48 שעות, מסיר את המדיה ולרענן את התרבות עם מדיה אינדוקציה adipocyte.</li>
		<li>ביום הרביעי, לעבור מדיה הבסיס adipocyte. הערה: טיפות השומנים יכול להתחיל להופיע מוקדם ככל יום 2 או 4 ביום.</li>
		<li>יום 7, להתבונן כי תאים הצטברו טיפות השומנים המרבי ולהציג את הפנוטיפ דומה adipocyte בוגר. לא תרבות מעבר לנקודה הזאת, זה עלול לגרום לתא המוות/ניתוק.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. הבידול של HSCs לתוך Osteoclasts
<ol><li>להפוך אוסטאוקלסט בידול מדיה על-ידי הוספת µL 50 µg 25/mL של קולטן Activator של NFKB ליגנד (רנקל) ו 15 µL של µg/mL 25 של מקרופאג גורם מגרה המושבה (mCSF) 25 מ של BMSC תרבות המדיה.</li>
	<li>ברגע של BMCs הכולל (מתוך שלב 4.3) או את התאים שאינם מחסידי (מתוך שלב 5.2) מחוברים היטב, ניתן להחזירו תרבות המדיה אוסטאוקלסט בידול מדיה. לחדש בידול מדיה בכל יום אחר.</li>
	<li>להתבונן התרבויות אוסטאוקלסט כל יום תחת מיקרוסקופ בהגדלה X 10. שים לב כי osteoclasts נתיך ויוצרים תאים multinucleated, בדרך כלל סביב יום 5-7 של בידול.</li>
</ol>8. מכתים
<ol><li>
תאי העצם הערה: אלקליין פוספטאז (AP) ההכתמה, אנחנו לעתים קרובות להשתמש AP צביעת קיט (ראה טבלה של חומרים) על פי ההנחיות.<ol>
<li>לבצע AP צביעת על-ידי ביצוע ההנחיות של ערכת היצרן.<ol>
<li>האחות מדיה ולשטוף תאים עם PBS. לתקן את התאים עם 4% Paraformaldehyde (PFA) ב- PBS במשך 12 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
			<li>בינתיים, להפוך את הפתרון AP באמצעות של ריאגנטים מנקודת הגישה מכתים הערכה על-ידי הוספת 500 µL נתרן חנקיתי כדי פתרון FRV-אלקליין 500 µL ולערבב בעדינות; משהים 2 דק להוסיף 22.5 מ ל dH2O ו- 500 µL Naphthol AS-BI אלקליין. מערבבים בעדינות. התראה: PFA הוא רעיל, יש לטפל בזהירות.</li>
			<li>ברגע התאים קבועים, לשטוף עם PBS ולהוסיף AP פתרון מכל קידוח (1-2 מ לכל טוב). מכסים בנייר כסף ומכניסים הכתם לתת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. וארוקן את הפתרון, לשטוף עם מים מזוקקים, ולאפשר את הצלחת לייבש.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לרכוש תמונות של המושבות מוכתם בעזרת מצלמה על מנת לצפות תאים חיוביים phosphatase אלקליין.</li>
		<li>לחלופין, לבצע פון Kossa במקום phosphatase אלקליין מכתים. בשביל זה, בארות לשטוף ביסודיות עם מים מזוקקים כמו כל PBS הנותרים לזרז עם חנקת הכסף.
		<ol>
<li>לתקן את התאים עם 4% מחברים ב- PBS במשך 12 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להוסיף 5% מספיק כסף חנקתי לפתרון מכסה הבאר, לחשוף בפני אור חזק לשעה בטמפרטורת החדר.</li>
		</ol>
</li>
		<li>להסיר את חנקת ולשטוף כל טוב עם מים מזוקקים. להוסיף 5% נתרן תיוסולפט פתרון לתאים, משהים 3 דקות.</li>
		<li>האחות של נתרן תיוסולפט, לשטוף עם מים מזוקקים. תן את הצלחת לייבש ולבחון את הפיקדון מינרלים צבעונית בחום כהה/שחור בעין בלתי מזוינת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipocytes
	<ol>
<li>עבור צביעת שמן אדום O (אורו), לתקן את התאים באמצעות 10% נייטרלי Buffered פורמלין לשעה בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>בינתיים, להפוך את הפתרון מניות אורו על ידי המסת 0.035 g ב- 10 מ"ל של אלכוהול איזופרופיל. . זה מספיק בשביל צלחת 6-. טוב. לערבב ולהעביר את הפתרון באמצעות נייר סינון אחד (נקבוביות בגודל 11 מיקרומטר).</li>
		<li>הפוך את הפתרון עובד אורו על ידי דילול 9 מ של פתרון מניות אורו, עם 6 מ של מים מזוקקים. לעזוב את הפתרון על כיסא נדנדה עד מוכן לשימוש.</li>
		<li>להכין 60% אלכוהול איזופרופיל במים מזוקקים (מרוויח מספיק כדי לכסות את כל טוב).</li>
		<li>לאחר התאים קבועים, להסיר את פעם אחת לשבועיים, תשטוף עם מים מזוקקים. להחליף את המים עם הפתרון אלכוהול איזופרופיל 60% 1 דקות. הערה: להוסיף נוזלים באיטיות תוך המפנה את הצלחת; adipocytes מכך בקלות רבה.</li>
		<li>להסיר את אלכוהול איזופרופיל ולהוסיף פתרון עובד מספיק אורו כדי לכסות את כל התאים. תקופת דגירה של 15 דקות על כיסא נדנדה במהירות נמוכה בטמפרטורת החדר. להסיר את אורו, לשטוף פעמיים עם מים מזוקקים. הערה: בשלב זה, השומנים שהוכתמו אורו טיפות ניתן לאבחן מתחת למיקרוסקופ.</li>
		<li>כדי לכמת את אורו, destain את אורו על-ידי הוספת 1 מ"ל של 100% אלכוהול איזופרופיל כל טוב ועל ידי מתנדנד באיטיות במשך 10 דקות.</li>
		<li>בינתיים, להכין סדרה דילול ליצירת עיקול רגיל המבוסס על תקני 8 הבאים באמצעות פתרון עובד אורו (2,100 µg/mL), אלכוהול איזופרופיל כמו diluent: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75 ו 0 µg/mL.</li>
		<li>לטעון µL 200 של הסטנדרטים ודוגמאות destained ב triplicates בצלחת ולקרוא את ספיגת 490 nm.<ol>
<li>לקבוע ריכוז של אורו עבור כל דגימה בהתבסס על העקומה סטנדרטי. הערה: מומלץ נרמול הריכוז אורו אל מספר הטלפון הנייד. ניתן לכמת את המספר על ידי קריסטל ויולט להכתים או כמות ה-DNA.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Osteoclasts הערה: כשאתה מוכן, אנו מציעים מכתים osteoclasts עבור שימוש ההכתמה מלכודת פוספטאז חומצה Tartrate עמידים (השמנה) קיט (ראה טבלה של חומרים).<ol>
<li>על מלכודת מכתים, לתקן תאים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם גלוטראלדהיד 2.5% ב- PBS. בינתיים, להפוך את הפתרון מלכודת על ידי ערבוב יחדיו. µL 50 בפתרון מהיר נופך בסיס, 50 µL של נתרן חנקיתי, 4.55 מ ל מים מזוקקים, µL 50 Napthol AS-Biphosphate, µL 200 של אצטט פתרון, פתרון Tartrate µL 100.</li>
		<li>האחות הנחה לשבועיים, ולשטוף את התאים עם PBS פעמיים לפני הוספת פתרון מלכודת 1 h ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>לשטוף עם מים מזוקקים לפני שספר osteoclasts תחת מיקרוסקופ (הגדלה 10 X). התאים מלכודת+ מופיעים סגול עם 3 או יותר גרעינים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrow+microenvironment+transfer+by+heterotopic+transplantation+of+freshly+isolated+and+cultured+cells+in+porous+sponges.">Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges.</a> Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).</li><li>Chen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+growth+and+differentiation+of+osteoprogenitors+in+mouse+bone+marrow+stromal+cell+cultures+by+increased+donor+age+and+glucocorticoid+treatment.">Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment.</a> Bone. 35 (1), 83-95 (2004).</li><li>Kokabu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP3+suppresses+osteoblast+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+via+interaction+with+Acvr2b.">BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b.</a> Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).</li><li>Ghali, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+in+osteogenic+medium+strongly+induces+adipocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+stromal+cells+and+increases+osteoblast+differentiation.">Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation.</a> BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).</li><li>Kretlow, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+age+and+cell+passage+affects+differentiation+potential+of+murine+bone+marrow-derived+stem+cells.">Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells.</a> BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).</li><li>DeMambro, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Igfbp2+Deletion+in+Ovariectomized+Mice+Enhances+Energy+Expenditure+but+Accelerates+Bone+Loss.">Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss.</a> Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).</li><li>Maridas, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGFBP-4+regulates+adult+skeletal+growth+in+a+sex-specific+manner.">IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner.</a> J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).</li><li>Nadri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+murine+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).</li><li>Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchymal+stem+cell+lines+from+murine+bone+marrow.">Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow.</a> Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).</li><li>Abdallah, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34+defines+an+osteoprogenitor+cell+population+in+mouse+bone+marrow+stromal+cells.">CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells.</a> Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).</li><li>Akiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+in+suspension.">Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).</li><li>Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+CD34+truly+a+negative+marker+for+mesenchymal+stromal+cells?.">Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?.</a> Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).</li></ol>

המחברים לחשוף כי להם אין אינטרסים כספיים.

במאמר זה, שתי שיטות של התרבות של BMSCs מוצגים עם המגבלות והיתרונות שלהן. בידוד תאים מגיע ממח העצם הוא תהליך יחסית ללא מאמץ. עם זאת, קבלת אוכלוסיה תא נציג של גזע mesenchymal או אבות osteoclastic יכול להיות מאתגר בשל הסביבה התאית מגוונות של חלל מח.
Culturing מכלול של התכנים מח עצם מספק ייצוג קרוב ש...

BMSCs מאתר ראשי משמשות כמודל במבחנה של גזע mesenchymal מאז גילוין בתחילת שנות השמונים1. אכן, תרביות של תאים פלסטיק-חסיד מבניין את חלל מוח העצם של עצמות ארוכות לשמר את היכולת להיות מבודלים לתוך תאי העצם, osteoclasts, chondrocytes או adipocytes הרבה מחקרים2,3, 4 , 5. עם זאת, מח העצם היא רקמה ייחודית המורכבת רבים אוכלוסיות תאים שונים, לרבות אך לא מוגבל, BMSCs, HSCs, תאי אנדותל, ואת המערכת החיסונית. לפיכך, בידוד וטכניקות תרבות יכולות להניב תא אוכלוסיות בעלות הומוגניות שונות. שימוש בטכניקות כאלה כדי לבדוק את הבידול פוטנציאליים מתאי יכול להיות מאתגר. לדוגמה, בעת השוואה בין תאים של עכברים עם אחרים שונים, החל עם אוכלוסיה לתא מעורב מגביל את הפרשנות של הנתונים. לעומת זאת, קבלת אוכלוסיות הומוגנית של BMSCs ו- HSCs יכול להיות מבחינה טכנית קשה ולא ניתן גם נציג של דגם ex-vivo .
במעבדה שלנו, אנו מעוניינים בעיקר הניצול של BMSCs בשל הפוטנציאל שלהם כדי להיות מבודלים לתוך תאי העצם, osteoclasts ו- adipocytes. כאן, אנו מציגים שיטות בידוד BMSCs ו- HSCs והתרבות להערכת osteoblastogenesis או adipogenesis במבחנה, כמו גם תרבויות HSCs כדי להתמיין osteoclasts. שיטה אחת משתמשת אוכלוסייה מעורבת של תאים במח העצם (BMCs) המכילה BMSCs ו HSCs ישירות מתאים adipogenesis, osteoblastogenesis, osteoclastogenesis (נקרא BMCs סה כ). שיטה זו היא קרובה יותר ex-vivo ייצוג של הטרוגניות מצא בין התאים של microenvironment מח העצם. שיטה נוספת מפרידה מחסידי מתאי שאינו חסיד, בניסיון אוכלוסיות "מזוכך" תרבות של BMSCs ו- HSCs (נקרא חסיד BMSCs). שיטת מאוחר יותר מאפשרת התרבות התא ניסויים כדי להתחיל עם מספר מדויק יותר של BMSCs או HSCs ומפחית את הפוטנציאל של מורכבות השפעות עקיפות של אוכלוסיות אחרות-תא שנותרו בתרבות. שתי השיטות יש כבר בעבר לאור ולא להשתמש בו כדי לטפל מחקריות שונות שאלות6,7,8,9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="636">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">200&#956;L pipet tips&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Rainin</td>
			<td style="width:119px;">17014401</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:135px;">USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15mL conical tube&#160;</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>89039-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL conical tube</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>89039-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Science</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection tools</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70&#956;m filters</td>
			<td style="width:135px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.25% trypsin</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipe</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:135px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alkaline Phosphatase kit</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">86R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silver Nitrate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Thiosulfate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oil Red O</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5554-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Whatman filter Grade 1</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z274852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:135px;">Electron</td>
			<td style="width:119px;">16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MEM&#945;</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#946;-glycerol phosphate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM High Glucose&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rosiglitazone</td>
			<td style="width:135px;">Cayman Chemical</td>
			<td style="width:119px;">717410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IBMX</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RANKL</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">310-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mCSF</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Axio Observer inverter microscope</td>
			<td style="width:135px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice

מח עצם סטרומה תאים (BMSCs) מהווים אוכלוסיה תא בשימוש שגרתי כייצוג של גזע mesenchymal אין ויטרו. הם מתגוררים בתוך החלל מח העצם לצד hematopoietic תאי גזע (HSCs), אשר יכולים להצמיח תאי דם אדומים, מחוסן. אבות ו osteoclasts. לפיכך, עקירות של אוכלוסיות תאים מתוצאות מח עצם תערובת הטרוגנית מאוד של אוכלוסיות תאים שונים, אשר ניתן להציג את האתגרים בעיצוב ניסיוני, וחיסול פרשנות הנתונים. מספר בידוד וטכניקות תרבות פותחו במעבדות כדי לקבל אוכלוסיות פחות או יותר הומוגנית של BMSCs ו- HSCs invitro. כאן, אנו מציגים שתי שיטות בידוד של BMSCs ו- HSCs של עצמות ארוכות העכבר: שיטה אחת המניבה אוכלוסייה מעורבת של BMSCs ו- HSCs ובשיטת אחד שמנסה להפריד בין האוכלוסיות תא שני המבוסס על הדבקות. שתי השיטות מספקות תאים מתאים osteogenic ו- adipogenic בידול ניסויים מבחני גם פונקציונלית.

סקירה של התרבויות תא טכניקות תרבות שני אפשר לפצל ההערכה של בידול על אוכלוסייה מעורבת של BMCs של BMSCs ו- HSCs (סה כ BMCs, איור 1A) או אוכלוסייה של BMSCs מ- HSCs (מחסידי BMSCs, איור 1B). hr 48 לאחר בתאים ממח מבודדים, מצופה (איור 1C), הם במהיר?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice at JoVE.com

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

במאמר זה, נציג שיטות כדי לבודד, להבדיל תאי סטרומה מח עצם של תאי גזע hematopoietic עצמות ארוכות העכבר. שני פרוטוקולים שונים מוצגים מניב אוכלוסיות תאים שונים עבור הרחבת ובידול לתוך תאי העצם, adipocytes ו osteoclasts.

בידוד, תרבות, התמיינות של תאי סטרומה מח עצם ו אוסטאוקלסט אבות של עכברים

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

isolation-culture-differentiation-bone-marrow-stromal-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

30.8K Views.  Maine Medical Center Research Institute. במאמר זה, נציג שיטות כדי לבודד, להבדיל תאי סטרומה מח עצם של תאי גזע hematopoietic עצמות ארוכות העכבר. שני פרוטוקולים שונים מוצגים מניב אוכלוסיות תאים שונים עבור הרחבת ובידול לתוך תאי העצם, adipocytes ו osteoclasts.

Video: Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

בידוד וההעשרה של אדם שומן המופק מתאי סטרומה לOsteogenesis משופר

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase - a clinically approved and readily available thrombolytic drug &#8211; clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

שיטה אנזימתי להציל תאי גזע mesenchymal מדוגמאות קרשו מח העצם

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. Although numerous immortalized adipogenic cell lines have been established, adipose-derived stem cells from the stromal vascular fraction of subcutaneous white adipose tissues provide a reliable cellular system ex vivo much closer to adipose development in vivo. Pig adipose-derived stem cells (pADSC) are isolated from 7- to 9-day old piglets. The dorsal white fat depot of porcine subcutaneous adipose tissues is sliced, minced and collagenase digested. These pADSC exhibit strong potential to differentiate into adipocytes. Moreover, the pADSC also possess multipotency, assessed by selective stem cell markers, to differentiate into various mesenchymal cell types including adipocytes, osteocytes, and chondrocytes. These pADSC can be used for clarification of molecular switches in regulating classical adipocyte differentiation or in direction to other mesenchymal cell types of mesodermal origin. Furthermore, extended lineages into cells of ectodermal and endodermal origin have recently been achieved. Therefore, pADSC derived in this protocol provide an abundant and assessable source of adult mesenchymal stem cells with full multipotency for studying adipose development and application to tissue engineering of regenerative medicine.

This protocol describes the isolation of pig adipose-derived stem cells (pADSC) from subcutaneous adipose tissues with examination of multipotency. The multipotent pADSC are used to delineate processes of adipocyte differentiation and study transdifferentiation into multiple cell lineages of mesodermal mesenchyme or further lineages of ectoderm and endoderm for regenerative studies.

בידוד ובידול של תאי גזע נגזר שומן מרקמות שומן תת עורי בשר חזירים

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

בידוד הרחבת גזע mesenchymal / תאי סטרומה נגזרו רקמה אנושית שליה

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel cell population specifically selected for growth in human serum supplemented medium. These cells are characterized by morphological, phenotypic, and molecular features distinct from MSCs and we named them Mesodermal Progenitor Cells (MPCs). MPCs are round, with a thick highly refringent core region; they show strong, trypsin resistant adherence to plastic. Failure to expand MPCs directly revealed that they are slow in cycling. This is as also suggested by Ki-67 negativity. On the other hand, culturing MPCs in standard medium designed for MSC expansion, gave rise to a population of exponentially growing MSC-like cells. Besides showing mesenchymal differentiation capacity MPCs retained angiogenic potential, confirming their multiple lineage progenitor nature. Here we describe an optimized highly reproducible protocol to isolate and characterize hBM-MPCs by flow cytometry (CD73, CD90, CD31, and CD45), nestin expression, and F-actin organization. Protocols for mesengenic and angiogenic differentiation of MPCs are also provided. Here we also suggest a more appropriate nomenclature for these cells, which has been re-named as "Mesangiogenic Progenitor Cells".

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

תאי בידוד ובתאי Mesangiogenic (MPCs) מן האדם מח עצם

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

ייצור בקנה מידה גדולה של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם באמצעות פרוטוקול בידול מולקולה קטן המבוססת לשחזור ביותר

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

בידוד של עכבר רירית הרחם אפיתל סטרומה תאים עבור<em&gt; במבחנה</em&gt; Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

בידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal מן טבורי אדם העובר שליה

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result in a series of bone metabolic diseases, including osteoporosis. To develop pharmaceutical targets for the prevention of pathological bone mass loss, the mechanisms by which osteoclasts differentiate from precursors must be understood. The ability to isolate and culture a large number of osteoclasts in vitro is critical in order to determine the role of specific genes in osteoclast differentiation. Inactivation of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 (TORC1) in osteoclasts can decrease osteoclast number and increase bone mass; however, the underlying mechanisms require further study. In the present study, a RANKL-based protocol to isolate and culture osteoclasts from mouse bone marrow and to study the influence of mTORC1 inactivation on osteoclast formation is described. This protocol successfully resulted in a large number of giant osteoclasts, typically within one week. Deletion of Raptor impaired osteoclast formation and decreased the activity of secretory tartrate-resistant acid phosphatase, indicating that mTORC1 is critical for osteoclast formation.

This manuscript describes a protocol to isolate and culture osteoclasts in vitro from mouse bone marrow, and to study the role of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 in osteoclast formation.

מבוסס רנקל אוסטאוקלסט תרבות וזמינותו של העכבר מח העצם כדי לחקור את התפקיד של mTORC1 במבנה אוסטאוקלסט

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...