Name: depletion of mouse cells from human tumor xenografts significantly improves downstream analysis of target cells
Uploaded: 2016-07-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells at JoVE.com

We are grateful to Janina Kuhl, Nadine Chelius, Petra Kussmann, Lena Willnow and Dorothee Lenhard for excellent technical assistance.

<ol>
	<li>Daniel, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primary+xenograft+model+of+small-cell+lung+cancer+reveals+irreversible+changes+in+gene+expression+imposed+by+culture+in+vitro.">A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro.</a> Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).</li><li>Tentler, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+tumour+xenografts+as+models+for+oncology+drug+development.">Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development.</a> Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).</li><li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology,+growth,+metastasis+and+disease+outcomes.">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li><li>Siolas, D., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+tumor+xenografts:+transforming+clinical+samples+into+mouse+models.">Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models.</a> Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).</li><li>Wong, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted-capture+massively-parallel+sequencing+enables+robust+detection+of+clinically+informative+mutations+from+formalin-fixed+tumours.">Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours.</a> Sci Rep. 3, 3494 (2013).</li><li>Sausville, E. A., Burger, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+human+tumor+xenografts+to+anticancer+drug+development.">Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development.</a> Cancer Res. 66 (7), 3351-3354 (2006).</li><li>Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+in+vivo+xenograft+tumor+model+for+predicting+chemotherapeutic+drug+response+in+cancer+patients.">Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients.</a> Clin Pharmacol Ther. 85 (2), 217-221 (2009).</li><li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts:+somatic+differentiation+in+vitro.">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).</li><li>Merk, J., Rolff, J., Becker, M., Leschber, G., Fichtner, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenografts+of+non-small-cell+lung+cancer:+a+pre-clinical+model+to+evaluate+adjuvant+chemotherapy.">Patient-derived xenografts of non-small-cell lung cancer: a pre-clinical model to evaluate adjuvant chemotherapy.</a> Eur J Cardiothorac Surg. 36 (3), 454-459 (2009).</li><li>Baiocchi, M., Biffoni, M., Ricci-Vitiani, L., Pilozzi, E., De Maria, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+models+for+cancer+research:+human+cancer+stem+cell+xenografts.">New models for cancer research: human cancer stem cell xenografts.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (4), 380-384 (2010).</li><li>Gires, O., Stoecklein, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+EpCAM+expression+on+circulating+and+disseminating+tumor+cells:+causes+and+consequences.">Dynamic EpCAM expression on circulating and disseminating tumor cells: causes and consequences.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (22), 4393-4402 (2014).</li><li>Zhang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+effect+of+the+gamma-secretase+inhibitor+PF-03084014+and+docetaxel+in+breast+cancer+models.">Synergistic effect of the gamma-secretase inhibitor PF-03084014 and docetaxel in breast cancer models.</a> Stem Cells Transl Med. 2 (3), 233-242 (2013).</li><li>Boven, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+II+preclinical+drug+screening+in+human+tumor+xenografts:+a+first+European+multicenter+collaborative+study.">Phase II preclinical drug screening in human tumor xenografts: a first European multicenter collaborative study.</a> Cancer Res. 52 (21), 5940-5947 (1992).</li><li>Agorku, D., Hardt, O., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Depletion of mouse cells from human tumor xenografts significantly reduces bias in molecular analysis and improves culture of target cells. Abstract 95. , (2014).</li><li>Agorku, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Next-generation sequencing of human tumor xenografts is significantly improved by prior depletion of mouse cells. Abstract 1455. , (2015).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).</li><li>Koboldt, D. C., Larson, D. E., Wilson, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+VarScan+2+for+Germline+Variant+Calling+and+Somatic+Mutation+Detection.">Using VarScan 2 for Germline Variant Calling and Somatic Mutation Detection.</a> Curr Protoc Bioinformatics. 44, (2013).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+viewer.">Integrative genomics viewer.</a> Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).</li><li>Aloia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sialyl-glycolipid+stage-specific+embryonic+antigen+4+marks+a+subpopulation+of+chemotherapy-resistant+breast+cancer+cells+with+mesenchymal+features.">The sialyl-glycolipid stage-specific embryonic antigen 4 marks a subpopulation of chemotherapy-resistant breast cancer cells with mesenchymal features.</a> Breast Cancer Res. 17 (1), 146 (2015).</li></ol>

David Agorku, Stefan Tomiuk, Stefan Wild, Silvia R&#252;berg, Lisa Zatrieb, Andreas Bosio and Olaf Hardt are or were employees of Miltenyi Biotec GmbH, Germany. Kerstin Klingner and Julia Sch&#252;ler are employees of Oncotest GmbH, Germany.

פתחנו שיטה מהירה וקלה לבודד תאים סרטניים אנושיים נגעו מרקמות גידול xenografted. הליך זה מבוסס על הדלדול המקיף של תאים ממוצא עכבר על ידי שילוב דיסוציאציה רקמות אוטומטיות מיון תא מגנטי. מלבד דלדול של כל התאים בעכבר גם את כמות תאים מתים ופסולת מצטמצם משמעותית בשבריר תא המטרה. יחדיו, שיטה זו משפרת ניתוחים במורד מולקולריים משמעותית וטיפוח התאים סרטניים אנושיים. בניגוד לשיטות חלופיות, אין צורך בידע של סמנים ספציפיים תאים סרטניים, התאמה שונה קומפוזיציות של תאי עכבר או הקמת אלגוריתמים. השיטה המוצגת היא עצמאית של זן העכבר וסוג הגידול. לכן, הטיה דרך בידוד של תת-אוכלוסיות של גידולים בבני אדם על בסיס סמנים ספציפיים אנושיים אחת אשר עשוי להשתנות ביטוי, כפי שמוצג על EpCAM 11, היא להימנעed. יתר על כן, זה אינו מוגבל לחומר גידול אך יכול לשמש לכל סוג של רקמת xenotransplanted כתאי עכבר ממוקדים במקום תת-אוכלוסיות של גידולים בבני אדם ספציפיים (מידע לא מוצג). הסרה מקיפה של תאי עכבר היא הקלה על ידי מיקוד אפיטופים שטח לידי ביטוי אך ורק על תאים ממוצא עכבר. מלבד השיטה המבוססת היטב עבור דיסוציאציה גידול כפי שהוצג במחקר זה, קיימים נהלים רבים באמצעות סוגים שונים של אנזימים. שימור אפיטופים פני התא הוא תנאי הכרחי שיטה חדשנית זו, אלא גם עבור ניתוחים מדויקים של אוכלוסיות תאים סרטניים אנושיות. לכן, חשוב כי אנזימים עדינים משמשים לעיכול של רקמת גידול. לפיכך, דלדול תא עכבר ניתן להשתמש רק בשילוב עם נהלי עיכול אנזימטי שכנראה אינו משפיעים אפיטופים ממוקדים במהלך הליך שחסך בתאי עכבר. במקרה של ספק זה ניתן לאמת רק על ידי היצרן, בהתאמה. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; שיטה זו עובדת גם עבור תאים סרטניים אנושיים במחזור (CTCs). עם זאת, כמו תדרים של תאי היעד הם בדרך כלל &lt;0.1% סרים של תאי עכבר בנוסף דורש תמוגה תא דם אדום purities של יותר מ -50% לא ניתן לצפות. במקרה זה, דלדול תא העכבר יכול לשמש להעשרת מראש של CTCs ואחריו העשרה באמצעות סמנים חיוביים (מידע לא מוצג). הסרת תאי עכבר משפרת באופן משמעותי את התרבות של תאים סרטניים אנושיים על ידי הימנעות לגדול תרבות של פיברובלסטים עכבר. בנוסף, הניתוח של xenografts הסרטני האנושי על ידי הרצף של הדור הבא הוא השתפר באופן משמעותי טופל. כמו האפקט הזה נצפה אף מבחר רצף ספציפי אדם ממוקד בוצע במהלך עשרת exome, ההשפעה על הגנום כולו ועל רצף transcriptome שלם צפויות להיות אפילו יותר בולט. יתר על כן, השיטה המוצגת מקלה ACCURAמחקרים מולקולריים te של תת-אוכלוסיות גידול בתוך גידולים אנושיים xenotransplanted. הסרת תאי עכבר ממדגם בהתאמה בשלב הראשון ולאחר מכן מיון תאים סרטניים אנושיים בשתי תת-אוכלוסיות שונות מאפשרת השוואה מולקולרית ישירה של תת-אוכלוסיית הגידול מעניין תאים סרטניים בתפזורת אדם 20. ביטוי גנים דיפרנציאלי בין תת תא גידול ניתן להעריך בצורה מהימנה יותר כפי שהוא אינו מושפע הכלאה צולבת של מולקולות נגזרות עכבר.

גידולים אנושיים מוצקים מורכבים פיסיולוגי רב כמו גם סוגי תאי ממאירה. הם יוצרים רקמות הטרוגנית עם מבנים ביולוגיים מורכבים. תהליכים ביולוגיים כמו הגידול היווצרות, התקדמות ותגובות כלפי טיפולים עדיין אינם מובנים במלואם. מודלים תרבית תאים במבחנה ב מייצגים כלי שימושי ללמוד ולהבין ביולוגיה הגידול. עם זאת, הם יכולים רק חלקית לשקף מבנים ותהליכים נמצאים ברקמות גידול. במודלים פרה אמינים ויציבים של גידולים בבני אדם הם תנאים הכרחיים לפיתוח תרופות אנטי גידול וטיפולי 4,6 וכן להבנת ביולוגית גידול ואת האינטראקציה של תאים סרטניים לבין סביבתם. מודלים אנושיים xenograft גידול שמקורם בגידולים מטופלים עיקריים להראות יחסים גבוהים לרקמות ממוצא לגבי אדריכלות היסטולוגית, אינטראקציות עם מבנים מיקרו-סביבה, פוטנציאל גרורתי ותגובות לתרופות 7 </sup&gt;. גם כאשר xenografts גידול נגזר תאים בתרבית או שורות תאים הוא לחקות באופן הדוק יותר גידולים חולים, ולכן מראת תוקף גבוה ברוב המבחנים לעומת דגמי תרבית תאים במבחנה. תכונות אלו הופכות אותם תקן הזהב של במודלים פרה 4. מלבד היישום שלה בחקר הסרטן, השתלה שלא מבן-מינו של תאים אנושיים בעכברים גם משמש לעתים קרובות במחקר תאי גזע כדי לקבוע את פוטנציאל stemness והבחנה של אוכלוסיית היעד 8. הוכח כי microvasculature האדם ותאי חיסון אנושיים מוחלפים על התפשטות in vivo של גידולים אנושיים 2,9. גורמים כגון תת סוג הגידול, קצב צמיחה, ואת האזור של השתלה יש השפעות משמעותיות על ברמה הגלובלית של חדירה וכן בהרכב סוגי תאי עכבר נמצא. עם זאת, גם כאשר הגורמים אלה נשמרים קבועים, בסך ורכב תאי עכבר הם משתנים מאוד. ניתוחי Downstream של רקמות xenografted לעתים קרובות מאותגרים על ידי תאים ממוצא בעכברים. תרבויות עיקריות של תאים סרטניים אנושיים מן xenografts הם מגודלים לעתים קרובות על ידי פיברובלסטים. מלבד פגע הדור של שורות תאים סרטניים במבחנה, מבחנים במורד כגון בדיקות או הפרמקוקינטיקה cytotoxicity תרופה מוטים מאז בתיקון סיליקון עבור תופעות שמקורן זיהום תאי עכבר הוא בלתי אפשרי ברוב המקרים. מעבר לכך, ההצטלבות הובהרה באופן חלקי בלבד בין פיברובלסטים עכבר ותאי גידול אנושיים יש השפעה ישירה על תוצאות ניסוי של מחקרים 10. יתר על כן, הווריאציה הצפויה הנרחב ביותר של הסתננות בתאי עכבר מחריף ניתוחים במורד מולקולרי מדויקים. ב NGS או proteome מנתח כל אות עכבר נגזרות נמדדה במקום אות גידול אנושית פוחתת רגישות רצף ישירות. גם מנתח הביטוי מבוסס microarray מאותגרים על ידי nuc murineחומצות leic ואולי והכלאה צולבת בדיקות אדם. על מנת לעקוף את המכשולים של זיהום תאי עכבר בניתוחים במורד זרם של תאים סרטניים אנושיים ממודלי xenograft גישות שונות הוצעו. במחקרים רבים תאי יעד רצויים לניתוח במורד זרם מבודדים על ידי ניצול סמנים או שילובים של סמנים לידי ביטוי אך ורק על תאים סרטניים אנושיים. עם זאת, העדר סמנים האמינים זיהוי חיובי של תאים סרטניים אנושיים לעתים קרובות מייצג מכשול גדול. אפילו רחבת סמנים הביעו, כגון EpCAM על קרצינומות אדם, לעתים קרובות להראות הבדלי ביטוי מהותי גידול 11. זה מגביר את הסיכון כי נמוך subpopulations להביע, למשל, תאים סרטניים שעברו אפיתל-to-mesenchymal המעבר, הם איבדו במהלך הבידוד. בנוסף, המחייב הישיר של סוכן בחירה לתא היעד עלול להשפיע על תוצאות הניתוח שלאחר מכן. ניסיונות של ומכלת תאי עכבר על ידיבאמצעות שילוב של נוגדנים ספציפיים עבור CD45 murine ו אפיטופים אני בכיתה MHC גם נעשו 12. עם זאת, שילוב סמן זה רק מזהה תת קבוצה של תאי עכבר. גישה נוספת היא לשפר תהליכי ניתוח על ידי תוכנה. אף על פי כן, כל הגישות הללו הן גם לא מתאימות לכל סוג של התקנה ניסיונית או לכל ישות גידול ושיטת השתלה. במחקר זה אנו מציגים רומן שיטה מהירה עבור ומכלה בתאי עכבר מקיף מרקמות xenografted העצמאיות של זן העכבר ורקמות מוצא. בהקרנות על איברים ורקמות יעד מרובים להשתלה של xenografts (כולל עור, ריאות, מוח, כליות שרירי שלד) הצלחנו לזהות שילוב של נוגדנים המאפשרים לגילוי תאי עכבר באופן מקיף. נוגדנים אלה היו מצמידים לחלקיקים פאראמגנטי, טיטרציה אופטימיזציה עבור דלדול באמצעות מיון התא מגנטי. כפי ספציפי עכבר בלבדנוגדנים משמשים, תאי יעד אדם להישאר &quot;נגעו&quot; והשיטה אינה מוגבלת רקמת גידול xenotransplanted. אנו מראים כי תאי עכבר הסרה מקיפה ממדגם גידול xenografted סטנדרטיזציה ומקלים בתרביות תאים סרטניים אנושיים. יתר על כן, אנו מראים כי הניתוח של xenografts הסרטני האנושי על ידי רצף הדור הבא הוא השתפר באופן משמעותי. כמו האפקט הזה נצפה אף מבחר ספציפי אדם רצף בוצע במהלך עשרת exome, ההשפעה על הגנום כולו ועל רצף transcriptome שלם צפויות להיות אפילו יותר בולט. יחדיו, הסרת תאי עכבר באמצעות שיטה חדשנית זו מקלת טיפוח של תאים סרטניים אנושיים משפרת באופן משמעותי את הניתוחים במורד הזרם של xenografts הסרטני האנושי.

<table><tbody><tr><td>Tumor Dissociation Kit, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td>contains enzymes H, R and A; see data sheet for reconstitution instructions</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Biowest</td><td>L0501-500</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C-Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainer (70 &amp;micro;m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 100 mm</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse Cell Depletion Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-694</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Various</td><td></td><td>use 1x PBS for PEB buffer</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3610</td><td>use final concentration of 2 mM in PEB buffer</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>or use 5 mg/L BSA in PEB buffer</td></tr><tr><td>MACS LS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>PreSep filters (70 &amp;micro;m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>CD326-FITC, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-301</td><td>use 1:40 for immunofluorescence staining&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>anti-Vimentin antibody</td><td>abcam</td><td>ab92547</td><td></td></tr><tr><td>goat-anti-mouse IgG-Alexa488</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>goat-anti-rabbit IgG-Alexa594</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>dilute to a final concentration of 0.1 &amp;micro;g/ml in 0.1 M sodium bicarbonate&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Inside Stain Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-477</td><td>InsideFix from this kit can be used for fixation step during immunofluorescence staining&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>FcR Blocking Reagent, mouse</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500-100g</td><td></td></tr><tr><td>Nextera Rapid Capture Enrichment Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-140-1000</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reagent Kit v3</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td><td></td></tr></tbody></table>

depletion of mouse cells from human tumor xenografts significantly improves downstream analysis of target cells

השימוש במודלים שורת תאים במבחנה לחקר הסרטן כבר כלי שימושי. עם זאת, הוכח כי מודלים אלה אינם מצליחים לחקות גידולים המטופל באופן אמין מבחני שונות 1. Xenografts גידול האנושי מייצג את תקן הזהב ביחס ביולוגית גידול, גילוי תרופות, ומחקר גרורות 2-4. Xenografts גידול יכול להיגזר סוגים שונים של חומרים כמו שורות תאים סרטניים, רקמת גידול מגידולים מטופלים עיקריים 4 או גידולים המושתלים באופן סדרתי. כאשר מופצות in vivo, רקמות xenografted הוא שחדר ו vascularized ידי תאים ממוצא העכבר. גורמים רבים כגון ישות הגידול, מקורם של חומר xenografted, קצב צמיחה באזור ההשתלה להשפיע על הרכב וכמות תאי עכבר נוכחים xenografts גידול. עם זאת, גם כאשר גורמים אלה נשמרים קבועים, מידת זיהום העכבר התא הוא משתנה מאוד. שיתוףבתאי עכבר ntaminating משמעותיים לפגוע ניתוחים במורד זרם של xenografts הסרטני האנושי. כמו פיברובלסטים עכבר להראות efficacies גבוהה ציפוי ושיעורי התפשטות, הם נוטים לגדול יותר תרבויות של תאים סרטניים אנושיים, במיוחד מתרבים subpopulations לאט. תא עכבר נגזר DNA, ה- mRNA, ורכיבים חלבון יכול ניתוח ביטוי גנים הטיה במורד הזרם, רצף של הדור הבא, כמו גם proteome ניתוח 5. כדי להתגבר על המגבלות האלה, פתחנו שיטה מהירה וקלה לבודד תאים סרטניים אנושיים נגעו מרקמות גידול xenografted. הליך זה מבוסס על הדלדול המקיף של תאים ממוצא עכבר על ידי שילוב דיסוציאציה רקמות אוטומטית עם Dissociator המעבדתיים רקמות מיון תא מגנטי. כאן, אנו מראים כי תאי מטרה אנושיים יכולים להיות ניתן להשיג עם purities גבוה מ -96% בתוך פחות מ -20 דקות תלויות בסוג הגידול.

גישות שונות הוצעו כדי לזהות אותך או לרוקן בתאי עכבר המופקים מגידולים אנושיים xenografted, למשל שילוב של נוגדנים ספציפיים העכבר נגד CD45 ואני בכיתה MHC עם זאת, רק תת-אוכלוסיות של תאים עכבר התגלו באמצעות שילובים אלה ואילו השילוב המוצע זוהה CD45 ו MHC אני בכיתה לבטא בתאי עכבר, כמו גם את שאר תאי העכבר נמצאים ברקמות יעד להשתלה (איור 1). ניצול שילוב הרומן הזה של נוגדנים עבור מיון תא מגנטי, תאים סרטניים אנושיים יכולים להיות מבודדים עצמאיים של סוג גידול (איור 2). תאי מתקבל הסרת עכבר מבוסס תאי הליך הפרדת תא מגנטית יכולים להיות מתורבתים, מה שמוביל תרבויות טהורות של תאים סרטניים אנושיים (איור 4). בנוסף, תאי עכבר קיימא יכולים להיות מושגת ותרבותית מןמדגם זהה. מלבד הסרת תאי עכבר, גם פסולת הוסרה על דלדול תא עכבר (MCD) (איור 3). הדלדול המקיף של תאי עכבר כמו גם להוביל הסרת פסולת לניתוחים במורד מולקולרי השתפרו. זה הודגם על ידי השוואת תוצאות המתקבלות רצף exome כולו (WES) בוצעו על חתיכות גידול בכמויות דגימות מדולדלות עכבר תא משלושה נגזרות חולות שונים מודלי גידול xenograft (איורים 5 - 9). הנתונים שלנו מצביעים כי הסרת תאי עכבר לפני ביצוע WES על דגימות גידולי xenograft לא רק מגבירה באופן משמעותי את הסכום הכולל של קורא (איור 5), אלא גם מפחיתה באופן משמעותי את מספר המארח נגזר קורא ממופה הגנום ההתייחסות האנושי (איור 6). כפי בטעות ממופה אלה העכבר קורא להפריע לעתים קרובות באמצעות שיחות SNP, צפינו ירידה חזקה של שקר חזהSNPs לאחר MCD (איורים 7 - 8). לבסוף, הראינו כי הסרת סיליקון ב של העכבר הנגזר קוראה בשיטות ביואינפורמטיקה לא יכול להחליף את ההליך הניסיון לחלוטין, כמו משימה מבוססת רצף חד משמעית מיני ממוצא לא הייתה אפשרית עבור כל הקורא. יתר על כן, בהליך סיליקון לא יכול נכון עבור איכות משופרת וכיסוי לקרוא במקביל גבוה של דגימות מדולדלות חוץ גופייה (איור 9). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54259/54259fig1.jpg" /> איור 1. הקמת קוקטייל נוגדן הכרה כל תאי העכבר פני 14 איברים מרובים. הקרנות באיברים רבים, כולל עור, ריאות, מוח, כליות שרירי שלד, בוצע. איברים אלה מייצגים את רקמות יעד מרכזיות עבור השתלה שלא מבן-מינית. צירופים כגון אלה mou ההכרהse CD45 ו MHC בכיתה אני אפיטופים כבר שימשו כדי לרוקן בתאי עכבר לאחר השתלה שלא מבן-מינו. עם זאת, שילובים סמן אלה מוכרים רק קבוצת משנה של תאי עכבר בכל הרקמות המנותחות. בשנת הקרנות קודמות שילוב של חמישה נוגדנים זוהה המאפשר זיהוי המקיף של כל התאים ממקור עכבר. לוח זה כולל תאי דם אדומים הוא עצמאי של רקמת מוצא (A, B, ו מידע לא מוצג). שונה מ 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54259/54259fig2.jpg" /> איור 2. דלדול מהיר ואמין של תאי עכבר 15. Conjugates של שילוב הנוגדן עם n פאראמגנטיanoparticles שמש לפתח פרוטוקול אופטימיזציה עבור דלדול של תאי עכבר xenografts הסרטני האנושי על ידי תא מגנטי מיון (פרדת תא מגנטית) (א). פרוטוקול הרומן הזה מותר לשם מניעה&gt; 99% של זיהום בתאי עכבר בתוך פחות מ -20 דקות, ללא קשר לסוג הגידול. שברים ניידים המתקבלים הליך הפרדת תא מגנטי תויגו עם הקוקטייל של נוגדני הפאן עכבר נוגדן ספציפי אדם נגד CD326 (EpCAM) (B). שונה מ 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54259/54259fig3.jpg" /> בידוד איור 3. של אדם תאי Glioblastoma. ערכת שחסך בתאי עכבר שמש לבודד תאי גליובלסטומה אדם מן mous המבוגרמוח דואר. במהלך דיסוציאציה של כמויות גדולות של רקמה עצבית פסולת נוצרת בדרך כלל. MCDK מכלת תאים מתים ביעילות פסולה כפי שניתן לראות על ידי העלילה מראה גודל תא מול גרעיניות תא. עם קוקטייל המצומד זה, אפשר היה לחסל&gt; 99% של תאי עכבר זיהום ו&gt; 60% של הפסולת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54259/54259fig4.jpg" /> דלדול איור 4. עכבר תאי מקלת תרבויות Downstream של תאים סרטניים אנושיים 14. פיברובלסטים העכבר לעתים קרובות לעכב את הטיפוח של תאים סרטניים אנושיים לאחר הניתוק של רקמות מושתלות או להוביל תרבויות הטרוגנית. פיברובלסטים לצרף ולהרחיב ביעילות רבה יותר, ובכך overgrowing ג היעד<html> אמות. זה מדאיג מבחני תרבית תאים במבחנה (בדיקות רעילות למשל, תרופה), מאז תיקון מתמטי תופעות נובעות זיהום תאי עכבר הוא בלתי אפשרי ברוב המקרים. הצד השלילי (B) והשברים חיוביים (C) לאחר דלדול עכבר תא היו בתרבית למשך שלושה ימים, קבוע מוכתם עבור סמן פיברובלסטים עכבר ספציפי (vimentin) ואת סמן הגידול האנושי ספציפי CD326 (EpCAM). כביקורת, השבר המקורי המכיל תאי unseparated (א) היה מתורבת ומוכתם גם כן. גם לאחר שלושה ימים של תרבות, אוכלוסייה טהורה כמעט של תאים סרטניים אנושיים נצפתה השבר השלילי (ב), ואילו את החלק היחסי הממוין (א) היה כמעט מגודל על ידי פיברובלסטים. רק חלק קטן של תאי היעד אבד החלק החיובי (C). השתנה מ -14.ge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54259/54259fig5.jpg" /> איור 5. כל הפריטים Exome רצף (WES) של דגימות גידולים לפני ואחרי דלדול תא עכבר (MCD) 15. ערכנו WES על שלושה מודלים xenograft שונים נגזר כליה אנושית, ריאות וסרטן שלפוחית ​​השתן על מנת להעריך את ההשפעה של MCD על איכות נתוני רצף של הדור הבא. DNA מגידולים בתפזורת מתאי גידול מבודד לאחר שחסך בתאי העכבר היה השתמש כדי ליצור ספריות רצף שנתפס exome החלת ערכה ללכוד exome. עבור סידור על מכשיר ברצף שולחן עבודה, ערכה מגיבה ברצף שולחן עבודה 150 מחזורים, נוצל כדי ליצור 75-נ&quot;ב לזווג סוף הקורא. עלייה משמעותית (p &lt;0.05) בצפיפות אשכול (א) וכן aveזעם עלייה בספירת קריאה של 33% (ב) ​​נצפתה על הדגימות המדולדלות של בתאי עכבר, המציין איכות מדגם השתפרה. במקביל, ירידה חזקה של פסולת תאים מתים על MCD יכולה גם לבוא לידי ביטוי על ידי ניתוח תזרים cytometry (ראה איור 3). שונה מ 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/54259/54259fig6.jpg" /> דלדול Cell איור 6. עכבר (MCD) בתוקף מפחית המספר בטעות הממופה העכבר קורא אחרי כל פריטי Exome רצף (WES) 15. כפי oligonucleotides ללכוד המשמש להעשרה ממוקדת של רצפי מקודדי חלבונים נועדו מבוסס על גנום האדם, גידול טרום ראשוני העשרת קטעי דנ&quot;א של fr ממקור אנושיom את התערובת של עכבר תאים אנושיים הייתה צפויה. על מנת להעריך את מספר oligonucleotides לכידת שעשוי לחצות להכליא עם הדנ&quot;א הגנומי העכבר, ערכנו חיפושים תפציץ של כל בדיקה exome ללכוד מהירה אחת נגד גנום העכבר. פרמטרי היישור וכתוצאה ששמשו לקביעת הכלאה צולבת אפשרית. (.. אורך יישור, לא של חוסר התאמה, לא פערים) בהתאם ספי הבחירה, אנו חזינו תגובתיות צולבת של 5 - 10% של בדיקות ללכוד עם תמלילי עכבר (מידע לא מוצג). לאחר גזיר מתאם (trimmomatic v0.32 16), אנו מייפים את הקורא של כל הדגימות נגד הגנום אנושי ועכבר (v0.7.12 BWA 17) וקבענו מהמוצא המשוער שלהם בהתבסס על פרמטרי יישור בהתאמה (פגז LINUX, שורת פקודה פרל) (א). בממוצע 12% של הקורא נגזר דגימות גידולים בתפזורת יוחס בתאי עכבר. סכום זה יכול להיות מופחת ל -0.3% על ידי דלדול מראש של תאי עכבר (B </strong&gt;). כמו ב -15% ממוצעים של עכבר נגזר קורא ממופית בטעות את הגנום האנושי, המקביל ל -1.9% בסך הכל קורא בדגימות הגידול בכמויות 0.04% בתאים הסרטניים הבודדים, השפעה חיובית חזקה של דלדול תא עכבר על ניתוחים במורד זרם ניתן לצפות. איור 6 מדגים את המשימה לקרוא מפורטת גידול בכמויות תאים סרטניים אנושיים מבודדים נגזרים xenograft סרטן שלפוחית ​​השתן. שונה מ 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/54259/54259fig7.jpg" /> איור 7. MCD בתוקף מפחית את מספר SNPs חזוי שווא 15. על מנת לקבוע את ההשפעה של העכבר קורא ממופה הגנום האנושי, קבענו את מספר predicteSNPs ד עבור דגימות xenograft לפני ואחרי MCD. מאחר שלא רקמה בריאה היה זמין עבור השוואה, SNP הוגדרה הבדל בין המדגם רצף ואת הגנום הפניה (hg19). לאחר הסרת כפולים קורא, SNP וקראו INDEL נערך 18 ו הוגבל באזורים אליהם מכוון ערכת ללכוד exome. 63 ± 10% מכלל SNPs ניבאו עבור דגימות גידול בכמויות הגדולות אינה אותרו כבר לאחר שחסך בתאי עכבר, 18 ± 1% היו ספציפיים עבור התאים הסרטניים האנושיים המבודדים (א). בעוד שהראשונים נגרמו בעיקר על ידי עכבר ממופה בטעות קורא את זה האחרון נראה להתגלות בשל ספירת קריאה גבוהה וכיסוי בהתאם גבוה בתוך דגימות תאים סרטניים האנושיות המבודדות. אפקט זה היה גלוי גם עבור indels חזה (B). שונה מ 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של זה</a><html> דמות. <img alt="הספרה 8" src="/files/ftp_upload/54259/54259fig8.jpg" /> איור 8. MCD משפר את חיזוי מרשימות SNPs 15. (א) השפעת MCD על חיזוי SNP בתוך אקסון המקודדים חלבונים של הגן POLA1 19 מודגם. בעוד העכבר ממופה בטעות קורא גרם למספר SNPs ניבא באופן שקרי ב xenograft סרטן הכליה בתפזורת, SNPs אלה חסרים לאחר MCD. בנוסף, MCD גם שיפרה את התחזית של השפעה גבוהה SNPs. לדוגמא, עכבר קורא ממופה הגנום ההתייחסות האנושי במדגם גידול בתפוצה הרחב גרם להרס חזה בטעות של קודון ההתחלה של גן GRIA3 (B). שונה מ 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html> s = &quot;jove_content&quot; FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 9" src="/files/ftp_upload/54259/54259fig9.jpg" /> איור 9. סיליקו דלדול של עכבר נגזר קורא לא יכול מלא להחליף לי n Vitro 15 MCD. קורא צפוי להיות ממוצא העכבר הוסרו מחשוב מנתוני הרצף, וקראו SNP חזר על עצמו. לפי גישה זו, מספר SNPs ניבא עבור דגימות גידולים בתפזורת הופחת באופן משמעותי מ -63% ל -8.5% של המספר הכולל של SNPs (להשוות עם איור 8). עם זאת, זה בגישת סיליקון לא יכול להחליף לחלוטין את במבחנת MCD, במיוחד אם איכות המדגם המשופרת והעלייה במקביל בספירה לקריאה והכיסוי נחשב. שונה מ 15.&quot;_blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells at JoVE.com

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Xenografts הסרטני האנושי הוא vascularized ו הסתננו תאים ממוצא העכבר במהלך שלב צמיחת in vivo. כדי לעקוף את ההטיה הנגרמת על ידי תאי זיהום אלה במהלך ניתוח במורד זרם, פתחנו שיטה המאפשרת דלדול מקיף של כל תאי העכבר על ידי מיון תא מגנטי.

חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

depletion-mouse-cells-from-human-tumor-xenografts-significantly

Research

JoVE Journal

Medicine

12.6K Views.  Miltenyi Biotec GmbH.  Xenografts הסרטני האנושי הוא vascularized ו הסתננו תאים ממוצא העכבר במהלך שלב צמיחת in vivo. כדי לעקוף את ההטיה הנגרמת על ידי תאי זיהום אלה במהלך ניתוח במורד זרם, פתחנו שיטה המאפשרת דלדול מקיף של כל תאי העכבר על ידי מיון תא מגנטי. 

Video: Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor pieces are injected subcutaneously into athymic nude mice (immunocompromised, T cell deficient) to create a bank of tumors and subsequently are passaged into different generations of mice in order to maintain these tumors from patients. Importantly, cellular heterogeneity of the original tumor is closely emulated in this model, which provides a more clinically relevant model for evaluation of drug efficacy studies (single agent and combination), biomarker analysis, resistant pathways and cancer stem cell biology. Some limitations of the PDTX model include the replacement of the human stroma with mouse stroma after the first generation in mice, inability to investigate treatment effects on metastasis due to the subcutaneous injections of the tumors, and the lack of evaluation of immunotherapies due to the use of immunocompromised mice. However, even with these limitations, the PDTX model provides a powerful preclinical platform in the drug discovery process.

Utilizing patient-derived tumors in a subcutaneous preclinical model is an excellent way to study the efficacy of novel therapies, predictive biomarker discovery, and drug resistant pathways. This model, in the drug development process, is essential in determining the fate of many novel anti-cancer therapies prior to clinical investigation.

פיתוח ותחזוקה של גידול נגזר החולה פרה xenograft דגם לחקירת Novel טיפולים נגד סרטן

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

Cancer Research

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when stimulated by T lymphocytes, oncogenic B cells survive and expand autonomously in undefined organ niches. Mantle cell lymphoma (MCL) is one such B cell disorder, where the median survival rate of patients is 4 - 5 years. This calls for the need of effective mechanisms by which the homing and engraftment of these cells are blocked in order to increase the survival and longevity of patients. Therefore, the effort to develop a xenograft mouse model to study the efficacy of MCL therapeutics by blocking the homing mechanism in vivo is of utmost importance. Development of animal recipients for human cell xenotransplantation to test early stage drugs have long been pursued, as relevant preclinical mouse models are crucial to screen new therapeutic agents. This animal model is developed to avoid human graft rejection and to establish a model for human diseases, and it may be an extremely useful tool to study disease progression of different lymphoma types and to perform preclinical testing of candidate drugs for hematologic malignancies, like MCL. We established a xenograft mouse model that will serve as an excellent resource to study and develop novel therapeutic approaches for MCL.

Mantle cell lymphoma (MCL) is a difficult to treat B cell disorder and it is equally difficult to establish a xenograft mouse model of primary MCL to study and develop therapeutics. Here, we describe the successful establishment of MCL xenografts in mice to help understand its underlying biology.

Engraftment גידול במודל של עכברים Xenograft של האדם מנטל לימפומה התא

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research

The discovery and development of immuno-oncology (I-O) therapy in recent years represents a milestone in the treatment of cancer. However, treatment challenges persist. Robust and disease-relevant animal models are vital resources for continued preclinical research and development in order to address a range of additional immune checkpoints. Here, we describe a human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) &#8212; based humanized xenograft model. BGB-A317 (Tislelizumab), an investigational humanized anti-PD-1 antibody in late-stage clinical development, is used as an example to discuss platform set-up, model characterization and drug efficacy evaluations. These humanized mice support the growth of most human tumors tested, thus allowing the assessment of I-O therapies in the context of both human immunity and human cancers. Once established, our model is comparatively time- and cost-effective, and usually yield highly reproducible results. We suggest that the protocol outlined in this article could serve as a general guideline for establishing mouse models reconstituted with human PBMC and tumors for I-O research.

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell PBMC Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology I-O Research

We describe a human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) &#8212; based humanized xenograft mouse model for translational immuno-oncology research. This protocol could serve as a general guideline for establishing and characterizing similar models for I-O therapy assessment.

תא היקפי של דם מונאפרור (PBMC) חרט הומניזציה מודל Xenograft עבור מחקר הטרנסג-אונקולוגיה (I-O)

The discovery and development of immuno-oncology (I-O) therapy in recent years represents a milestone in the treatment of cancer. However, treatment ...

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

In vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate the human disease provide a valuable platform for research into disease pathophysiology and for the preclinical evaluation of novel therapies. We present a variety of methods to generate subcutaneous or orthotopic human HCC xenografts in immunodeficient mice that could be utilized in a variety of research applications. With a focus on the use of primary tumor tissue from patients undergoing surgical resection as a starting point, we describe the preparation of cell suspensions or tumor fragments for xenografting. We describe specific techniques to xenograft these tissues i) subcutaneously; or ii) intrahepatically, either by direct implantation of tumor cells or fragments into the liver, or indirectly by injection of cells into the mouse spleen. We also describe the use of partial resection of the native mouse liver at the time of xenografting as a strategy to induce a state of active liver regeneration in the recipient mouse that may facilitate the intrahepatic engraftment of primary human tumor cells. The expected results of these techniques are illustrated. The protocols described have been validated using primary human HCC samples and xenografts, which typically perform less robustly than the well-established human HCC cell lines that are widely used and frequently cited in the literature. In comparison with cell lines, we discuss factors which may contribute to the relatively low chance of primary HCC engraftment in xenotransplantation models and comment on technical issues that may influence the kinetics of xenograft growth. We also suggest methods that should be applied to ensure that xenografts obtained accurately resemble parent HCC tissues.

Human tumor xenografts in immunodeficient mice are valuable tools to study cancer biology. Specific protocols to generate subcutaneous and intrahepatic xenografts from human hepatocellular carcinoma cells or tumor fragments are described. Liver regeneration induced by partial hepatectomy in recipient mice is presented as a strategy to facilitate intrahepatic engraftment.

דור של תת עורי וintrahepatic אדם xenografts קרצינומה hepatocellular בעכברים עם מערכת חיסון חלשים

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

מודל Murine orthotopic של אדם סרטן ערמונית גרורה

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors

Reversing the immunosuppressive nature of the tumor microenvironment is critical for the successful treatment of cancers with immunotherapy drugs. Murine cancer models are extremely limited in their diversity and suffer from poor translation to the clinic. To serve as a more physiological preclinical model for immunotherapy studies, this protocol has been developed to evaluate the treatment of human tumors in a mouse reconstituted with a human immune system. This unique protocol demonstrates the development of human immune system (HIS, &#34;humanized&#34;) mice, followed by implantation of a human tumor, either a cell-line derived xenograft (CDX) or a patient derived xenograft (PDX). HIS mice are generated by injecting CD34+ human hematopoietic stem cells isolated from umbilical cord blood into neonatal BRGS (BALB/c Rag2-/- IL2R&#947;C-/- NODSIRP&#945;) highly immunodeficient mice that are also capable of accepting a xenogeneic tumor. The importance of the kinetics and characteristics of the human immune system development and tumor implantation is emphasized. Finally, an in-depth evaluation of the tumor microenvironment using flow cytometry is described. In numerous studies using this protocol, it was found that the tumor microenvironment of individual tumors is recapitulated in HIS-PDX mice; &#34;hot&#34; tumors exhibit large immune infiltration while &#34;cold&#34; tumors do not. This model serves as a testing ground for combination immunotherapies for a wide range of human tumors and represents an important tool in the quest for personalized medicine.

This protocol outlines the generation of human immune system (HIS) mice for immuno-oncology studies. Instructions and considerations in the use of this model for testing human immunotherapeutics on human tumors implanted in this model are presented with an emphasis on characterizing the response of the human immune system to the tumor.

בדיקת אימונותרפיה לסרטן במודל עכבר אנושי הנושא גידולים אנושיים

Reversing the immunosuppressive nature of the tumor microenvironment is critical for the successful treatment of cancers with immunotherapy drugs. Murine ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading microorganisms. In addition, neutrophils play a central role in the immune surveillance of tumor cells. They have the ability to recognize tumor cells and induce tumor cell death either through a cell contact-dependent mechanism involving hydrogen peroxide or through antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Neutrophils with anti-tumor activity can be isolated from peripheral blood of cancer patients and of tumor-bearing mice. These neutrophils are termed tumor-entrained neutrophils (TEN) to distinguish them from neutrophils of healthy subjects or na&#239;ve mice that show no significant tumor cytotoxic activity. Compared with other white blood cells, neutrophils show different buoyancy making it feasible to obtain a &#62; 98% pure neutrophil population when subjected to a density gradient. However, in addition to the normal high-density neutrophil population (HDN), in cancer patients, in tumor-bearing mice, as well as under chronic inflammatory conditions, distinct low-density neutrophil populations (LDN) appear in the circulation. LDN co-purify with the mononuclear fraction and can be separated from mononuclear cells using either positive or negative selection strategies. Once the purity of the isolated neutrophils is determined by flow cytometry, they can be used for in vitro and in vivo functional assays. We describe techniques for monitoring the anti-tumor activity of neutrophils, their ability to migrate and to produce reactive oxygen species, as well as monitoring their phagocytic capacity ex vivo. We further describe techniques to label the neutrophils for in vivo tracking, and to determine their anti-metastatic capacity in vivo. All these techniques are essential for understanding how to obtain and characterize neutrophils with anti-tumor function.

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

בידוד ואפיון של נויטרופילים עם תכונות אנטי-סרטניים

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Immunology and Infection

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

גידול ראשוני ובידוד תא MEF לחקר ריאות גרורה

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

דור של חולה סרטן הערמונית נגזר מודלי xenograft ממחזור תאים סרטניים

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Mouse Models of Cancer Study

Mice have long served as models for studying human biology and pathology because of their phylogenetic and physiological similarity with humans. They are also easy to maintain and breed in the laboratory, and hence, many inbred strains are now available for research. Studies on mice have contributed immeasurably to our understanding of cancer biology.
The development of transgenic, knockout, and knock-in mice has led to an exponential increase in their use as model organisms in research, including cancer research. A gene-of-interest can be added or deleted from a mouse&#8217;s genome using genetic engineering techniques, and if it causes tumor initiation in mice, it is highly likely to be a cancer-critical gene in humans. In addition, mouse models such as reporter mice can also be used to study the crucial stages of tumor initiation and their progression to aggressive cancers. In such mice, a reporter gene with luminescence or fluorescence tags is inserted into the cells under study to monitor their growth and proliferation.
Pre-clinical studies in mouse models serve as a perfect step between in vitro studies on cell cultures and clinical studies in humans. They can be used for investigating in vivo pharmacokinetics, toxicity, and anti-tumor efficacy of numerous chemotherapeutic agents before any of the drugs go to clinical trials. However, since mouse tumor cells or immune responses may not exactly represent the tumorigenic process in humans, mouse models have been developed that can closely mimic the tumor progression and immune responses in humans, for example, human tumor xenografts in immunocompromised mice or humanized mouse models.
In vivo testing in animals, including mice, can often raise ethical concerns. While it is true that experimentation in animals causes suffering, the benefits of animal experimentation in drug discovery are undeniable. Therefore, animal studies should be strictly avoided wherever alternative testing methods are available. In addition, experiments on animals should only be conducted after in vitro studies have been successfully performed on suitable cell lines.

Mouse Models of Cancer and Pre-clinical Testing of Cancer Drugs

מודלים עכבריים של חקר הסרטן

Mice have long served as models for studying human biology and pathology because of their phylogenetic and physiological similarity with humans. They are ...