טיפה דיגיטלית PCR מעניק דיוק ורגישות משופרים בהשוואה ל- PCR כמותי. זוהי שיטה פשוטה עבור PCR טיפה דיגיטלית הדורשת ציוד מינימלי וללא מומחיות. תחליב בתבנית חלקיקים הוא שיטה נטולת מיקרופלואידים של תחליב שאינו דורש ציוד מיוחד.
בנוסף, אמולסיה מתרחשת על פני תקופה של שניות ומשתן קשקשים לנפח המכל. עבור חרוזים מסחריים, להוסיף 0.5 גרם של חלקיקי פוליאקרילמיד מיובשים תואמים תחליב תבנית חלקיקים, או PTE, כדי 30 מיליליטר של מים סטריליים בצינור חרוטי 50 מיליליטר, ומערבבים היטב. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
לייצור מיקרופלואידי של חרוזים, יוצקים מיליליטר אחד של פוטוארסיסט למרכז של רקיק סיליקון בגודל 3 אינץ', ולאחר מכן מסובבים אותו במהירות של 500 סל"ד למשך 30 שניות, ואחריו 1250 סל"ד למשך 30 שניות. מניחים את הוופל על פלטה חמה ל-95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לאדות את הממס. אבטחו את מסכת הצילום על רקיק הסיליקון עם שקופית זכוכית כיסוי, וחשפו את הוופל תחת נורית UV קולימת למשך 2.5 דקות.
מניחים את הוופל על פלטה חמה ל-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות לאפייה לאחר החשיפה. לפתח את רקיק הסיליקון photoresist על ידי טבילה אותו באמבטיה של 100%PGMEA עד 15 דקות. יש לשטוף את הוופל ב-100% PGMEA טריים, ואחריו 100%איזופרופנול.
יבש את הוופל, ואז יבש אותו על פלטה חמה להגדיר 95 מעלות צלזיוס במשך דקה אחת, ומניחים אותו לתוך צלחת פטרי נקיה שלושה אינץ '. מערבבים את בסיס הסיליקון PDMS ומרפאים ריאגנט ביחס של 10:1, ואז מבטלים את ה-PDMS המעורבים באמצעות חיטוי תחת ואקום עד שלא ניתן לצפות בבועות אוויר. יוצקים את PDMS מנומס בצלחת פטרי, להבטיח כי רקיק הסיליקון הוא שקוע לחלוטין.
Degas את רקיק הסיליקון ו PDMS, ולאחר מכן לרפא את PDMS על ידי הצבת רקיק הסיליקון לתוך תנור להגדיר 65 מעלות צלזיוס לפחות 60 דקות. Excise בלוק של PDMS המכיל את התכונות microfluidic מן צלחת פטרי, באמצעות אזמל. חבט את הכניסות ואת השקעים לתוך בלוק PDMS באמצעות אגרוף ביופסיה 0.75 מ"מ.
לאחר מכן להסיר כל אבק וחלקיקים עם היישום החוזר והסרה של סרט אריזה למשטח הבלוק. נקה שקופית זכוכית על ידי שטיפה עם 100% איזופרופנול, ולאחר מכן ייבוש האוויר את פני השטח. פלזמה לטפל הן שקופית זכוכית PDMS עם מיליבר אחד של פלזמת חמצן במשך דקה אחת, באמצעות bonder פלזמה.
הצמד את ה-PDMS למגלשת הזכוכית על-ידי הצבת ה-PDMS שטופלו בפלזמה עם תכונות הפונות כלפי מטה אל מגלשת הזכוכית, צד מטופל בפלזמה הפונה כלפי מעלה. מניחים את השקופית לתוך תנור להגדיר 65 מעלות צלזיוס לפחות 30 דקות, כדי להשלים את מליטה. לטפל בכל הערוצים microfluidic עם טיפול פני השטח פלואורין כדי להבטיח הידרופוביה פני השטח, ולאחר מכן לאפות את המכשיר ב 65 מעלות צלזיוס לפחות 10 דקות.
טען הן פוליאקרילמיד, או PAA, והן הידרופלואורו אחר, או HFE, מזרקים המכילים תמיסה למשאבות מזרק. חבר את שני המזרקים למכשיר המיקרופלואידי באמצעות צינורות פוליאתילן. הפעל את מכשיר דור טיפה ולאסוף מיליליטר אחד של טיפות בצינור איסוף 15 מיליליטר, ולאחר מכן דגירה במשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר עבור פילמור.
לאחר הדגירה, להסיר את השכבה התחתונה של שמן על ידי pipetting. הוסף מיליליטר אחד של 20% PFO בשמן HFE לצינור איסוף 15 מיליליטר כמו demulsifier כימי. לאחר ערבוב, לסובב את צינור אוסף 15 מיליליטר ב 2000 x g, במשך שתי דקות.
הסר את השכבה התחתונה על-ידי pipetting, וחזור על התהליך פעם נוספת. הוסף שני מיליליטר של 2% סורביטן מונולאט בהקסאן לצינור איסוף 15 מיליליטר ומערבולת זה. לסובב את הצינור ב 3000 x g במשך שלוש דקות, ולהסיר את supernatant על ידי pipetting כדי להסיר את פתרון פעילי השטח.
חזור על זה פעמיים. הוסף חמישה מיליליטר של חיץ TEBST ומערבב היטב, ולאחר מכן לסובב למטה ב 3000 x g במשך שלוש דקות ולהסיר את supernatant על ידי pipetting. חזור על זה שלוש פעמים, ואז resuspend בחמישה מיליליטר של TEBST.
הכן את חלקיקי polyacrylamide עבור תחליב תבנית חלקיקים על ידי centrifuging ב 6000 x g במשך דקה אחת כדי לגלול את החלקיקים. לאחר מכן להסיר את supernatant על ידי pipetting, ו resuspend הכדור במים סטריליים. חזור שלוש פעמים כדי להבטיח הסרה של כל TEBST שיורית.
הכן את שלב הפיזור בצינור צנטריפוגה טרי של 15 מיליליטר, באמצעות תערובת מאסטר PCR, הפריימרים המתאימים, וגשוש הידרוליזה פלואורסצ'ין, כמתואר בכתב היד של הטקסט. דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות תחת תסיסה עדינה, באמצעות סיבוב צינור. צנטריפוגה שלב הפיזור ב 6000 x g במשך דקה אחת ולהסיר את supernatant.
הוסיפו לגלילית מיקרוליטר אחת של DNA גנומי של Saccharomyces cerevisiae, וערבבו היטב על ידי צנרת או הקשה נמרצת. הוסף 200 מיקרוליטרים של 2%פלואורוסורפקטנט בשמן HFE לצינור, לתחמולה. הוציאו את הכדור על ידי צנרת או הקשה על הצינור, ולאחר מכן מערבולת ב 3000 סל"ד במשך 30 שניות.
אפשר אמולסיות להסתפק דקה אחת, ולאחר מכן להסיר 100 microliters של שלב השמן התחתון, ולהחליף נפח זה עם 2% פלואורוסורפקטנט טרי בשמן HFE. הפוך בעדינות את הצינור מספר פעמים לערבב. חזור על זה שלוש פעמים או יותר, עד טיפות לווין קטנות מוסרות.
לאחר שתיים עד חמש דקות של התיישבות, להסיר את שלב השמן התחתון. החלף נפח זה עם 5% פלואורוסורפקטנט בשמן פלואורוקרבון. Pipette 100 מיקרוליטרים של מדגם לתוך צינורות PCR 200 מיקרוליטר, ולהניח את צינורות PCR לתוך thermocycler.
Pipette המדגם על שקופית ספירה עבור הדמיה פלואורסצנטית, ותמונה המדגם. תחליב בתבנית חלקיקים מעניק מונודיספרסיות מעולה. כמו עודף supernatant מוסר ייצוב פעילי שטח מתווסף, ואת המדגם הוא מערבולת כדי ליצור את אמולסיה.
הטיפות המתקבלות מורכבות מלטיבה של חלקיקים ודגימה מימית המכילה ריאגנטים ומולקולות מדגם או תאים הדרושים לתגובה. טיפות פולידיספרס עם חלקיקים טמפלטינג מצביעות על מערבולת לא מספקת. בעיה נוספת היא דור של לוויינים מוגזמים, אשר יעילות אנקפסולציה נמוכה יותר.
לוויינים צריכים להוות לא יותר מ-10% מנפח הדגימה הכולל. הם יכולים להיות מנוקים מן אמולסיה על ידי כביסה עם שמן טרי. השירות של PTE ניתן להדגים ב- PCR דיגיטלי כאשר טיפות המכילות מטרות מוגברות הופכות לפלורסנט, ומאפשרות כמות ישירה של מטרות.
טיפות הפלואורסצנטיות מניבות מעט חיוביות כאשר היעד נדיר, ורבות כאשר הוא שופע. תוצאות אלה ניתנות לחזרה באמצעות חלקיקי פוליאקרילמיד זמינים מסחרית, השגת מדידות מדויקות על פני אותו טווח. הסרת supernatant משלב הפיזור חשוב אנקפסולציה מדגם.
הכרת הנפח של הכדור ואת supernatant יכול לעזור לזהות את הממשק בין השניים. כאשר יש ספק, לטעות בצד של הסרת supernatant.
