この作品は、NIH（HL118532、HL120142、CA187692）、デビッド＆ルシール・パッカード財団、カミーユ＆ヘンリードレフュス財団、バロウズからの助成金によって部分的にサポートされていたが、ファンドへようこそ。 ASPは、シャーロットエリザベスプロクター敬語フェローシップによって部分的にサポートされていました。

ソリューションの調製<ol><li>インスリンの5 mg / mlで溶液を調製するには、のdH 2 O（溶媒100ml中に500mgのインスリン）で5 mMの塩酸（HCl）と粉末状のインスリンストックを希釈します。蒸留水100mlに濃塩酸を50μl添加することによって、溶媒100ミリリットル（ の dH 2 O）を準備します。 </li><li> PBSの1×溶液を作製するために、無菌条件下でのdH 2 Oで1Xに10×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）ストック溶液を希釈します。 </li><li>次のようにポリジメチルシロキサン（PDMS）エラストマー溶液を調製する：1（W：ワット）比10に硬化剤と一緒にPDMSプレポリマーを混合します。 </li><li>株式ダルベッコ改変イーグル培地の500ミリリットルに：次のように細胞培養培地を準備する栄養混合物F-12（DMEM / F-12）、ゲンタマイシン試薬を500μlを無菌ウシ胎児血清（FBS）の10ミリリットルを追加し、 5 mg / mlとインスリンの500μlの。 </li><li> （W 1％を追加し、1×PBS溶液中の1％ウシ血清アルブミン（BSA）を調製し：v）のBSA粉末の溶液をPBSを1倍と完全に混合します。 </li><li>追加、Iコラーゲン中和ウシ型の4 mg / mlで溶液を調製するために、50μlの10倍ハンクス平衡塩溶液（HBSS）バッファー、30μlの0.1 N水酸化ナトリウム（NaOH）、30μlの細胞培養培地、および株式コラーゲン400μlのチルド1.5ミリリットルマイクロチューブへ。上下にピペッティングすることによってゆっくりと混ぜます。気泡を導入しないよう。任意の気泡を除去するために、簡単に4℃で混合物を遠心します。 </li><li> 4（V：V）1×PBS中の16％パラホルムアルデヒド1を希釈することにより固定溶液を準備します。 </li><li>千（V：V）1×PBSの株式核標識溶液1を希釈することにより、核標識溶液を準備します。 </li><li>界面活性剤：0.3％（V V）を用いて1×PBSを混合することにより、0.3％のリン酸緩衝生理食塩水および界面活性剤（PBST）溶液を調製します。 </li><li> 0.3％PBSTで：ヤギ血清午前1時10分（V V）を希釈することにより、ブロッキング緩衝液準備します。 </li><li> PRIを希釈することにより、目的の特定のタンパク質に対する一次抗体溶液を準備しますメアリー抗体（例えば、ウサギ抗焦点接着キナーゼ（FAK））1：200（V：V）ブロッキング緩衝液です。 </li><li>ブロッキング緩衝液中：1,000（V V：）蛍光プローブ結合抗体（例えば、ヤギ抗ウサギ）1を希釈することにより、二次抗体溶液を準備します。 </li></ol> 3次元マイクロパターニング用エラストマースタンプの作製注：エラストマースタンプはPDMSで作られています。 <ol><li>ステップ1.3で説明したのと同じ比率でPDMS溶液を作製し、十分に混合します。混合プロセス中に導入された気泡を除去するために15〜30分間の真空チャンバ内に混合物を配置します。 </li><li>ボートやリソグラフィで所望の形状の特徴でパターン化されたシリコンマスターを含むペトリ皿の重量を量るプラスチックに脱気した溶液を注ぎます。最良の結果を得るために、12時間〜60℃でPDMSソリューションを治します。 注：シリコンマスターは、高度にカスタマイズ可能です。このプロトコルは、50の寸法の長方形の構造体を使用していますミクロン×200ミクロン×50ミクロンは200μmの間隔を置いて配置しました。シリコンマスターは、標準的なフォトリソグラフィ技術を用いて作製することができます。簡潔には、エポキシベースのフォトレジストは、シリコンウエハの上にスピンコーティングされます。所望のスタンプ機能を詳述するマスクは、UV光に露光されるフォトレジストでコーティングされたウェハの上に配置されます。マスクによって遮断されない所望の特徴は、光に露出され、フォトレジストコーティングの残りは可溶性であり、洗い流すことができるが、これらの位置でのフォトレジストは、架橋になります。 </li><li> PDMSは、シリコンマスター上で必要な機能の周りに硬化した後、プラスチック容器からPDMSとマスターを削除します。慎重に、シリコンウェハからPDMSを分離し、きれいなカミソリの刃を使用してインプリントされた特徴の周りから余分なPDMSを削除します。 </li><li>今、かみそりの刃で個々の長方形のスタンプ（〜8ミリメートル×5ミリメートル）にインプリント機能を備えたパターン化PDMSを切りました。 CLEでこれらの機能側を上向きにして保管してください100 mmの直径ペトリ皿。 </li><li>また、長方形のスタンプのための支援を行うためにステップ1.3で説明したPDMSソリューションを使用しています。 </li><li>スピンコーターを用いて、100 mmの直径のペトリ皿に均一にPDMS液〜2-3グラム広げ、ステップ2.1のように60℃〜12時間PDMSを硬化します。そして、カミソリの刃を使用して、長方形にPDMSの薄層（〜5ミリメ​​ートル×2 mm）をカット。 注：2つの支持体は、ステップ2.3で行われた各PD​​MSスタンプのために必要とされます。支持体は、PDMSスタンプが含まれて100 mmの直径のペトリ皿に格納することができます。 </li><li> PDMSスタンプおよび支持体は、細胞培養に使用する前に、70％エタノールに浸漬することによって殺菌し、安全キャビネット（細胞培養フード）中で吸引器を使用して乾燥させます。 </li></ol> 3D上皮組織の調製<ol><li>バイオセーフティキャビネットでは、各スタンプの先頭にPBS中の1％BSAの約50μlとドロップを追加します。ミニ4℃で滴覆われたスタンプを配置しますBSAは、スタンプの表面に吸着していることを確実にするために4時間のお母さん。 </li><li> PDMSスタンプから吸引しBSA溶液。 </li><li>各洗浄の後に吸引し、細胞培養培地（スタンプにつき1回の洗浄あたり50μlのは十分なものでなければならない）で2回スタンプの表面を洗浄します。 </li><li>湾曲したステンレス製のピンセットを用いて滅菌PDMSスタンプとサポートを扱います。安全キャビネットでは、それぞれに1つの35 mmの直径組織培養皿にスタンプをPDMSレイアウト。各皿には、PDMSスタンプの長さよりもわずかに小さい距離で分離された2つのPDMSのサポー​​トを下に置きます。 </li><li>ピンセットを使用して、70％エタノールを用いてPDMSスタンプと同数の円形のガラスカバースリップ（直径15mm、＃1）を滅菌します。ピンセットでそれらを保持しながら、カバースリップから過剰な液体を吸引します。独立した100 mmの直径のペトリ皿中で洗浄し、カバースリップを保管してください。 </li><li>均一にコートにコラーゲン混合物の〜50μLを分注し、それぞれの表面には、スタンプをPDMS。 </li><li>拾う各コラーゲンでコーティングされたPDMSは、ピンセットでスタンプ、優しくを反転します。 PDMSの上に反転スタンプを下げることの35mm直径組織培養に配置サポートコラーゲンスタンプおよび組織培養皿の底部との間にあるように、皿。 37℃で30分間皿をインキュベートします。 </li><li>円形のカバースリップの各々の上に残りのコラーゲン混合物の約50μLを分注（以降、これらは完全にコラーゲンでそれらを封入するように操作された組織の上に配置される）、30分間、37℃でそれらをインキュベートします。 </li><li> 〜40％の密集度で上皮細胞（例：EpH4マウス乳腺上皮細胞）を含む100 mmの直径組織培養皿を取得します。細胞培養培地を吸引し、PBS 1×10mlで1回洗浄。細胞にトリプシンの2ミリリットルを加え、5〜10分間37℃でインキュベートします。 </li><li>ディッシュから残りの接着細胞を剥離、トリプシン処理細胞を含有する組織培養皿に新鮮な培地を8 mlを加え。ピペッティングにより穏やかに混合し、5分間、100×gで15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に細胞混合物を移動させます。 </li><li>コニカルチューブから上清を吸引し、細胞培養培地中で細胞ペレットを再懸濁します。血球計数器を用いて、懸濁液の濃度を決定するために、細胞を計数。約10 6〜10 7細胞/ mlの最終濃度を得るために、懸濁液の体積を調整します。 </li><li>インキュベーターからゲル化コラーゲンサンプルを削除してください。ピンセットを使用して、静かに成形されたコラーゲンからそれらを切り離し、それらを破棄するようにまっすぐ上向きにPDMSスタンプを持ち上げます。 </li><li>所望の形状の成形キャビティを含む各コラーゲンゲルの表面に濃縮された細胞懸濁液〜30μLを分注します。優しく空洞内沈降細胞を促進するために左右に食器側を振とうしながら10X / 0.25 NAの対物レンズで明視野顕微鏡下で細胞を観察します。空洞は〜5分以内に入力されているはずです。 </li><li> rに、空洞の周りから余分な細胞をemoveその側の各組織培養皿を傾け、静かにコラーゲンゲルの表面上に〜400μlの細胞培養培地を分注します。各洗浄の間に、顕微鏡下でのコラーゲンゲルをチェックし、液体を吸引し、洗浄を1-2回繰り返します。 </li><li>過剰な細胞は、15分間37℃で細胞培養インキュベーター中に組織培養皿を置き、コラーゲン型のセルが充填されたキャビティの周囲から除去された後。その後、ピンセットを使用して、静かにコラーゲンでコーティングされたクラスのカバースリップを反転し、カバースリップからのコラーゲンが細胞で満たされた空洞上にキャップを形成するように細胞が充填されたコラーゲンの型の上にそれらを置きます。 15分間37℃でサンプルをインキュベートします。 </li><li>コラーゲンキャップは、細胞が充填されたコラーゲンの金型に付着した後、ゲルの上にカバーガラスをかけてゆっくり〜2〜2.5ミリリットルの細胞培養培地を分注します。 1~3日間の培養を37℃でサンプルを。 注意：24時間の最初の播種後、上皮組織が分岐誘導するために、上皮成長因子（EGF）などの成長因子又は肝細胞増殖因子（HGF）で処理することができます。 </li></ol> 4.免疫蛍光および画像解析<ol><li>組織培養皿から細胞培養培地を吸引し、細胞を含有するゲルをカバーするために十分な固定溶液を加えます。 200rpmでシェーカー上で15分間室温で皿をインキュベートします。 </li><li>固定液を吸引除去し、1×PBSで組織培養皿を記入し、200rpmでシェーカー上で15分間室温でインキュベートします。合計3回の洗浄のために二回繰り返します。 </li><li> 核を標識するには、次の組織培養皿からPBSを吸引除去し、ヘキスト溶液で交換してください。 15-20分間、室温でインキュベートします。 FAKまたは抗体と検出可能である別のマーカーを染色するには、4.5に進みます。 </li><li>核標識溶液を吸引し、細胞含有Gを洗いますステップ4.2のように、1×PBSで3回ELS。染色されたサンプルは、さらなる使用まで4℃で、1×PBS中に保存することができます。 </li><li> 、組織培養皿から吸引し、PBS 0.3％PBST300μlのを追加し、室温で15分間サンプルをインキュベート：目的のタンパク質を染色します。 </li><li> 、PBSを吸引ブロッキング緩衝液でゲルをカバーし、約4時間室温でシェーカー（200rpm）しでインキュベートします。 </li><li>吸引ブロッキング緩衝液は、一次抗体溶液でゲルを覆い、そして4℃で一晩200rpmでシェーカー上でインキュベートします。 </li><li>一次抗体溶液を吸引0.3％PBST溶液を加え、室温で30分間、200rpmでシェーカー上でインキュベートします。 PBSTを吸引し、3-4時間、30分ごとに繰り返します。 </li><li>繰り返しは、この時間は、二次抗体溶液とインキュベート、4.7と4.8を繰り返します。二次抗体の退色を防止するためにアルミホイルで組織培養皿をラップします。 FINA後Lの洗浄、染色されたサンプルは、さらなる使用まで4℃で、1×PBS中に保存することができます。 </li><li>サンプルを可視化するために、上皮組織のミッドプレーンに焦点を当て10X / 0.30 NAの対物レンズを使用しています。 </li><li>細胞核、UV照明の下で10X / 0.30 NAの対物レンズを用いて核マーカーで標識された画像固定したサンプルを可視化するために。 </li><li>倒立蛍光顕微鏡で10×/ 0.30 NAの対物レンズを用いて目的のタンパク質について染色したサンプル画像を可視化します。 </li><li>同一の初期形状、最初のインポート標準的な画像分析ソフトウェアを用いて各画像の複数の組織（典型的には50またはそれ以上）のタンパク質染色の周波数マップを作成する（材料を参照）、8ビットグレースケールに変換します。 </li><li>これらの画像の閾値と、グレースケールのカットオフポイントを定義することによって、バイナリ（ すなわち、中間調/黒と白）に変換します。閾値以下のグレースケール値は黒になり、閾値以上のものが白になります。そして、コンバイン単一の画像スタックに個々の二値画像の各。 </li><li>次に、積層された画像を登録する（ すなわち 、整列したり、それらを一致させる）解析ソフトウェアで。多くの画像解析ソフトウェアパッケージが自由に利用できる登録プラグインが付属しています。 <ol><li>次の画像の位置合わせのためのテンプレートとして、スタック内の各画像を使用して、スタック全体の画像は、伝播によって整列されるように。最後に、オーバーレイ（プロジェクト）平均強度に基づいて整列された画像スタック内の画像は、ピクセル周波数マップで単一の画像を形成します。この画像は、選択10,11の画像編集ソフトウェアを使用して色分けすることができます。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Affolter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tube+or+not+tube:+remodeling+epithelial+tissues+by+branching+morphogenesis.">Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis.</a> Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).</li><li>Zhu, W., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+signaling+in+the+regulation+of+branching+morphogenesis.">PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis.</a> Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).</li><li>Sternlicht, M. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+geometry+determines+sites+of+mammary+branching+morphogenesis+in+organotypic+cultures.">Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures.</a> Science. 314 (5797), 298-300 (2006).</li><li>Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+patterns+of+mechanical+stress+are+required+for+branching+morphogenesis.">Endogenous patterns of mechanical stress are required for branching morphogenesis.</a> Integr Biol (Camb). 2 (9), 424-434 (2010).</li><li>Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+mechanical+strains+and+stresses+around+quiescent+engineered+three-dimensional+epithelial+tissues.">Mapping of mechanical strains and stresses around quiescent engineered three-dimensional epithelial tissues.</a> Biophys J. 103 (1), 152-162 (2012).</li><li>Gjorevski, N., Piotrowski, A. S., Varner, V. D., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+tensile+forces+drive+collective+cell+migration+through+three-dimensional+extracellular+matrices.">Dynamic tensile forces drive collective cell migration through three-dimensional extracellular matrices.</a> Sci Rep. 5, 11458 (2015).</li><li>Zhu, W., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+regulates+branch+initiation+and+extension+of+cultured+mammary+epithelia+via+Akt+and+Rac1+respectively.">PI3K regulates branch initiation and extension of cultured mammary epithelia via Akt and Rac1 respectively.</a> Dev Biol. 379 (2), 235-245 (2013).</li><li>Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differentiation+and+alveolar+morphogenesis+of+primary+mammary+cultures+on+reconstituted+basement+membrane.">Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane.</a> Development. 105 (2), 223-235 (1989).</li><li>Hirai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epimorphin+functions+as+a+key+morphoregulator+for+mammary+epithelial+cells.">Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells.</a> J Cell Biol. 140 (1), 159-169 (1998).</li><li>Pavlovich, A. L., Manivannan, S., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+stroma+induces+branching+morphogenesis+of+engineered+epithelial+tubules.">Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules.</a> Tissue Eng Part A. 16 (12), 3719-3726 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

The protocol described above outlines a method to produce identical epithelial tissues of pre-defined shape, enabling spatial control of the mechanical stress experienced by cells in the tissue. An elastomeric mold is used to create cavities in type I collagen that are then filled with epithelial cells and covered with an additional collagen layer such that cells are completely encapsulated in a 3D collagen matrix environment. Further culture of these tissues and treatment with growth factors to induce branching from the initial architecture make this system amenable for the study of branching morphogenesis of epithelial cells. There are several critical steps in the protocol. The first is lifting the PDMS molds straight upwards from the gelled collagen prior to cell seeding. Any horizontal movement during this step will distort the cavities, and they will no longer retain the desired geometry. Then, after the cavities have been seeded with cells, it is important to carefully wash off any excess cells that remain on the surface, as these may interfere with the behavior of the patterned tissues, particularly if they are very close to the tissues. Washing too rigorously, however, may result in cells being washed out of the cavities. Lastly, in the final micropatterning step when the cell-containing collagen gels are being immersed in culture medium, it is important to add the medium slowly and directly on top of the coverslip. Adding medium to the side of the dish away from the coverslip may result in detachment of the coverslip and the collagen lid. Each of these steps needs to be performed with care to achieve the best results.
Over the past few decades, several culture models have emerged for the study of epithelial morphogenesis, many of which involve the ex vivo culture of intact organs or explants of organs. Major advantages of culturing tissue taken directly from an animal are that tissue architecture remains intact and that cell-cell interactions are maintained. However, these models are not readily amenable to studies investigating the specific effects of a particular cell type or physical microenvironment. Additionally, organs and organ explants can be fragile and difficult to culture ex vivo. Others used primary mammary epithelial cells12, in which gene expression can be more readily manipulated, though this method does not conserve in vivo tissue architecture. Moreover, like intact organs, these cells can also be difficult to culture for long periods of time5. There is a need, therefore, for more robust culture models of epithelial morphogenesis that can be more precisely controlled and readily perturbed to gather reproducible data. 
A widely used 3D cell culture technique is the formation of epithelial cell clusters embedded in collagen or other ECM proteins11,13. Disadvantages of this technique, however, include the inability to precisely control or predict the location of clusters within the gel, cluster size and shape, and branching sites. In addition, it is difficult to manipulate or measure the mechanical cues experienced by cells in different regions of the tissue clusters. Engineered tissues enable better control of these parameters.
The engineered tissue protocol described here is an easy to use, versatile, and reproducible 3D cell culture method that eliminates the heterogeneity commonly found in ex vivo culture systems and 3D clusters. Such engineered cell culture models provide a platform for more precise control of physical and biochemical signals, and results can be easily combined with computational models to predict the effects of perturbations or measure cellular forces using techniques such as traction force microscopy (TFM)9,10. A caveat of the model system, however, is that it does not completely replicate the cellular, chemical, and physical microenvironment within the mammary gland in vivo. Nonetheless, essentially all parts of the system are modifiable: including the cells used (in which gene expression can also be altered by transfection), tissue geometry, ECM composition, and other biochemical factors (ex. growth factors). Primary mammary epithelial cells can also be cultured in this system; they form a lumen and undergo branching morphogenesis from the same locations as immortalized cell lines7. Moreover, the model can be modified to incorporate other cell types to more appropriately represent the native mammary gland microenvironment14, or to investigate the underlying mechanisms that give rise to any branched organ.

分枝形態形成として知られている分枝状の上皮組織の発達は、細胞由来の、物理的、及び環境因子によって調節されます。乳腺では、分枝形態形成は、細胞の遊走は、ツリー状のアーキテクチャを作成し、集団導かれ、それを通して反復的なプロセスです。最初のステップは、分岐開始および伸長1,2に続いて、乳管からの一次芽形成です。周囲の間質への枝の浸潤は思春期でのステロイドホルモンの全身放出によって誘発されます。新しいプライマリ芽は、既存の枝の末端から開始し、このプロセスは、上皮ツリー3を作成し続けています。多くの重要な生化学的シグナルが同定されているが、この複雑な発達過程を導く細胞生物学的メカニズムの包括的な理解が現在欠如しています。また、特定の手がかりの影響に関するメカニズムの研究はexperiから解体することは困難ですin vivoでのメントは、などの正確な時空間摂動および測定がしばしば可能ではありません。 例えば全器官培養、プライマリオルガノイド、および細胞培養モデルとして3次元（3D）培養技術は、体系的に組織形態形成4-6のメカニズムを調査するための有用なツールです。これらには、移動、増殖、および分化を含む細胞挙動の様々な、このような機械的な力および生化学的信号として、個別に特定の因子の影響を決定するために特に有用である。6操作された細胞培養モデル、特に、容易に摂動を可能にします個々の細胞とその微小環境の。 そのような培養モデルは、一貫して再現性Aで誘導された場合、まとめ移行枝を形成する制御3D構造を持つモデル乳腺上皮組織を操作するための微細加工ベースのアプローチを使用していますppropriate成長因子。モデルの主な利点は、正確に操作し、このような高い統計的信頼と機械的ストレスのパターン、などの物理的および生化学的因子の効果を測定する能力です。この技術は、一緒に計算モデルと、既に乳房上皮組織の正常な発達および他方の分岐上皮7-11の指導における物理的および生化学的シグナルの相対的な寄与を決定するために使用されています。ここに提示することは、容易に細胞と細胞外マトリックス（ECM）ゲルの他のタイプに拡張することができ、これらのモデル組織を構築するための詳細なプロトコルであり、治療の試験のための潜在的なツールとして機能します。

<table><tbody><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>PDMS curing agent</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Lithographically patterned silicon master</td><td>self-made</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Plastic weigh boat</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-115</td><td></td></tr><tr><td>100-mm-diameter Petri dishes</td><td>BioExpress</td><td>D-2550-2</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol 200 Proof</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>American Safety Razor</td><td>620179</td><td></td></tr><tr><td>1:1 Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium : Ham&amp;rsquo;s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1)</td><td>Hyclone</td><td>SH30023FS</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>10x Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bovine type I collagen (non-pepsinized)</td><td>Koken</td><td>IAC-50</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from bovine serum (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Curved stainless steel tweezers</td><td>Dumont</td><td>7</td><td></td></tr><tr><td>35-mm-diameter tissue culture dishes</td><td>BioExpress</td><td>T-2881-6</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes</td><td>BioExpress</td><td>C-3394-2</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter</td><td>Bellco Glass Inc.</td><td>Special order</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 1x Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>VWR</td><td>100503-916</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Perkin Elmer</td><td>N9300260</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>HGF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H 9661</td><td>Resuspended in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O at 50 mg/ml</td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse FAK antibody</td><td>Life Technologies</td><td>AMO0672</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td>N/A</td><td>Used for color-coding pixel frequency maps.</td></tr><tr><td>FIJI (ImageJ)</td><td>NIH</td><td>N/A</td><td>Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images.</td></tr></tbody></table>

engineering three-dimensional epithelial tissues embedded within extracellular matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

乳腺上皮組織の微細化の一般的な概略図 実験作業の流れを概説する微細加工手順の一般的な概略図を図1に示されている。最終的には完全にECMゲル内に埋め込 ​​まれている同一の幾何学的形状及び間隔の上皮組織のアレイです。代表的な実験は、私は4ミリグラム/ mlの濃度でコラーゲンウシ型のゲルで培養EpH4マウス乳腺上皮細胞を使用しています。操作された組織の最高の品質を確保するために、プロトコルで概説技術は密接に従うべきである。型に成形された長方形のウェルのアレイの図2Aおよび2Bは 、低および高倍率ビューは、私は細胞播種の前にコラーゲンゲル。ウェルの形状は、シリコン原盤上のフィーチャの形状によって決定されます。番目を持ち上げることが重要ですまっすぐコラーゲンから電子PDMSモールド空洞形状を歪曲しないように。 図2Cは、型は長方形の井戸を示し、私は（過剰細胞は、コラーゲンの表面を洗浄除去されている）乳腺上皮細胞で満たされているコラーゲンゲル。この例では、各200ミクロン×50ミクロンの長方形だけでなく、約80-100の細胞が含まれています。 成長因子の添加は、形態形成を誘導します 播種24時間後に、組織は、分枝形態形成モデル化するHGF又はEGFのような、数日間培養し、増殖因子で処理してもよいです。一般的に、枝は早くも4時間増殖因子刺激の後に形成し始める。 図3Aは、どのセル画後、24時間微細加工手順後のI型コラーゲンゲル内の長方形の乳房上皮組織からの代表的な結果を示していますLSは、コラーゲンおよび互いに接着しています。いいえの枝が成長因子の添加の前に観察されない。 図3Bは、10 ng / mlでにおけるHGFの添加24時間後に分岐受けている代表的な長方形の組織を示しています。この場合、分岐は、細胞が最も高い機械的応力9を経験組織（中央とは対照的に）の両端に発生します。同じゲルで同じ初期ジオメトリの複数の組織は、高スループット分析を可能とする、分岐先と分岐長の集団平均値を決定するために画像化することができます。 免疫蛍光染色は、タンパク質の局在化を可視化します 培養モデルにおける組織アレイの免疫蛍光染色は、高い統計的信頼と組織内のタンパク質の局在を決定することができます。 図4Aは repreを示しています焦点接着キナーゼ（FAK）のために染色分岐長方形の乳房上皮組織からsentative結果。同じジオメトリの組織の周波数マップを作成する他のタンパク質の局在化ならびに分岐活性と比較することができ、組織内の関心のあるタンパク質の平均の空間的局在を可視化するために使用することができます。 図4Bは、通常発生し、分岐長方形の組織の短い端部にFAKの濃縮を示す50の組織の平均FAK染色の頻度マップを示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54283/54283fig1.jpg" /> 図1. 回路図の微細加工手順を概説。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54283/54283fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 微細加工プロセス中に採取図2画像はタイプ（A）低及び（B）と、矩形のキャビティの高倍率位相コントラスト画像Iは、エラストマーPDMS金型を使用して作成されたコラーゲン。 （A）及び（B）から（C）キャビティは、乳腺上皮細胞で満たされています。スケールバー、100μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54283/54283fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54283/54283fig3.jpg" /> 図3. 微細加工組織が ​​分枝形態形成受ける。代表的な長方形の組織24時間の（A）位相コントラスト画像微細加工後。 （B）再の位相差画像10ng / mlのHGFの添加後24時間分岐受けることを開始した表象的な長方形の組織。白矢印は、新たに形成された枝を示しています。スケールバー、100μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54283/54283fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54283/54283fig4.jpg" /> 微細加工された組織の 図4. 免疫蛍光染色。分岐開始後の乳腺上皮組織におけるFAKのための（A）免疫蛍光染色。 （B）50組織における平均FAK染色の周波数マップ。スケールバー、100μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54283/54283fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

この原稿は、細胞外マトリックスに囲まれた定義された幾何学的形状の3次元（3D）上皮組織の均一な配​​列を操作するソフトリソグラフィーベースの技術が記載されています。この方法は、細胞の種類および実験の文脈の多種多様に適していると同一の​​複製のハイスループットスクリーニングを可能にします。

細胞外マトリックス内に埋め込まれたエンジニアリング三次元上皮組織

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K ビュー.  Princeton University. この原稿は、細胞外マトリックスに囲まれた定義された幾何学的形状の3次元（3D）上皮組織の均一な配​​列を操作するソフトリソグラフィーベースの技術が記載されています。この方法は、細胞の種類および実験の文脈の多種多様に適していると同一の​​複製のハイスループットスクリーニングを可能にします。 

ビデオ: Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, thus greatly influencing normal tissue homeostasis and disease outcome. In breast cancer, tumor-associated macrophages (TAMs) play a critical role in disease progression, metastasis, and recurrence; therefore, understanding the mechanisms of monocyte chemoattraction to the tumor microenvironment and their interactions with tumor cells is important to control the disease. Here, we provide a detailed description of a three-dimensional (3D) co-culture system of human breast cancer (BrC) cells and human monocytes. BrC cells produced high basal levels of regulated on-activation, normal T-cell expressed and secreted (RANTES), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (G-CSF), while in co-culture with monocytes, pro-inflammatory cytokines Interleukin (IL)-1 beta (IL-1&#946;) and IL-8 were enriched together with matrix metalloproteinases (MMP)-1, MMP-2, and MMP-10. This tumor stroma microenvironment promoted resistance to anoikis in MCF-10A 3D acini-like structures, chemoattraction of monocytes, and invasion of aggressive BrC cells. The protocols presented here provide an affordable alternative to study intra-tumor communication and are an example of the great potential that in vitro 3D cell systems provide to interrogate specific features of tumor biology related to tumor aggression.

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

Here, we describe a three-dimensional culture method to analyze the morphology of primary breast cancer cells, as well as to study their direct/indirect interactions with monocytes and the outcomes such as collagen degradation, immune cell recruitment, cell invasion, and promotion of cancer-related inflammation.

単球と細胞外マトリックスの主要な乳癌細胞間コミュニケーションを分析抽出 (ECME)-ベースの三次元システム

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

がん研究

Fibroblast-Derived 3D Matrix System Applicable to Endothelial Tube Formation Assay

The extracellular matrix (ECM) is a three-dimensional scaffold that acts as the main support for cells in tissues. Besides its structural function, the ECM also participates in cell migration, proliferation, and differentiation. Fibroblasts are the main type of cells modifying ECM fiber arrangement and production. In cancer, CAFs (cancer associated fibroblasts) are in permanent activation status, participating in ECM remodeling, facilitating tumor cell migration, and stimulating tumor-associated angiogenesis, among other pro-tumorigenic roles. The objective of this method is to create a three-dimensional matrix with a fiber composition that is similar to in vivo matrices, using immortalized fibroblasts or human primary CAFs. Fibroblasts are cultured in pre-treated cell culture plates and grown under ascorbic acid stimulation. Then, fibroblasts are removed and matrices are blocked for further cell seeding. In this ECM model, fibroblasts can be activated or modified to generate different kinds of matrix, whose effects can be studied in cell culture. 3D matrices are also shaped by cell signals, like degradation or cross-linking enzymes that might modify fiber distribution. In this context, angiogenesis can be studied, along with other cell types such as epithelial tumor cells.

The aim of this method is to obtain fibroblast-derived 3D matrices as a natural scaffold for subsequent cellular assays. Fibroblasts are seeded in a pre-treated culture plate and stimulated with ascorbic acid for matrix generation. Matrices are decellularized and blocked to culture relevant cells (e.g., endothelial cells).

内皮管形成アッセイに適用可能な線維芽細胞由来3Dマトリックスシステム

The extracellular matrix (ECM) is a three-dimensional scaffold that acts as the main support for cells in tissues. Besides its structural function, the ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

組織工学：層状細胞シートの送達のための多細胞3D足場の構築

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

生物工学

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

癌細胞浸潤への応用による腫瘍間質微小環境の組織工学

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

微小重力下で増殖させたヒト腸粘膜の多細胞三次元器官型モデルの開発

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

3D細胞培養のための肺細胞外マトリックスから調整可能なヒドロゲル

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

化学誘引物質勾配に対するマルチセル応答の3D 解析

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

3D細胞-細胞-膵組織コンストラクトを印刷するための膵組織由来細胞外マトリックスバイオインク

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional (3D) structures. One of the main functions of epithelia is the formation of barriers that protect the underlining tissues against physical and chemical insults and infectious agents. In addition, epithelia mediate the transport of nutrients, hormones, and other signaling molecules, often creating biochemical gradients that guide cell positioning and compartmentalization within the organ. Owing to their central role in determining organ-structure and function, epithelia are important therapeutic targets for many human diseases that are not always captured by animal models. Besides the obvious species-to-species differences, conducting research studies on barrier function and transport properties of epithelia in animals is further compounded by the difficulty of accessing these tissues in a living system. While two-dimensional (2D) human cell cultures are useful for answering basic scientific questions, they often yield poor in vivo predictions. To overcome these limitations, in the last decade, a plethora of micro-engineered biomimetic platforms, known as organs-on-a-chip, have emerged as a promising alternative to traditional in vitro and animal testing. Here, we describe an Open-Top Organ-Chip (or Open-Top Chip), a platform designed for modeling organ-specific epithelial tissues, including skin, lungs, and the intestines. This chip offers new opportunities for reconstituting the multicellular architecture and function of epithelial tissues, including the capability to recreate a 3D stromal component by incorporating tissue-specific fibroblasts and endothelial cells within a mechanically active system. This Open-Top Chip provides an unprecedented tool for studying epithelial/mesenchymal and vascular interactions at multiple scales of resolution, from single cells to multi-layer tissue constructs, thus allowing molecular dissection of the intercellular crosstalk of epithelialized organs in health and disease.

The present protocol describes the capabilities and the essential culture modalities of the Open-Top Organ-Chip for the successful establishment and maturation of full-thickness organ-on-chip cultures of primary tissues (skin, alveolus, airway, and intestine), providing the opportunity to investigate different functional aspects of the human epithelial/mesenchymal and vascular niche interface in vitro.

オープントップ臓器チップ上でのヒト上皮組織の細胞構造と機能の再構成

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional ...

<meta charset="utf8"></head><body>上皮細胞および線維芽細胞のための高度な2層3D共培養システム

Establishing a Three-Dimensional Coculture Module of Epithelial Cells Using Nanofibrous Membranes

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods can enhance cell culture efficiency. This study introduces an advanced two-layered culture system intended to cultivate epithelial cells as tissue-like layers with the culture of fibroblasts within a 3D environment. Polyvinyl alcohol (PVA) and poly(&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibrous membranes (NMs) were fabricated via electrospinning and utilized as a physiologically relevant extracellular matrix for the culture of epithelial cells and fibroblasts, respectively. In the upper insert wells, lung epithelial cells were cultivated on the PVA NM, and in the lower chambers, fibroblasts were cultured on the PCL NM. This configuration eliminates direct cell-cell contact and facilitates the examination of paracrine signaling mediated by soluble factors. Confocal microscopy was employed to analyze the distribution, growth pattern, and expression of intracellular proteins, including zona occludens in epithelial cells. Z-stacking techniques enabled detailed 3D reconstructions, providing precise insights into the integrity of tight junctions and spatial organization within the epithelial layer. Scanning electron microscopy (SEM) assessed the morphological characteristics of cell types on the nanofibrous membranes. SEM imaging revealed intricate cell surface structures and interactions with the nanofibers, offering a comprehensive perspective on cellular architecture and cell interaction with nanofibrous structure. The Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay is a simple method for measuring epithelial cell and fibroblast growth rates over time. It provides the proliferative behaviors and potential synergistic effects of coculturing these cells. These findings highlight the effectiveness of a simple insert co-culture system for simultaneous culture of fibroblasts and epithelial cells, which is crucial in various physiological and pharmacological contexts, including epithelial tissue regeneration, tumor microenvironment with endothelial, immune, and other stroma cells, toxicity assay, and drug activity test.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:PVA-PCLナノファイバーメンブレンによる3D共培養システムの進歩

Here, we demonstrate how epithelial cells cultured with fibroblasts in the nanofibrous membrane-based two-layer system can stably adhere to and grow on the membrane.

ナノファイバー膜を用いた上皮細胞の三次元共培養モジュールの確立

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods ...