עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות של NIH (HL118532, HL120142, CA187692), דוד &amp; לוסיל פקארד קרן, קמיל &amp; הנרי דרייפוס קרן, ואת בורוז ברוך הבא הקרן. ASP נתמכה בחלקה על ידי מלגת כבוד שרלוט אליזבת פרוקטר.

1. הכנת פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין פתרון 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל של אינסולין, לדלל את המניות אינסולין אבקת עם חומצה הידרוכלורית 5 מ&quot;מ (HCl) ב DH 2 O (500 אינסולין מ&quot;ג ב 100 מ&quot;ל ממס). הכן 100 מ&quot;ל ממס על ידי הוספת 50 μl של מרוכז HCl ל -100 מ&quot;ל מים מזוקקים (DH 2 O). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את פתרון 1x של PBS, לדלל 10x המלוח שנאגר-פוספט (PBS) פתרון מניות 1X עם DH 2 O בתנאים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את polydimethylsiloxane (PDMS) אלסטומר פתרון כדלקמן: מערבבים את prepolymer PDMS יחד עם הסוכן ריפוי בתוך 10: 1 (w: w) יחס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדיום תרבית תאים כדלקמן: עד 500 מ&quot;ל של מדיום הנשר שונה של המניות Dulbecco: תערובת מזין F-12 (DMEM / F-12), להוסיף 10 מ&quot;ל של סרום שור העובר סטרילי (FBS), 500 μl של מגיב גנטמיצין, ו 500 μl של 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​אינסולין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את אלבומין 1% שור (BSA) בתמיסה 1x PBS, להוסיף 1% (w: פתרון v) של אבקת BSA כדי 1X PBS ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין פתרון 4 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של סוג שור לנטרל שאני קולגן, להוסיף 50 μl 10x תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) חיץ, 30 μl 0.1 N נתרן הידרוקסידי (NaOH), 30 μl המדיום הסלולרי תרבות, ו -400 μl של קולגן המניות כדי צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge צונן. מערבבים לאט על ידי pipetting למעלה ולמטה; למנוע החדרת בועות. כדי להסיר בועות, בקצרה צנטריפוגות את התערובת על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון מקבע על ידי דילול 16% paraformaldehyde 1: 4 (v: v) ב 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון תיוג גרעינים על ידי דילול פתרון תיוג גרעיני מנייה 1: 1,000 (v: v) ב 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן מלוח 0.3% פוספט שנאגר והדטרגנטים (PBST) פתרון על ידי ערבוב PBS 1x עם 0.3% (v: v) חומר ניקוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ חסימת ידי דילול עז בסרום 01:10 (v: v) 0.3% PBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון נוגדן ראשוני של חלבון מסוים של עניין על ידי דילול הפרימרי נוגדן (למשל, קינאז נגד מוקדי הדבקה ארנב (FAK)) 1: 200 (v: v) בחסימת המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון נוגדנים משני על ידי דילול נוגדן פלורסנט מצומדות-בדיקה (למשל, עז נגד ארנב) 1: 1,000 (v: v) בחסימת המאגר. </li></ol> 2. הכנת חותמות אלסטומרי עבור 3D micropatterning הערה: בולי אלסטומרי נעשים עם PDMS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון PDMS באותו יחס כפי שמתואר בשלב 1.3 ומערבבים היטב. מניחים את התערובת בתא ואקום למשך 15-30 דקות כדי להסיר בועות אוויר אשר הוצגו במהלך תהליך ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הפתרון degassed לתוך פלסטיק לשקול סירה או צלחת פטרי המכילה מאסטר סיליקון כי הוא בדוגמת lithographically עם תכונות של הגיאומטריה הרצויה. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, לרפא פתרון PDMS ב 60 מעלות צלזיוס במשך ~ 12 שעות. הערה: המאסטרים סיליקון הם להתאמה אישית; פרוטוקול זה משתמש מבנים מלבניים עם ממדים של 50מיקרומטר x 200 מיקרומטר x 50 מיקרומטר במרווחים 200 מיקרומטר. מאסטרי סיליקון יכולים להתבצע באמצעות טכניקות photolithography סטנדרטיות. בקצרה, גידול photoresist מבוסס אפוקסי הוא ספין מצופה על גבי פרוסות סיליקון. מסכה המפרט את התכונות חותמת הרצוי מושם על גבי פרוסות סיליקון מצופה photoresist, אשר נחשף אז לאור UV. התכונות הרצויות לא חוסמות את המסכה נחשפות האור photoresist במקומות אלה הופך crosslinked, והשאר של ציפוי photoresist הוא מסיס וניתן נשטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר PDMS ריפא סביב התכונות הרצויות על המאסטר סיליקון, להסיר את PDMS ואדון ממיכל פלסטיק. פרד בזהירות את PDMS מן פרוסות סיליקון ולהסיר PDMS העודף מרחבי התכונות המוטבעות באמצעות סכין גילוח נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו לחתוך את PDMS בדוגמת עם תכונות מוטבעות לתוך בולים מלבנים פרט (~ 8 מ&quot;מ x 5 מ&quot;מ) עם סכין גילוח. אחסן תכונה בצד למעלה הללו CLEצלחת פטרי 100 מ&quot;מ קוטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנוסף לכך, השתמש פתרון PDMS כמתואר בשלב 1.3 לעשות תומך עבור בולים מלבני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות coater ספין, להפיץ ~ 2-3 גרם של הפתרון PDMS באופן שווה על צלחת 100 מ&quot;מ קוטר פטרי לרפא את PDMS עבור ~ 12 שעות ב 60 ° C כמו בשלב 2.1. לאחר מכן, באמצעות סכין גילוח, לחתוך את השכבה הדקה של PDMS למלבנים (~ 5 מ&quot;מ x 2 מ&quot;מ). הערה: שני תומך נדרש עבור כל חותמת PDMS עשתה צעד 2.3. התומך ניתן לאחסן בצלחת 100 מ&quot;מ קוטר פטרי שמכילה את חותמות PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הבולים ותומכים PDMS יכולים לשמש תרבית תאים, לעקר על ידי טבילה 70% אתנול ויבש באמצעות aspirator בתוך ארון בטיחות ביולוגי (מכסה מנוע תרבית תאים). </li></ol> 3. הכנת רקמות אפיתל 3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארון בטיחות ביולוגית, להוסיף טיפה של כ 50 μl של BSA 1% ב PBS בראש כל חותמת. מניח את האגל מכוסה בולים ב 4 מעלות צלזיוס למשך תקופה מיניאמא של 4 שעות על מנת להבטיח כי BSA adsorbs אל פני השטח של הבול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון BSA לשאוב מן בולי PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את פני השטח של בולים פעמיים עם תרבית תאים בינוניים (50 μl לכל לשטוף לכל חותמת צריך להספיק), aspirating אחרי כל שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טפול בולי PDMS מעוקר תומך באמצעות פינצטה נירוסטה מעוקלת. בארון בטיחות ביולוגי, להוציא אחד 35 מ&quot;מ קוטר צלחת בתרבית רקמה לכל PDMS חותם. בכל צלחת, נשכב שתי תמיכות PDMS מופרדים על ידי מרחק מעט פחות מאורך של בולים PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פינצטה, לעקר coverslips זכוכית עגול כמו רבים (15 מ&quot;מ קוטר, # 1) כפי שיש בולים PDMS באמצעות אתנול 70%. לשאוב את הנוזלים העודפים coverslips תוך החזקת אותם בפינצטה. אחסן את coverslips שטף בצלחת פטרי 100 מ&quot;מ קוטר נפרדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר ~ 50 μl של תערובת קולגן שווה לצפות את פני השטח של כל PDMS חותמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוףכל PDMS מצופה קולגן להחתים עם פינצטה ו להפוך אותם בעדינות. מנמיכים את הבולים הפוכה על גבי PDMS תומך ערוכים בתרבית רקמה 35 מ&quot;מ קוטר השביעו כך קולגן הוא בין חותמת והחלק התחתון של המנה בתרבית רקמה. דגירת המנות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר ~ 50 μl של תערובת קולגן הנותרים על כל אחד coverslips עגול (מאוחר יותר, אלה יוצבו על גבי רקמות מהונדסות כדי לתמצת אותם לחלוטין קולגן) דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג צלחת בתרבית רקמת 100 מ&quot;מ קוטר המכילה תאי אפיתל (לשעבר. EpH4 עכבר חלב תא אפיתל) ב ~ 40% confluency. לשאוב את המדיום תרבית תאים ולשטוף פעם עם 10 מ&quot;ל 1x PBS. הוסף 2 מ&quot;ל של טריפסין אל התאים לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 8 מ&quot;ל של מדיום תרבות טרי כדי בצלחת בתרבית רקמה המכילה תאים trypsinized, ניתוק תאים חסיד הנותרים כל מצלחת. מערבבים בעדינות על ידי pipetting ולהעביר את התערובת לתא צינור צנטריפוגות חרוטי 15 מ&quot;ל ב 100 × גרם במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant מהצינור חרוטי ו resuspend התא גלולה במדיום תרבית תאים. באמצעות hemocytometer, לספור את התאים כדי לקבוע את הריכוז של השעיה. התאם את עוצמת ההשעיה לקבל ריכוז סופי של ~ 10 6 -10 7 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את דגימות קולגן בג&#39;ל מן החממה. באמצעות פינצטה, בעדינות להרים את בולי PDMS ישר כלפי מעלה כדי לנתק אותם מן קולגן היצוק וזורק אותן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר ~ 30 μl של השעית התא המרוכזת על פני השטח של כל ג&#39;ל המכיל קולגן חללים יצוקים של גיאומטריה רצויה. שים את התאים תחת מיקרוסקופ brightfield עם מטרת NA 10X / 0.25 ואילו צד טלטול המנות בעדינות לצד כדי לקדם תא שיקוע בתוך החללים. החללים צריכים להתמלא בתוך דקות ~ 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי rסר תאים עודפים מרחבי החללים, להטות כל מנה בתרבית רקמה על צידו בעדינות לוותר ~ 400 μl תרבית תאים בינוניים על פני השטח של ג&#39;ל קולגן. לשאוב את הנוזל וחזור על לשטוף 1-2 פעמים יותר, לבדוק את ג&#39;ל קולגן מתחת למיקרוסקופ בין כל שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי התאים העודפים נוקו מכל רחבי החללים מלאי תא עובש קולגן, למקם את הכלים בתרבית הרקמה לתוך תרבית תאי חממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, באמצעות פינצטה, בעדינות להפוך את coverslips בכיתה מצופה קולגן ומניח אותם על גבי תבניות קולגן מלאת תא כזה כי קולגן מן coverslips טפסי כובע מעל החללים מלאי תא. דגירת הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כמוסות קולגן דבקו עובש קולגן מלא התא, לוותר ~ 2-2.5 מ&quot;ל תא בינוני תרבות באיטיות על coverslip זכוכית על גבי ג&#39;לים. תרבות הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1-3 ימים. הערה:24 שעות לאחר זריעה הראשונית, ניתן לטפל ברקמות האפיתל עם גורמי גדילה כגון גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) או גורם גדילה hepatocyte (HGF) כדי לגרום הסתעפות. </li></ol> 4. Immunofluorescence וניתוח תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את מדיום תרבית תאים מן המנות בתרבית רקמה ולהוסיף פתרון מקבע מספיק כדי לכסות את הג&#39;לים המכיל תא. דגירה מנות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות על שייקר ב 200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב מקבע, למלא את הכלים בתרבית רקמה עם PBS 1x, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות על שייקר ב 200 סל&quot;ד. חזור פעמים עבור שלושה שוטף כולל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לתייג גרעינים: לשאוב את PBS מצלחת בתרבית רקמה ולהחליף עם פתרון Hoechst. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15-20 דקות. כדי להכתים עבור FAK או סמן אחר כי ניתן לזהות עם נוגדנים, דלג לשלב 4.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון התיוג הגרעיני ולשטוף את הגרם המכיל תאיםאלס שלוש פעמים עם 1x PBS כמו בשלב 4.2. ניתן לאחסן דגימות ויטראז ב PBS 1x ב 4 ° C עד לשימוש נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכתים עבור החלבון של עניין: לשאוב את PBS מנות בתרבית רקמה, להוסיף 300 μl של 0.3% PBST, דגירה מדגם בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS, לכסות את הג&#39;לים עם חסימת חיץ, דגירה על שייקר (200 סל&quot;ד) בטמפרטורת החדר למשך כ -4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את חיץ החסימה, לכסות את הג&#39;לים עם פתרון נוגדן ראשוני, דגירה על שייקר ב 200 סל&quot;ד הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הפתרון נוגדן ראשוני, ולהוסיף פתרון 0.3% PBST, דגירה על שייקר ב 200 סל&quot;ד בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לשאוב PBST וחזור כל 30 דקות במשך 3-4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 4.7 ו -4.8, הפעם דוגר עם פתרון הנוגדנים משני. עוטפים את הכלים בתרבית רקמה עם רדיד אלומיניום על מנת למנוע photobleaching של נוגדנים משני. לאחר הפינהלשטוף l, ניתן לאחסן דגימות מוכתמות 1x PBS על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש דוגמאות, להשתמש מטרת NA 10X / 0.30 התמקדה midplane של רקמות אפיתל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש בגרעיני תאים, דגימות קבעו את דימויה שסומנו בסמן גרעיני באמצעות מטרת NA 10X / 0.30 תחת תאורת UV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש דגימות מוכתמות עבור חלבון של עניין, תמונה באמצעות מטרת NA 10X / 0.30 על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור מפות תדירות חלבון מכתים של רקמות מרובות (בדרך כלל 50 או יותר) של גיאומטריה ראשונית זהה, היבוא ראשון כל אחד את התמונות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה רגילה (ראה חומרים) ולהמיר אותם 8 סיביים בגוונים אפורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי סף תמונות אלה, להמיר אותם לפורמט בינארי (כלומר, halftone / שחור ולבן) על ידי הגדרת נקודת חיתוך בגווני אפור; grayscale ערכים מתחת לסף להיות שחורים, ואלה מעל הסף הפכו לבן. ואז, לשלבכל אחת מהתמונות בינארי הבודדות לתוך ערימת תמונה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לרשום את התמונות המוערמות (כלומר, ליישר או להתאים אותם) בתוכנת הניתוח. חבילות תוכנה לניתוח תמונה רבות מגיעות עם תוסף רישום זמין בחינם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכל תמונה בערימה כתבנית עבור היישור של התמונה הבאה, כך התמונות בערימה כולו מיושרות על ידי התפשטות. לבסוף, כיסוי (פרויקט) את התמונות בערימת התמונה המיושרת המבוססות על עצמה ממוצעת כדי ליצור תמונה אחת עם מפת תדר פיקסל. תמונה זו אז יכולה להיות בצבעים באמצעות תוכנה לעריכת תמונות של בחירת 10,11. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Affolter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tube+or+not+tube:+remodeling+epithelial+tissues+by+branching+morphogenesis.">Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis.</a> Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).</li><li>Zhu, W., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+signaling+in+the+regulation+of+branching+morphogenesis.">PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis.</a> Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).</li><li>Sternlicht, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+stages+in+mammary+gland+development:+the+cues+that+regulate+ductal+branching+morphogenesis.">Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis.</a> Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).</li><li>Fata, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAPK(ERK-1,2)+pathway+integrates+distinct+and+antagonistic+signals+from+TGFalpha+and+FGF7+in+morphogenesis+of+mouse+mammary+epithelium.">The MAPK(ERK-1,2) pathway integrates distinct and antagonistic signals from TGFalpha and FGF7 in morphogenesis of mouse mammary epithelium.</a> Dev Biol. 306 (1), 193-207 (2007).</li><li>Ip, M. M., Darcy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+mammary+primary+culture+model+systems.">Three-dimensional mammary primary culture model systems.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1 (1), 91-110 (1996).</li><li>Lo, A. T., Mori, H., Mott, J., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+three-dimensional+models+to+study+mammary+gland+branching+morphogenesis+and+functional+differentiation.">Constructing three-dimensional models to study mammary gland branching morphogenesis and functional differentiation.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 103-110 (2012).</li><li>Nelson, C. M., Vanduijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+geometry+determines+sites+of+mammary+branching+morphogenesis+in+organotypic+cultures.">Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures.</a> Science. 314 (5797), 298-300 (2006).</li><li>Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+patterns+of+mechanical+stress+are+required+for+branching+morphogenesis.">Endogenous patterns of mechanical stress are required for branching morphogenesis.</a> Integr Biol (Camb). 2 (9), 424-434 (2010).</li><li>Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+mechanical+strains+and+stresses+around+quiescent+engineered+three-dimensional+epithelial+tissues.">Mapping of mechanical strains and stresses around quiescent engineered three-dimensional epithelial tissues.</a> Biophys J. 103 (1), 152-162 (2012).</li><li>Gjorevski, N., Piotrowski, A. S., Varner, V. D., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+tensile+forces+drive+collective+cell+migration+through+three-dimensional+extracellular+matrices.">Dynamic tensile forces drive collective cell migration through three-dimensional extracellular matrices.</a> Sci Rep. 5, 11458 (2015).</li><li>Zhu, W., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+regulates+branch+initiation+and+extension+of+cultured+mammary+epithelia+via+Akt+and+Rac1+respectively.">PI3K regulates branch initiation and extension of cultured mammary epithelia via Akt and Rac1 respectively.</a> Dev Biol. 379 (2), 235-245 (2013).</li><li>Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differentiation+and+alveolar+morphogenesis+of+primary+mammary+cultures+on+reconstituted+basement+membrane.">Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane.</a> Development. 105 (2), 223-235 (1989).</li><li>Hirai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epimorphin+functions+as+a+key+morphoregulator+for+mammary+epithelial+cells.">Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells.</a> J Cell Biol. 140 (1), 159-169 (1998).</li><li>Pavlovich, A. L., Manivannan, S., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+stroma+induces+branching+morphogenesis+of+engineered+epithelial+tubules.">Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules.</a> Tissue Eng Part A. 16 (12), 3719-3726 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

The protocol described above outlines a method to produce identical epithelial tissues of pre-defined shape, enabling spatial control of the mechanical stress experienced by cells in the tissue. An elastomeric mold is used to create cavities in type I collagen that are then filled with epithelial cells and covered with an additional collagen layer such that cells are completely encapsulated in a 3D collagen matrix environment. Further culture of these tissues and treatment with growth factors to induce branching from the initial architecture make this system amenable for the study of branching morphogenesis of epithelial cells. There are several critical steps in the protocol. The first is lifting the PDMS molds straight upwards from the gelled collagen prior to cell seeding. Any horizontal movement during this step will distort the cavities, and they will no longer retain the desired geometry. Then, after the cavities have been seeded with cells, it is important to carefully wash off any excess cells that remain on the surface, as these may interfere with the behavior of the patterned tissues, particularly if they are very close to the tissues. Washing too rigorously, however, may result in cells being washed out of the cavities. Lastly, in the final micropatterning step when the cell-containing collagen gels are being immersed in culture medium, it is important to add the medium slowly and directly on top of the coverslip. Adding medium to the side of the dish away from the coverslip may result in detachment of the coverslip and the collagen lid. Each of these steps needs to be performed with care to achieve the best results.
Over the past few decades, several culture models have emerged for the study of epithelial morphogenesis, many of which involve the ex vivo culture of intact organs or explants of organs. Major advantages of culturing tissue taken directly from an animal are that tissue architecture remains intact and that cell-cell interactions are maintained. However, these models are not readily amenable to studies investigating the specific effects of a particular cell type or physical microenvironment. Additionally, organs and organ explants can be fragile and difficult to culture ex vivo. Others used primary mammary epithelial cells12, in which gene expression can be more readily manipulated, though this method does not conserve in vivo tissue architecture. Moreover, like intact organs, these cells can also be difficult to culture for long periods of time5. There is a need, therefore, for more robust culture models of epithelial morphogenesis that can be more precisely controlled and readily perturbed to gather reproducible data. 
A widely used 3D cell culture technique is the formation of epithelial cell clusters embedded in collagen or other ECM proteins11,13. Disadvantages of this technique, however, include the inability to precisely control or predict the location of clusters within the gel, cluster size and shape, and branching sites. In addition, it is difficult to manipulate or measure the mechanical cues experienced by cells in different regions of the tissue clusters. Engineered tissues enable better control of these parameters.
The engineered tissue protocol described here is an easy to use, versatile, and reproducible 3D cell culture method that eliminates the heterogeneity commonly found in ex vivo culture systems and 3D clusters. Such engineered cell culture models provide a platform for more precise control of physical and biochemical signals, and results can be easily combined with computational models to predict the effects of perturbations or measure cellular forces using techniques such as traction force microscopy (TFM)9,10. A caveat of the model system, however, is that it does not completely replicate the cellular, chemical, and physical microenvironment within the mammary gland in vivo. Nonetheless, essentially all parts of the system are modifiable: including the cells used (in which gene expression can also be altered by transfection), tissue geometry, ECM composition, and other biochemical factors (ex. growth factors). Primary mammary epithelial cells can also be cultured in this system; they form a lumen and undergo branching morphogenesis from the same locations as immortalized cell lines7. Moreover, the model can be modified to incorporate other cell types to more appropriately represent the native mammary gland microenvironment14, or to investigate the underlying mechanisms that give rise to any branched organ.

ההתפתחות של רקמות אפיתל מסועפות, המכונות הסתעפות morphogenesis, מוסדרת על ידי נגזר תאים, פיסיים, וגורמים סביבתיים. בלוטת החלב, הסתעפות morphogenesis הוא תהליך חוזר ונשנה שדרכו מודרך נדידת תאים קולקטיבית יוצרת אדריכלות עץ דמוי. השלב הראשון הוא היווצרות ניצן ראשית ממנהל צינוריות החלב, ואחריו ייזום סניף ואת התארכות 1,2. פלישה של סניפים לתוך stroma שמסביב היא מושרה על ידי השחרור המערכתי של הורמוני סטרואידים בגיל ההתבגרות. ניצנים ראשוניים חדשים ולאחר מכן ליזום מקצות סניפים קיימים, ותהליך זה ממשיך ליצור עץ אפיתל 3. למרות אותות ביוכימיים רבים חשוב זוהו, הבנה מקיפה של מנגנונים ביולוגיים תא המנחים תהליך התפתחותי מורכב זה כרגע חסר. יתר על כן, מחקרים מכניסטית על ההשפעות של רמזים ספציפיים שקשה לפרק מן ההתנסותמפעלי in vivo, פרעות spatiotemporal מדויקות כפי ומדידות הם בדרך כלל לא אפשריים. תלת ממדי (3D) טכניקות תרבות, כגון תרבות איבר שלמה, organoids העיקרי, ומודלי תרבית תאים, הם כולים שימושיים באופן שיטתי חוקר את מנגנוני רקמת המורפוגנזה 4-6. אלה יכולים להיות שימושיים במיוחד לקביעת ההשפעות של גורמים ספציפיים בנפרד, כגון כוחות מכאניים אותות ביוכימיים, על מגוון רחב של התנהגויות תא, כולל הגירה, שגשוג, והבחנה. 6 דגמי תרבית תאים מהונדסים, בפרט, בקלות לאפשר ההפרעות של תאים בודדים microenvironment שלהם. מודל תרבות אחת כזו משתמש בגישה מבוססת microfabrication להנדס רקמות אפיתל חלב מודל עם מבנה 3D מבוקר בעקביות reproducibly יוצרות סניפים נודדים קולקטיבי כאשר מושרה עם אגורמי גדילה ppropriate. היתרון העיקרי של המודל הוא היכולת לתפעל בדיוק ולמדוד את ההשפעות של גורמים פיסיים ביוכימיים, כגון דפוסי לחץ מכאני, עם ביטחון סטטיסטי גבוה. טכניקה זו, יחד עם מודלים חישוביים, כבר נעשה שימוש כדי לקבוע את התרומה היחסית של אותות פיזיים ביוכימיים הדרכתו של התפתחות תקינה של רקמות אפיתל החלב epithelia קנים אחרים 7-11. אנו מציגים כאן פרוטוקול מפורט לבניית רקמות מודל אלה, אשר יכול להתארך בקלות לסוגים אחרים של תאים תאי מטריקס (ECM) ג&#39;לים, ואשר משמש ככלי פוטנציאל בדיקה של הרפוי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS curing agent</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithographically patterned silicon master</td>
			<td>self-made</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic weigh boat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-732-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm-diameter Petri dishes</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>D-2550-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol 200 Proof</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>111000200</td>
			<td>Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>American Safety Razor</td>
			<td>620179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:1 Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium : Ham&#8217;s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30023FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I6634-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221465-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine type I collagen (non-pepsinized)</td>
			<td>Koken</td>
			<td>IAC-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A-7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved stainless steel tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm-diameter tissue culture dishes</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>T-2881-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>C-3394-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Safe-Lock Tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter</td>
			<td>Bellco Glass Inc.</td>
			<td>Special order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% 1X Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100503-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N9300260</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HGF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H 9661</td>
			<td>Resuspended in dH2O at 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse FAK antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AMO0672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for color-coding pixel frequency maps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (ImageJ)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering three-dimensional epithelial tissues embedded within extracellular matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

סכמטית כללית של microfabrication רקמות אפיתל חלב סכימטי כללי של הליך microfabrication מתאר את זרימת העבודה הניסויית מוצג באיור 1. התוצאה הסופית היא מערך של רקמות אפיתל של גיאומטריה זהה וריווח מוטבעים לחלוטין בתוך ג&#39;ל ECM. ניסוי נציג משתמשת בתאי אפיתל החלב עכבר EpH4 בתרבית ג&#39;ל מסוג שור אני קולגן בריכוז של 4 מ&quot;ג / מ&quot;ל. כדי להבטיח את האיכות הגבוהה של רקמות מהונדסות, הטכניקות המתוארות הפרוטוקול צריכים להיות במעקב צמוד. דמויות 2A ולהראות 2B נוף בהגדלה נמוכה וגבוהה של מערכים של בארות מלבניות כי כבר יצוקים לתוך טיפוס שאני קולגן ג&#39;ל לפני זריעת תאים. צורת הבארות נקבעה על ידי הצורה של התכונות על המאסטר סיליקון. חשוב להרים הדואר PDMS עובש היישר מן קולגן כדי לא לעוות את גיאומטרית החלל. איור 2C מציג בארות מלבנות טיפוס שאני קולגן ג&#39;ל כי מולא עם תאי אפיתל חלב (תאים עודפים נשטפו מעל פני השטח של קולגן). בדוגמה זו, היטב כל מלבני 200 מיקרומטר x 50 מיקרומטר מכיל כ 80-100 התאים. תוספת של גורמי גדילה גורם morphogenesis 24 שעות לאחר הזריעה, הרקמות ניתן לטפל עם גורמי גדילה כגון HGF או EGF ותרבותיים על פני כמה ימים לבנות מודל הסתעפות המורפוגנזה. בדרך כלל, סניפים מתחילים להיווצר מוקדם ככל 4 שעות לאחר גירוי גורם הגדילה. איור 3 א מציג תוצאות נציג מרקמות אפיתל החלב מלבני בתוך טיפוס שאני קולגן ג&#39;ל 24 שעות לאחר ההליך microfabrication, שלאחריו cells דבק קולגן זה לזה. אין סניפים הם נצפו לפני תוספת גורם גדילה. איור 3 ב מציגים רקמה מלבנה נציג שעברה הסתעפות 24 שעות לאחר התוספת של HGF ב 10 ng / ml. במקרה זה, סניפים להתרחש בקצות הרקמות (להבדיל באמצע), שבו התאים לחוות את הלחץ המכני הגבוה ביותר 9. רקמות מרובות של גיאומטריה ראשונית זהה באותו ג&#39;ל ניתן הדמיה מכן כדי לקבוע ממוצעי אוכלוסיית מיקום סניף ואורך סניף, המאפשרים ניתוח תפוקה גבוהה. מכתים Immunofluorescence לדמיין לוקליזציה חלבון מכתים immunofluorescence של מערכי רקמות במודל התרבות מאפשר לנו לקבוע לוקליזציה חלבון בתוך רקמה בביטחון סטטיסטי גבוה. איור 4 א מראה repre<html> תוצאות sentative מתוך רקמה מלבני חלב אפיתל הסתעפות המוכתמת עבור קינאז הדבקה מוקדים (FAK). יצירת מפות תדירות רקמות של גיאומטריה זהה יכול לשמש כדי לחזות לוקליזציה מרחבית הממוצע של חלבונים בעלי עניין בתוך הרקמות, אשר ניתן להשוות ל הלוקליזציה של חלבונים אחרים, כמו גם פעילות הסתעפות. איור 4B מראה מפה תדירה FAK מכתים ממוצע עבור 50 רקמות מראות העשרת FAK בקצים הקצרים של רקמות מלבניות, שם הסתעפות מתרחש בדרך כלל. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54283/54283fig1.jpg" /> איור 1. סכמטי המתאר את הליך microfabrication. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54283/54283fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> n-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54283/54283fig2.jpg" /> תמונות איור 2. שצולמו במהלך תהליך microfabrication. (א) נמוך (B) ותמונות שלב בניגוד והגברה גדולות של חללים מלבנים סוג אני קולגן שנוצרו באמצעות עובש PDMS אלסטומרי. (C) חללים מ (א) ו- (ב) מלאים תאי אפיתל חלב. ברי סולם, 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54283/54283fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54283/54283fig3.jpg" /> איור 3. microfabricated רקמות עוברים הסתעפות morphogenesis. (א) התמונה ניגודיות שלב של microfabrication מלבני רקמת 24 שעות לאחר נציג. (ב) תמונה בניגוד שלב של מחדשרקמת מלבני presentative כי החלה לעבור הסתעפות 24 שעות לאחר תוספת של HGF ב 10 ng / ml. חיצים לבנים מציינים ענפים שהוקמו זה עתה. ברי סולם, 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54283/54283fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54283/54283fig4.jpg" /> איור 4. מכתים Immunofluorescence של רקמות microfabricated. (א) מכתים Immunofluorescence עבור FAK בתוך רקמות אפיתל החלב לאחר תחילת הסניף. (ב) מפה תדירה מכתים FAK הממוצע ב -50 רקמות. ברי סולם, 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54283/54283fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix at JoVE.com

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

כתב יד זה מתאר טכניקה רכה המבוסס ליתוגרפיה להנדס מערכים אחידים של תלת ממדי (3D) רקמות אפיתל של גיאומטריה מוגדרת מוקפות תאי מטריקס. שיטה זו ניתנת למגוון רחב של סוגי תאים והקשרים ניסיוניים מאפשרת הקרנת תפוקה גבוהה של משכפל זהה.

הנדסה תלת מימדי רקמות אפיתל Embedded בתוך מטריקס

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

engineering-three-dimensional-epithelial-tissues-embedded-within

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K Views.  Princeton University.  כתב יד זה מתאר טכניקה רכה המבוסס ליתוגרפיה להנדס מערכים אחידים של תלת ממדי (3D) רקמות אפיתל של גיאומטריה מוגדרת מוקפות תאי מטריקס. שיטה זו ניתנת למגוון רחב של סוגי תאים והקשרים ניסיוניים מאפשרת הקרנת תפוקה גבוהה של משכפל זהה. 

Video: Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

תלת ממדית ברזולוציה אופטית photoacoustic מיקרוסקופית

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Live-תא הדמיה של תאים מעבר הבעת חלבונים fluorescently-מתויג מטריקס תלת מימדי

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

עיצוב ובנייה של תאי מטריקס המלאכותי (aECM) חלבונים מ<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; להנדסת רקמות עור

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model substrates for organ-scale tissue development. Sprague Dawley rat kidneys are cannulated by inserting a catheter into the renal artery and perfused with a series of low-concentration detergents (Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate (SDS)) over 26 hr to derive intact, whole-kidney scaffolds with intact perfusable vasculature, glomeruli, and renal tubules. Following decellularization, the renal scaffold is placed inside a custom-designed perfusion bioreactor vessel, and the catheterized renal artery is connected to a perfusion circuit consisting of: a peristaltic pump; tubing; and optional probes for pH, dissolved oxygen, and pressure. After sterilizing the scaffold with peracetic acid and ethanol, and balancing the pH (7.4), the kidney scaffold is prepared for seeding via perfusion of culture medium within a large-capacity incubator maintained at 37 &#176;C and 5% CO2. Forty million renal cortical tubular epithelial (RCTE) cells are injected through the renal artery, and rapidly perfused through the scaffold under high flow (25 ml/min) and pressure (~230 mmHg) for 15 min before reducing the flow to a physiological rate (4 ml/min). RCTE cells primarily populate the tubular ECM niche within the renal cortex, proliferate, and form tubular epithelial structures over seven days of perfusion culture. A 44 &#181;M resazurin solution in culture medium is perfused through the kidney for 1 hr during medium exchanges to provide a fluorometric, redox-based metabolic assessment of cell viability and proliferation during tubulogenesis. The kidney perfusion bioreactor permits non-invasive sampling of medium for biochemical assessment, and multiple inlet ports allow alternative retrograde seeding through the renal vein or ureter. These protocols can be used to recellularize kidney scaffolds with a variety of cell types, including vascular endothelial, tubular epithelial, and stromal fibroblasts, for rapid evaluation within this system.

This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.

Repopulation תאי אפיתל והכנה של מכרסמים תאיים מטריקס פיגומים לפיתוח רקמות כליה

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

אפיון נדידת תאים בתוך תלת מימדי במבחנה פצע סביבות

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

Culturing בתרבית של תאים בפפטיד תלת מימדי פיגומים

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure and healing. Extraction of extracellular matrix from fibrogenic cell cultures in vitro has potential for generation of ECM from human- and potentially patient-specific cell lines, minimizing the presence of xenogeneic epitopes which has hindered the clinical success of some existing ECM products. A significant challenge in in vitro production of ECM suitable for implantation is that ECM production by cell culture is typically of relatively low yield. In this work, protocols are described for the production of ECM by cells cultured within sacrificial hollow fiber membrane scaffolds. Hollow fiber membranes are cultured with fibroblast cell lines in a conventional cell medium and dissolved after cell culture to yield continuous threads of ECM. The resulting ECM fibers produced by this method can be decellularized and lyophilized, rendering it suitable for storage and implantation.

The goal of this protocol is production of whole extracellular matrix fibers targeted for wound repair which are suitable for preclinical evaluation as part of a regenerative scaffold implant. These fibers are produced by the culture of fibroblasts on hollow fiber membranes and extracted by dissolution of the membranes.

ייצור סיבים מטריצה חוץ-תאית באמצעות תרבית תאים הממברנה ההקרבה הולופייבר

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the major glial cells of the PNS, play a vital role in promoting PNS regeneration by dedifferentiating into a regenerative cell phenotype following injury. However, the dedifferentiated state of SCs is challenging to maintain through the time-period needed for regeneration and is impacted by changes in the surrounding extracellular matrix (ECM). Therefore, determining the complex interplay between SCs and differing ECM to provide cues of regenerative potential of SCs is essential. To address this, a strategy was created where different ECM proteins were adsorbed onto a tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrate which provided a platform where stiffness and protein composition can be modulated. SCs were seeded onto the tunable substrates and critical cellular functions representing the dynamics of SC phenotype were measured. To illustrate the interplay between SC protein expression and cellular morphology, differing seeding densities of SCs in addition to individual microcontact printed cellular patterns were utilized and characterized by immunofluorescence staining and western blot. Results showed that cells with a smaller spreading area and higher extent of cellular elongation promoted higher levels of SC regenerative phenotypic markers. This methodology not only begins to unravel the significant relationship between the ECM and cellular function of SCs, but also provides guidelines for the future optimization of biomaterials in peripheral nerve repair.

This methodology aims to illustrate the mechanisms by which extracellular matrix cues such as substrate stiffness, protein composition and cell morphology regulate Schwann cell (SC) phenotype.

הכנת למימדי מיקרותאי מטריצה מטריצות להערכת Schwann מפרט Cell

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of concept, a simplified and undifferentiated human skin containing a dermal (stromal) and an epidermal (epithelial) compartment has been modelled. To accomplish this, a versatile and robust, vinyl-based device divided into two chambers has been developed, overcoming some of the drawbacks present in microfluidic devices based on polydimethylsiloxane (PDMS) for biomedical applications, such as the use of expensive and specialized equipment or the absorption of small, hydrophobic molecules and proteins. Moreover, a new method based on parallel flow was developed, enabling the in situ deposition of both the dermal and epidermal compartments. The skin construct consists of a fibrin matrix containing human primary fibroblasts and a monolayer of immortalized keratinocytes seeded on top, which is subsequently maintained under dynamic culture conditions. This new microfluidic platform opens the possibility to model human skin diseases and extrapolate the method to generate other complex tissues.

Here, we present a protocol to generate a three-dimensional simplified and undifferentiated skin model using a micromachined microfluidic platform. A parallel flow approach allows the in situ deposition of a dermal compartment for the seeding of epithelial cells on top, all controlled by syringe pumps.

יצירת דגם תלת מימדי תלת מימדי של עור על שבב בפלטפורמה מיקרופלואידית מיקרו-מכונות

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...