Dr. Rawi Ramautar would like to acknowledge the financial support of the Veni grant scheme of the Netherlands Organization of Scientific Research (NWO Veni 722.013.008).

הערה: הפרוטוקול המתואר כאן לשימוש sheathless CE-MS ללימודי פרופיל מטבולי הוא לשימוש במעבדה בלבד. הנהלים המפורטים להלן מבוססים על 4,5 יצירה שפורסם לאחרונה. ניתן למצוא את פרטי ניסוי לעומק במסמכים אלה. לפני השימוש בפרוטוקול זה, להתייעץ כל גיליונות נתוני בטיחות חומרים רלוונטיים (MSDS). השתמש כל נהלי הבטיחות במעבדה המתאימים, לרבות משקפי מגן, חלוק מעבדה וכפפות, כאשר עורכי הניסויים שתוארו בפרוטוקול זה. 1. הכנת פתרונות ריאגנטים דוגמאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת האלקטרוליט רקע (BGE) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון BGE חדש (10% (v / v) חומצה אצטית, pH 2.2) כל יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 9.0 מ&quot;ל של מים לתוך בקבוקון זכוכית 10 מ&quot;ל ולהוסיף 1.0 מ&quot;ל של חומצה אצטית במים במנדף. מערבבים את הפתרון ביסודיות בעזרת מערבולת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת המטבוליט standarתערובת ד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 50 μl של תערובת רגילה 50 מיקרומטר קטיון המכיל 60 מטבוליטים קטיוני לתוך 50 μl של מים ומערבבים הפתרון ביסודיות. חנות ב -80 מעלות צלזיוס כאשר אינו בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 50 μl של תערובת תקן אניון 50 מיקרומטר המכיל 30 מטבוליטים anionic לתוך 50 μl של מים ומערבבים הפתרון ביסודיות. אחסן את הפתרון הזה, ב aliquots כדי למנוע מחזורי הקפאה / פשרה של אותה התערובת רגילה, ב -80 מעלות צלזיוס כאשר אינו בשימוש. הערה: המטבוליט תערובות תקן יציבות במשך 3 חודשים, כאשר הם מאוחסנים כראוי ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תמציות מקו תא גליובלסטומה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטף את תאי U-87 MG גליובלסטומה אדם החסיד שלוש פעמים עם 1 מיליליטר פתרון נתרן כלורי 0.9% קרים כקרח 21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר פתרון מתנול קר כקרח / מים (8/2, V / V) על התאים החסידים ולהתרפס באמצעות גומי הטה תא מגרד 21. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הפתרון מתנול / מים בצינור ואת ultrasonicate למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת כלורופורם לשבר מתנול / מים (יחס הסופי 8/8/2, נ / V / V) ו צנטריפוגות מדגם למשך 10 דקות ב 16,100 XG ו -4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את שכבת מתנול / מים להתאדות חלק זה באמצעות concentrator ואקום. מחדש את החומר היבש ב 50 מי μl לניתוח על ידי sheathless CE-MS. כאשר אינו בשימוש לאחסן את המדגם ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 2. הגדרת מערכת Sheathless CE-MS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנה של המחסנית התמזג-סיליקה החשוף עם פולט הקצה הנקבובי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח מחסנית התמזג-סיליקה חשוף חדש עם פולט קצה נקבובי (30 מיקרומטר אורך כולל פנימיים בקוטר x 90 סנטימטרים) במכשיר CE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לשטוף קדימה ב 50 psi במשך 15 דקות עם תוכנת שליטה על מכשיר לספירה באמצעות מתנול 100% ו חזותית לבדוק אם נוזל זורם החוצה מן capilשקע Lary במהלך שלב שטיפה זו. כמו כן לבצע שטיפה בכיוון ההפוך ב 50 psi במשך 5 דקות באמצעות פתרון BGE חזותי לבחון האם הנוזל זורם החוצה מן נימי מוליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.1.2 בלחץ של 100 psi במקרה שאין היווצרות טיפת נוזל נצפתה במוצא הנימים. התקן מחסנית התמזג-סיליקה חשוף חדשה אם אין היווצרות טיפת נוזל נצפתה במהלך שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את נימי ההפרדה עם מים ב 50 psi במשך 10 דקות, ואחריו 0.1 M NaOH ב 50 psi במשך 10 דקות, ולאחר מכן על ידי מים ב 50 psi במשך 10 דקות ולבסוף עם BGE ב 50 psi במשך 10 דקות. הערה: שלבים 2.1.1 עד 2.1.4 נדרשים רק עבור ההתקנה של מחסנית נימים חדשה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צימוד של פולט קצה הנימים הנקבובי כדי ESI-MS הערה: לפני צימוד נימי CE ל- MS, להבטיח כי המכשיר MS כבר מכויל ומחובר למערכת CE. הגדר את מתח ESI כדי0. התאימו את מכשיר MS עם מקור nanospray. גז 1 גז 2 ותנור חימום בטמפרטורה ממשק לא יושמו כפי ESI ברמות ספיקה נמוכה מאוד מתרחשת רק על ידי יישום מתח ספריי יון להגדיר ב 1500 V. סט הווילון 5 psi. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקצה המרסס של המחסנית-סיליקה התמזגה מצינור המים התקנת אותו מתאם מקור nanospray עבור צימוד למכשיר MS. ודא כי הגובה של בקבוקוני BGE במכשיר CE להתאים את גובה הטיפ המרסס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק זרימת הנוזל דרך נימי מוליך על ידי שטיפה עם BGE ב 50 psi במשך 5 דקות. במהלך שטיפה זה צעד במערך ירידה בבסיס המחט מרסס ESI יש לשים לב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את נימי ההפרדה עם BGE ב 50 psi במשך 10 דקות לכיוון קדימה. היווצרות Drop יש לשים לב בקצה של פולט הקצה הנקבובי (טיפ מרסס) במהלך שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את פולט הקצה הנקבובי לכניסה של כניסת MS ממרחק של גIRCA 2 עד 3 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת מתח של 30 קילו וולט באמצעות זמן הרמפה של 1 דק &#39;ולהתחיל רכישת נתונים MS בטווח m / z מ -65 ל -1,000 מ&#39; / z ללימודי פרופיל מטבולי באמצעות הראשון מתח ESI של 0. הערה: הספקטרום מונית צריך להיות ריק אות כמו שלא צריך להיות שום electrospray. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מתח ESI 1,000 V תוך להמשיך מדידת נתונים. להגביר את מתח ESI בקפיצות של 200 V עד אות רקע מתמדת הוא ציין עבור 15 דקות לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטב את עמדת פולט קצה הנקבובית ביחס במרכז כניסת MS על ידי הזזת אותו x, y, או z-הכיוון כדי לראות אילו עמדה ספק המקסימאלי שניתן אות MS היציבה ביותר (electropherogram יון הכולל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי אופטימיזציה של המיקום של פולט הקצה הנקבובי וקביעת מתח ESI האופטימלי, להגדיר את מתח ESI ל -0 V ולהפחית את מתח CE מ 30 קילו עד 1 קילו וולט באמצעות זמן רמפה של 5 דק &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור usin שיטת MSg מתח ESI אופטימלית שיטה לספירה על המכשיר CE לניתוח סטנדרטים המטבוליט דגימות ביולוגיות. </li></ol></li></ol> 3. ניתוח של תקני המטבוליט ו דגימות ביולוגיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת ביצועים של מערכת CE-MS sheathless <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 20 μl של התערובת תקן המטבוליט anionic לתוך microvial 100 μl ריק (בקבוקון PCR) אשר נכנס לתוך בקבוקון CE ולשים בקבוקון זה במגש מדגם מפרצון. הערה: ההיקף המינימאלי הנדרש microvial עבור זריקה אמינה הוא 2 μl. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את שיטת מצב יונים שלילי רכישת MS שנוצרה במהלך השלב 2.2.9 ולאחר מכן להתחיל את רצף CE באמצעות תוכנת שליטה על המכשיר לספירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטף את נימי הפרדה עם BGE ב 50 psi במשך 3 דקות ואחריו הזרקה ב 2.0 psi במשך 60 שניות (20 nl מתאימים 3% מנפח הנימים) ולאחר מכן על ידי הזרקת BGE ב 1.0 psi במשך 10שניות. הערה: בהמשך, MS רכישת נתונים מופעלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת מתח של -30 ק עם זמן רמפה של 1.0 דקות עם לחץ של 0.5 psi במשך 30 דקות ב המפרצון. לאחר הפרדה 30 דקות electrophoretic, לעצור רכישת נתונים MS ולהפחית את המתח CE ל -1 קילו וולט באמצעות זמן הרמפה של 5 דקות (ירידה הדרגתית של מתח CE לאחר הפירוד electrophoretic משפר את העמידות של פולט נימי טיפ נקבובי). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין זריקות מדגמות, יש לשטוף את הנימים עם מים, 0.1 M נתרן הידרוקסידי, מי BGE כל 30 psi במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הנתונים שנרשמו על ידי קביעת הפעמים הגירה ואת עוצמת האות של תערובת המטבוליט anionic המנותחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך אם אמות המידה המטבוליט anionic להופיע באיזור שבין 10 ו -28 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק אם שלושת האיזומרים הקשורות מבנית, כלומר, D- גלוקוז-1-פוספט, D- גלוקוז-6-פוספט ו- D-פרוקטוז-6-פוספט הםחלקית מופרד, כלומר, ההחלטה בין שני השיאים הראשונים היא בסביבות 0.75 ושל שני השיאים האחרונים היא בסביבות 0.50 (ראה איור 1). הערה: על-פי החלטה 1.5 מצביעה על פרדת בסיס של שתי פסגות סמוכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1.1 ו 3.1.2 עבור תערובת המטבוליט קטיוני. ודא כי זיהוי טרשת נפוצה היא כעת במצב יון חיובי ומתח CE הוא +30 ק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הנתונים שנרשמו על ידי קביעת הפעמים הגירה ואת עוצמת האות של תערובת המטבוליט קטיוני המנותחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך אם אמות המידה המטבוליט קטיוני להופיע באיזור שבין דקות 8 ו -22. בדוק אם isoleucine ו לאוצין הם נודדים בין 15 ל 15.5 דקות ולקבוע אם ההחלטה היא בסביבות 0.5. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח של דגימות ביולוגיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1.1 ו 3.1.2 עבור פרופיל מטבולי anionic של תמצית של הקו הסלולרי גליובלסטומה. הערה: con מטבוליתאוהל המתקבל לאחר טיפול מקדים מדגם מקביל צפיפות התאים של בסביבות 20 תאים / NL, ולכן, זריקה 20 NL הוא המקבילה של 400 תאים לכל ניתוח. . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור electropherogram יון חילוץ עבור חומצה לקטית המטבוליט (m / z 89.0243) באמצעות 5 דיוק המוני מד&quot;א לבדוק אם עוצמת האות הוא מעל 100,000 ספירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1.1 ו 3.1.2 עבור פרופיל מטבולי קטיוני של תמצית של הקו הסלולרי גליובלסטומה. הערה: electropherogram יון הכולל ביותר עתיר ידע יש לשים לב עבור זריקה 20 NL במצב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הניתוחים או כאשר אינו בשימוש, יש לשטוף את הנימים עם מים ב 50 psi במשך 15 דקות ולאחסן חלק המפרצון של הנימים בתוך מים המכילים בקבוקון בסעיף הנקבובי (חלק לשקע) בצינור גם המכיל מים. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ramautar, R., Berger, R., van der Greef, J., Hankemeier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+metabolomics:+strategies+to+understand+biology.">Human metabolomics: strategies to understand biology.</a> Curr Opin Chem Biol. 17, 841-846 (2013).</li><li>Wishart, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMDB+3.0--The+Human+Metabolome+Database+in+2013.">HMDB 3.0--The Human Metabolome Database in 2013.</a> Nucleic Acids Res. 41, D801-D807 (2013).</li><li>Psychogios, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+serum+metabolome.">The human serum metabolome.</a> PLoS One. 6, e16957 (2011).</li><li>Gulersonmez, M. C., Lock, S., Hankemeier, T., Ramautar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sheathless+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+for+anionic+metabolic+profiling.">Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry for anionic metabolic profiling.</a> Electrophoresis. 37, 1007-1014 (2016).</li><li>Ramautar, R., Busnel, J. M., Deelder, A. M., Mayboroda, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+coverage+of+the+urinary+metabolome+by+sheathless+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry.">Enhancing the coverage of the urinary metabolome by sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Anal Chem. 84, 885-892 (2012).</li><li>Ramautar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+human+urine+by+CE-MS+using+a+positively+charged+capillary+coating+and+comparison+with+UPLC-MS.">Metabolic profiling of human urine by CE-MS using a positively charged capillary coating and comparison with UPLC-MS.</a> Mol Biosyst. 7, 194-199 (2011).</li><li>Naz, S., Garcia, A., Barbas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplatform+analytical+methodology+for+metabolic+fingerprinting+of+lung+tissue.">Multiplatform analytical methodology for metabolic fingerprinting of lung tissue.</a> Anal Chem. 85, 10941-10948 (2013).</li><li>Ibanez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CE/LC-MS+multiplatform+for+broad+metabolomic+analysis+of+dietary+polyphenols+effect+on+colon+cancer+cells+proliferation.">CE/LC-MS multiplatform for broad metabolomic analysis of dietary polyphenols effect on colon cancer cells proliferation.</a> Electrophoresis. 33, 2328-2336 (2012).</li><li>Soga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+anionic+intermediates+for+Bacillus+subtilis+metabolic+pathways+by+capillary+electrophoresis+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Simultaneous determination of anionic intermediates for Bacillus subtilis metabolic pathways by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 74, 2233-2239 (2002).</li><li>Soga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+metabolome+analysis+using+capillary+electrophoresis+mass+spectrometry.">Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 2, 488-494 (2003).</li><li>Britz-McKibbin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis-electrospray+ionization-mass+spectrometry+(CE-ESI-MS)-based+metabolomics.">Capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry (CE-ESI-MS)-based metabolomics.</a> Methods Mol Biol. 708, 229-246 (2011).</li><li>Ibanez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+metabolomic+workflow+for+early+detection+of+Alzheimer's+disease.">A new metabolomic workflow for early detection of Alzheimer's disease.</a> J Chromatogr A. 1302, 65-71 (2013).</li><li>Kuehnbaum, N. L., Britz-McKibbin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+advances+in+separation+science+for+metabolomics:+resolving+chemical+diversity+in+a+post-genomic+era.">New advances in separation science for metabolomics: resolving chemical diversity in a post-genomic era.</a> Chem Rev. 113, 2437-2468 (2013).</li><li>Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+metabolomic+investigation+of+single+neurons+by+capillary+electrophoresis+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 8, 783-799 (2013).</li><li>Hirayama, A., Wakayama, M., Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolome+analysis+based+on+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry.">Metabolome analysis based on capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Trac-Trend Anal Chem. 61, 215-222 (2014).</li><li>Maxwell, E. J., Chen, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+years+of+interface+development+for+capillary+electrophoresis-electrospray+ionization-mass+spectrometry.">Twenty years of interface development for capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry.</a> Anal Chim Acta. 627, 25-33 (2008).</li><li>Bonvin, G., Schappler, J., Rudaz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis-electrospray+ionization-mass+spectrometry+interfaces:+fundamental+concepts+and+technical+developments.">Capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry interfaces: fundamental concepts and technical developments.</a> J Chromatogr A. 1267, 17-31 (2012).</li><li>Hirayama, A., Tomita, M., Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sheathless+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+with+a+high-sensitivity+porous+sprayer+for+cationic+metabolome+analysis.">Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry with a high-sensitivity porous sprayer for cationic metabolome analysis.</a> Analyst. 137, 5026-5033 (2012).</li><li>Bonvin, G., Schappler, J., Rudaz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-aqueous+capillary+electrophoresis+for+the+analysis+of+acidic+compounds+using+negative+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Non-aqueous capillary electrophoresis for the analysis of acidic compounds using negative electrospray ionization mass spectrometry.</a> J Chromatogr A. 1323, 163-173 (2014).</li><li>Moini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplifying+CE-MS+operation.+2.+Interfacing+low-flow+separation+techniques+to+mass+spectrometry+using+a+porous+tip.">Simplifying CE-MS operation. 2. Interfacing low-flow separation techniques to mass spectrometry using a porous tip.</a> Anal Chem. 79, 4241-4246 (2007).</li><li>Dettmer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+extraction+from+adherently+growing+mammalian+cells+for+metabolomics+studies:+optimization+of+harvesting+and+extraction+protocols.">Metabolite extraction from adherently growing mammalian cells for metabolomics studies: optimization of harvesting and extraction protocols.</a> Anal Bioanal Chem. 399, 1127-1139 (2011).</li></ol>

We have nothing to disclose.

שיטת sheathless CE-MS העסקת פולט קצה נקבובי הוצגה לניתוח מטבוליטים קוטב והטעון. תכונה ייחודית של גישה זו היא כי מטבוליטים anionic או קטיוני ניתן צדודית רק על ידי החלפת זיהוי הטרשת הנפוצה קוטביות CE מתח. קיים מגוון רחב של מטבוליטים קוטב וטעונים דגימות ביולוגיות ניתן לנתח עם יעילות הפרדה גבוהה, שהוא חיוני עבור מטבוליטים דומים מבני, ועם מגבלות של גילוי בטווח (הנמוך) ננו-מולר. הפרוטוקול המובא התמקד השימוש sheathless CE-MS עבור פרופיל מטבולי של תמציות התא על מנת להדגים את התועלת של השיטה עבור פרופיל מטבולי של דגימה ביולוגית. הגישה המתוארת כאן יכולה לשמש גם עבור פרופיל מטבולים של סוגים אחרים של דגימות ביולוגיות, כגון שתן אדם 5, בהתחשב בכך הליך מקדים מדגם נאות משמש. Sheathless CE-MS methoד מבוסס על פולט קצה נקבובי אשר מאפשר את השימוש של הנכס נמוך זרימת מיסודם של CE. בהקשר זה, אות ESI יציבה היא תנאי מוקדם ללימודי פרופיל מטבולי לשחזור. לפיכך, חשוב כי הקצה המרסס ממוקם כראוי מול כניסת MS. בשנת הקמה זה, תהליך ESI הוא בעיקר תלוי באופי של BGE ולכן, אופטימיזציה BGE היא קריטית. תצורת sheathless היא פחות צדדית בהשוואה למערכות נדן נוזל CE-MS שבו כל מיני יצירות נדן נוזלי ניתן להוסיף כדי לשפר את יעילות יינון. המחט מרסס ESI sheathless צריך להיות מלא לחלוטין עם נוזל מוליך (כלומר, פתרון BGE). אות ESI יציבה יכולה לנבוע נימים חלקיות או מחוברות היטב. שטיפה בלחץ גבוה עם BGE עשויה לפתור בעיה זו. אחרת נימי ההפרדה צריכה להיות מוחלפות. לפני הערכת ביצועים אנליטיים, אות רקע ESI יציבהצריך להיווצר הראשון אשר עולה בקנה אחד מ יום אחד למשנהו. המופע האנליטית של שיטת CE-MS sheathless ללימודי פרופיל מטבולי צריך להיבדק מדי יום באמצעות תערובות תקן המטבוליט. תחת אותם תנאים ניסיוניים, פעמים הגירה עקבית, כלומר, וריאציה מתחת ל -3% עבור בתוך ימים (n = 10) ובין-יום (n = 5) באמצעות הזרקת 20 nl של תערובת תקן המטבוליט (12.5 מיקרומטר), שיא גבהים / אזורים (וריאציה מתחת ל -15%) ואת מספר לוחית רישוי (הנע בין 60,000 ו 400,000) יש לקבל. מגבלות של גילוי צריכות להיות בטווח nanomolar בתקני המטבוליט ביותר. רק כאשר יתקיימו התנאים הבאים הוא השיטה מוכנה פרופיל מטבולים של דגימות ביולוגיות. אם לא, מכשיר MS צריך להיות מכוון מחדש מכויל או פולט נימי טיפ הנקבובי צריך להיות שונה. צעד שטיפה יעיל בין CE-MS מנתח הוא בעל חשיבות גבוהה, לא רק כדילמנוע שריד פוטנציאל אלא גם כדי לשמור על ביצועי ההפרדה. שריד פוטנציאלי עשוי להיגרם על ידי בקבוקוני BGE מזוהמים המדגם ולכן לפתור על ידי החלפה עם בקבוקוני BGE חדשים. כאשר שיטת sheathless CE-MS אינה בשימוש, חשוב לנתק את נימי הפרדה לאחסן בצד המפרצון של הנימים במים מבחוץ שקוע עם שרוול ההגנה בתוך שפופרת המכילה מים להאריך חי נימים. לסיכום, שיטת CE-MS sheathless המוצע מראה פוטנציאל חזק עבור פרופיל מטבולים של דגימות ביולוגיות כאשר נעשה שימוש בהתאם לנהלי דיווח בפרוטוקול זה. בשלב זה, נתוני ההשוואה הבין-מעבדה נדרשים בהחלט עבור CE-MS sheathless כדי להעריך את שחזור (לטווח ארוך) וחוסנם של גישה זו עבור metabolomics. פרוטוקול זה עשוי לעורר מחקר כזה. אתגרים אנליטיים שונים עדיין צריכים להילקח בחשבון. לקבלת ביצועים זו אופטימליתormance, הזרם CE צריך להישמר רצוי מתחת ל -5 מיקרו-אמפר ובשלב זה קרינת טיפ נקבובי נימי ניתנים רק באורך של 91 ס&quot;מ אשר עשוי לעכב התפתחות של מבחני תפוקה גבוהה. יתר על כן, חיץ הפרדת pH נמוך שמש פרופיל מטבולי anionic אשר לא יכול להיות האופטימלי ביותר להשגת פרדת בסיס של פוספטים סוכר הקשורות מבני. חשוב גם הוא כי מטבוליטים anionic רק ניתן לנתח אשר (חלקית) טעונים שלילי בתנאי ההפרדה המשומשים. השלב הבא הוא להעריך את התועלת של השיטה CE-MS sheathless ללימודי פרופיל מטבולי קליניים כרגע, פולט נימי טיפ נקבובי יחיד יכול לשמש רק עבור ניתוח של עד 100 דגימות ביולוגיות. בסך הכל, התפתחות נוספת בגישה sheathless CE-MS תפתח כיוון חדש בתחום metabolomics, כלומר, לקראת הבנה עמוקה יותר של תפקודים ביולוגיים שבסעיףבמקרים בשפע-מוגבל.

בשנת metabolomics עכשווי, טכניקות הפרדה אנליטית גבוהה סוף משמשים לנתח מגוון רחב של שיעורים המטבוליט על מנת לקבל נציג לקריאה מתוך המצב הפיזיולוגי של אורגניזם 1. המטרה הסופית של מחקר metabolomics היא להשיג תשובה לשאלה ביולוגית / קלינית נתון. נכון לעכשיו, המאגר האנושי metabolome מורכב יותר מ -40,000 ערכים המטבוליט המייצגים הוא תרכובות אנדוגני אקסוגניים (את המקור האחרון מ מזין, חיידקים, סמים ממקורות אחרים) 2. בהינתן המגוון העצום פיסיקלי כימי וטווח ריכוז של מטבוליטים אלה, שיטות אנליטיות מרובות עם מנגנוני הפרדה שונים צריכות לשמש בשילוב במטרה לאפיין מטבוליטים רבים ככל האפשר בתוך דגימה ביולוגית נתונה. לדוגמה, Psychogios et al. השתמשו בשילוב של חמש טכניקות הפרדה אנליטית פרופ מטבוליתiling של נסיוב אדם וכתוצאה מכך זיהוי של יותר מ -4,000 מטבוליטים מגוונים כימי 3. במאמר זה, תשומת לב תשולם אסטרטגיות CE-MS שפותחו לאחרונה על פרופיל מטבולים של דגימות ביולוגיות 4,5. ב CE, לייתר דיוק אלקטרופורזה אזור נימים (CZE; המכונה בדרך כלל כמו CE), תרכובות מופרדות על בסיס תשלום לגודל- שלהם היחס, ולכן שיטה אנליטית זו היא מתאימה ביותר לניתוח של מטבוליטים קוטב וטעונים. מנגנון הפרדת CE הוא שונה במהותו מן הטכניקות מבוססות chromatographic, ובכך לספק תצוגה משלים על הרכב מהטבולים של דגימות ביולוגיות 6-8. סוגה ועמיתים לעבודה היו הראשונים להציג את התועלת של CE-MS עבור פרופיל העולמי של מטבוליטים דגימות ביולוגיות 9,10. עד עכשיו, את הכדאיות והתועלת של CE-MS עבור metabolomics הודגמה 11-15 נרחב.CE מצמיד בדרך כלל MS באמצעות נוזלי נדן התממשקות טכניקת 16,17; עם זאת, עקב דילול של קולחי נימים ידי נוזל הנדן, את רגישות הזיהוי נפגעת באופן מהותי. לאחרונה, הוכיח כי שימוש ממשק sheathless שפר בצורה משמעותית את כיסוי זיהוי של מטבוליטים נוכחי דגימות ביולוגיות שונות לעומת CE-MS ניצול ממשק קלסי נדן נוזלי 5,18,19. לדוגמא, בסביבות 900 תכונות מולקולריות אותרו בשתן אנושי ידי sheathless CE-MS בעוד כ -300 תכונות מולקולריות נצפו עם 5 הנדן נוזל CE-MS. הממשק sheathless בשימוש התבסס על פולט קצה נקבובי, אשר הומצא על ידי Moini 20, המאפשר שימוש יעיל של הנכס תזרים נמוך מהותית של CE בשילוב עם ננו-ESI-MS. על מנת לעורר את השימוש sheathless CE-MS בתחום metabolomics,פרוטוקול מוצג המתאר כיצד גישה זו יכולה לשמש עבור הניתוח של מטבוליטים קוטביים מאוד דגימות ביולוגיות, כפי שהודגמה לניתוח תמציות מקו תא גליובלסטומה. הוא הראה כי שיטת CE-MS sheathless עבור הפרופיל של מטבוליטים קטיוני יכולה לשמש גם עבור הפרופיל של מטבוליטים anionic באמצעות אותו בדיוק התנאים נימי והפרדה, ובכך להפחית את זמן ניתוח ומתן פלטפורמה אנליטית אחת עבור הפרופיל העולמי של מטבוליטים טעונים. הפרוטוקול מתאר גם אסטרטגיה עבור היישור היעיל של פולט הקצה הנקבובי sheathless עם מכשיר MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="958">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CESI 8000 instrument</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">A98089</td>
			<td style="width:395px;">OptiMS adapter required to couple CESI to MS</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">OptiMS Fused-Silica Cartridge, 30 &#956;m ID x 90 cm total length</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">B07367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">B07363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CESI vials</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">B11648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro vials</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">144709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">A6283</td>
			<td>Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Cationic metabolite mixture</td>
			<td style="width:167px;">Human Metabolome Technologies</td>
			<td style="width:181px;">H3304-3034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Anionic metabolite mixture</td>
			<td style="width:167px;">Human Metabolome Technologies</td>
			<td style="width:181px;">H3304-1031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Methanol (LC-MS Ultra Chromasolv)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">14262</td>
			<td>Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hydroxide solution</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">72079</td>
			<td>0.1 M</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">U-87 MG Glioblastoma cell line</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td>89081402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:181px;">650498</td>
			<td>Toxic; use in fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sheathless capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry for metabolic profiling of biological samples

בשנת metabolomics, מגוון רחב של שיטות אנליטיות משמש הפרופיל העולמי של (אנדוגני) מטבוליטים בדגימות מורכבות. במאמר זה, פרוטוקול מוצג ניתוח של מטבוליטים anionic ו קטיוני דגימות ביולוגיות על ידי ספקטרומטריית אלקטרופורזה-מסה נימי (CE-MS). CE הוא מתאים היטב בניתוח מטבוליטים קוטב וטעון כמו תרכובות מופרדות על בסיס יחס תשלום לגודל- שלהם. עיצוב ממשק sheathless שפותחו לאחרונה, כלומר, ממשק טיפ נקבובי, משמש צימוד CE כדי electrospray יינון (ESI) MS. גישה זו מאפשרת התממשקות את השימוש היעיל של נכס התזרים נמוך המהותית של CE בשילוב עם MS, וכתוצאה מכך לתחום גילוי nanomolar עבור מגוון רחב של שיעורי המטבוליט קוטב. הפרוטוקול המובא כאן מבוסס על העסקת נימים התמזג-סיליקה חשופה עם פולט קצה נקבובי בתנאי הפרדה הנמוכה pH לניתוח שלמגוון רחב של שיעורים המטבוליט ב דגימות ביולוגיות. הוא הוכיח כי באותו sheathless שיטת CE-MS יכול לשמש עבור פרופיל של מטבוליטים קטיוני, כולל חומצות אמינו, נוקלאוזידים ופפטידים קטנים, או מטבוליטים anionic, כולל פוספטים סוכר, נוקלאוטידים וחומצות אורגניות, על ידי רק מיתוג זיהוי טרשת נפוצה קוטביות מתח ההפרדה. מאוד פרופילי מידע עשיר מטבוליים בדגימות ביולוגיות שונות, כגון שתן, נוזל השדרתי ותמציות של הקו הסלולרי גליובלסטומה, ניתן להשיג על ידי פרוטוקול זה תוך פחות מ 1 שעות של ניתוח CE-MS.

שיטת CE-MS sheathless המוצע היא מסוגלת לספק יעיל ביותר, כלומר, את מספר לוחית רישוי החל 60,000 עד 400,000, פרופילים של מטבולית anionic ו קטיוני ב לתחום גילוי nanomolar באמצעות 10% חומצה אצטית (pH 2.2) כמו BGE. מופע הפרדת השיטה לניתוח מטבוליטים anionic הקוטביים מאוד מודגם במשך שלושה איזומרים פוספט סוכר הקשורות מבני (איור 1). למרות הפרדה ההתחלה היה לא השיג שלוש analytes אלה, הפרדה חלקית מספיק כדי לאפשר זיהוי סלקטיבית שלהם על ידי MS כמו analytes אלה יש מסה זהה בדיוק. הפוטנציאל של השיטה CE-MS sheathless עבור פרופיל מטבולי של מספר מוגבל של תאים, כלומר, זריקה 20 nl תואמת 400 תאים (צפיפות התאים הוא בסביבות 20 תאים / NL), הוא הוכיח לניתוח מטבוליטים קטיוני ב תמצית של הקו הסלולרי גליובלסטומה (איור 2), שבו יותר מ -300 תכונות מולקולריות אותרו מעל ≥ S / N יחס 5. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig1.jpg" /> איור 1. ניתוח של איזומרים פוספט סוכר ידי sheathless CE-MS. Electropherogram יון מחולץ עבור שלושת האיזומרים פוספט סוכר (25 מיקרומטר) שהושג עם sheathless CE-MS במצב יונים שליליים. תנאי ניסוי: BGE, 10% חומצה אצטית (pH 2.2); מתח הפרדה, -30 קילו וולט (psi 0.5 להחיל על המפרצון של הנימים לספירה); הזרקת מדגם, 2.0 psi במשך 60 שניות. לשכפל באישור 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig2.jpg" /> ניתוח איור 2. של isoleucine ואניeucine ידי electropherogram יון sheathless CE-MS. שחולצו משני איזומרים חומצת אמינו (25 מיקרומטר) שהושג עם sheathless CE-MS במצב יון חיובי. תנאי ניסוי: BGE, 10% חומצה אצטית (pH 2.2); מתח הפרדה, +30 ק ו; הזרקת מדגם, 2.0 psi במשך 60 שניות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig3.jpg" /> פוטנציאל איור 3. sheathless CE-MS לאפיון מטבוליטים קטיוני בתמצית שורת תאים. הפרופיל המטבולי (electropherogram יון הכולל) שנצפתה תמצית של שורת תאים גליובלסטומה עם sheathless CE-MS במצב יון חיובי. תנאי ניסוי: BGE, 10% חומצה אצטית (pH 2.2); מתח הפרדה, +30 ק ו; הזרקת מדגם, 2.0 psi במשך 60 שניות. לשכפל באישור 4 </sעד&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sheathless Capillary Electrophoresisâ€“Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples at JoVE.com

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

פרוטוקול עבור פרופיל מטבולים של דגימות ביולוגיות על ידי ספקטרומטריית אלקטרופורזה-מסת נימים באמצעות עיצוב ממשק טיפ נקבובי sheathless מוצג.

Sheathless נימי אלקטרופורזה-ספקטרומטריית מסה עבור מטבולית Profiling של דגימות ביולוגיות

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

sheathless-capillary-electrophoresismass-spectrometry-for-metabolic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.6K Views.  Leiden University.  פרוטוקול עבור פרופיל מטבולים של דגימות ביולוגיות על ידי ספקטרומטריית אלקטרופורזה-מסת נימים באמצעות עיצוב ממשק טיפ נקבובי sheathless מוצג. 

Video: Sheathless Capillary Electrophoresis–Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The biological activity of these proteins depends on their physicochemical properties. The use of high-performance techniques like chromatography and capillary electrophoresis has been described for the analysis of physicochemical heterogeneity of mAbs. Nowadays, capillary zone electrophoresis (CZE) technique constitutes one of the most resolutive and sensitive assays for the analysis of biomolecules. Besides, the electro-driven separation in CZE is governed by extensive properties of matter and offers the advantage of analyzing proteins close to their native state. However, the successful implementation of this technique for routine analysis depends on the skills of the analyst at the critical steps during sample and system preparation. The purpose of this tutorial is to detail the steps to succeed in the CZE analysis of mAbs. Further, this protocol can be used for the development and improvement of skills of the personnel involved in protein analytical chemistry laboratories.

Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.

הפרדת אלקטרופורזה הנימים של חד השבטי הנוגדן isoforms באמצעות נימי Neutral

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by networks of interacting protein complexes, which are often difficult to investigate because their binding is non-covalent and easily perturbed by purification techniques. This work describes a method of stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Tissue lysate is loaded onto a non-denaturing blue-native polyacrylamide gel, then an electric current is applied until the protein migrates a short distance into the gel. The gel strip containing the migrated protein is then excised and incubated with the amine-reactive cross-linking reagent dithiobis(succinimidyl propionate), which covalently stabilizes protein complexes. The gel strip containing cross-linked complexes is then cast into a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel, and the complexes are separated completely. The method relies on techniques and materials familiar to most molecular biologists, meaning it is inexpensive and easy to learn. While it is limited in its ability to adequately separate extremely large complexes, and has not been universally successful, the method was able to capture a wide variety of well-studied complexes, and is likely applicable to many systems of interest.

A method for stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue lysate using an amine-reactive protein cross-linker coupled to a novel two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) system is presented.

Multimer-עמוד: שיטה לכידת וחלבון פתרון מתחמי דגימות ביולוגיות

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and isobaric labeling multiplexing capacity. Here, we introduce a deep-proteomics profiling protocol that combines 10-plex tandem mass tag (TMT) labeling with an extensive LC/LC-MS/MS platform, and post-MS computational interference correction to accurately quantitate whole proteomes. This protocol includes the following main steps: protein extraction and digestion, TMT labeling, 2-dimensional (2D) LC, high-resolution mass spectrometry, and computational data processing. Quality control steps are included for troubleshooting and evaluating experimental variation. More than 10,000 proteins in mammalian samples can be confidently quantitated with this protocol. This protocol can also be applied to the quantitation of post translational modifications with minor changes. This multiplexed, robust method provides a powerful tool for proteomic analysis in a variety of complex samples, including cell culture, animal tissues, and human clinical specimens.

We present a protocol to accurately quantitate proteins with isobaric labelling, extensive fractionation, bioinformatics tools, and quality control steps in combination with liquid chromatography interfaced to a high-resolution mass spectrometer.

פרוטאום עמוק פרופיל על ידי תיוג Isobaric, מקיף כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה תוכנה בסיוע כמת

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host of biomolecules from drugs and lipids to N-glycans. Although various sample preparation techniques exist, detecting peptides from formaldehyde preserved tissues remains one of the most difficult challenges for this type of mass spectrometric analysis. For this reason, we have created and optimized a robust methodology that preserves the spatial information contained within the sample, while eliciting the greatest number of ionizable peptides. We have also aimed to achieve this in a cost effective and simple way, thereby eliminating potential bias or preparation error, which can occur when using automated instrumentation. The end result is a reproducible and inexpensive protocol.

This protocol describes a reproducible and reliable method for the sublimation-based preparation of formalin fixed tissue destined for imaging mass spectrometry.

הכנה אופטימלית של פורמלין קבוע דוגמאות עבור פפטיד מבוסס מטריקס בסיוע לייזר Desorption/יינון ספקטרומטר מסה הדמיה זרימות עבודה

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For a long time, the gene expression studies were dominated by research on the transcriptional level. However, the steady-state levels of mRNAs do not correlate well with protein production, and the translatability of mRNAs varies greatly depending on the conditions. In some organisms, like the parasite Leishmania, the protein expression is regulated mostly at the translational level. Recent studies demonstrated that protein translation dysregulation is associated with cancer, metabolic, neurodegenerative and other human diseases. Polysome profiling is a powerful method to study protein translation regulation. It allows to measure the translational status of individual mRNAs or examine translation on a genome-wide scale. The basis of this technique is the separation of polysomes, ribosomes, their subunits and free mRNAs during centrifugation of a cytoplasmic lysate through a sucrose gradient. Here, we present a universal polysome profiling protocol used on three different models - parasite Leishmania major, cultured human cells and animal tissues. Leishmania cells freely grow in suspension and cultured human cells grow in adherent monolayer, while mouse testis represents an animal tissue sample. Thus, the technique is adapted to all of these sources. The protocol for the analysis of polysomal fractions includes detection of individual mRNA levels by RT-qPCR, proteins by Western blot and analysis of ribosomal RNAs by electrophoresis. The method can be further extended by examination of mRNAs association with the ribosome on a transcriptome level by deep RNA-seq and analysis of ribosome-associated proteins by mass spectroscopy of the fractions. The method can be easily adjusted to other biological models.

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

The overall goal of polysome profiling technique is analysis of translational activity of individual mRNAs or transcriptome mRNAs during protein synthesis. The method is important for studies of protein synthesis regulation, translation activation and repression in health and multiple human diseases.

Polysome פרופיל לישמניה, תאים אנושיים, Testis העכבר

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of redox-regulated signaling in biological settings. Electron paramagnetic resonance spectroscopy (EPR) is the only direct method to assess free radicals unambiguously. Its advantage is that it detects physiologic levels of specific species with a high specificity, but it does require specialized technology, careful sample preparation, and appropriate controls to ensure accurate interpretation of the data. Cyclic hydroxylamine spin probes react selectively with superoxide or other radicals to generate a nitroxide signal that can be quantified by EPR spectroscopy. Cell-permeable spin probes and spin probes designed to accumulate rapidly in the mitochondria allow for the determination of superoxide concentration in different cellular compartments.
In cultured cells, the use of cell permeable 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) along with and without cell-impermeable superoxide dismutase (SOD) pretreatment, or use of cell-permeable PEG-SOD,&#160;allows for the differentiation of extracellular from cytosolic superoxide. The mitochondrial 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] piperidinium dichloride (mito-TEMPO-H) allows for measurement of mitochondrial ROS (predominantly superoxide).
Spin probes and EPR spectroscopy can also be applied to in vivo models. Superoxide can be detected in extracellular fluids such as blood and alveolar fluid, as well as tissues such as lung tissue. Several methods are presented to process and store tissue for EPR measurements and deliver intravenous 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) spin probe in vivo. While measurements can be performed at room temperature, samples obtained from in vitro and in vivo models can also be stored at -80 &#176;C and analyzed by EPR at 77 K. The samples can be stored in specialized tubing stable at -80 &#176;C and run at 77 K to enable a practical, efficient, and reproducible method that facilitates storing and transferring samples.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy is an unambiguous method to measure free radicals. The use of selective spin probes allows for detection of free radicals in different cellular compartments. We present a practical, efficient method to collect biological samples that facilitate treating, storing, and transferring samples for EPR measurements.

השימוש אלקטרון תהודה פאראמגנטיים בדגימות ביולוגיות-טמפרטורת הסביבה ו- 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) in eukaryotic cells. Precise identification of nitration sites on proteins is crucial for understanding the physiological and pathological processes related to protein nitration, such as inflammation, aging, and cancer. Since the nitrated proteins are of low abundance in cells even under induced conditions, no universal and efficient methods have been developed for the profiling and identification of protein nitration sites. Here we describe a protocol for nitropeptide enrichment by using a chemical reduction reaction and biotin labeling, followed by high resolution mass spectrometry. In our method, nitropeptide derivatives can be identified with high accuracy. Our method exhibits two advantages compared to the previously reported methods. First, dimethyl labeling is used to block the primary amine on nitropeptides, which can be used to generate quantitative results. Second, a disulfide bond containing NHS-biotin reagent is used for the enrichment, which can be further reduced and alkylated to enhance the detection signal on a mass spectrometer. This protocol has been successfully applied to the model peptide Angiotensin II in the current paper.

Proteomic profiling of tyrosine-nitrated proteins has been a challenging technique due to the low abundance of the 3-nitrotyrosine modification. Here we describe a novel approach for nitropeptide enrichment and profiling by using Angiotensin II as the model. This method can be extended for other in vitro or in vivo systems.

ניטרופפטיד פרופיל וזיהוי מאויר על ידי אנגיוטנסין השני

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of the RNA produced during a brief period of labelling. This is done by attaching a biotin moiety to the incorporated thio group and affinity purifying, using streptavidin coated beads. Achieving a good yield of pure, newly synthesized RNA that is free of pre-existing RNA makes shorter labelling times possible and permits increased temporal resolution in kinetic studies. This is a protocol for very specific, high yield purification of newly synthesized RNA. The protocol presented here describes how RNA is extracted from the yeast Saccharomyces cerevisiae. However, the protocol for purification of thiolated RNA from total RNA should be effective using RNA from any organism once it has been extracted from the cells. The purified RNA is suitable for analysis by many widely used techniques, such as reverse transcriptase-qPCR, RNA-seq and SLAM-seq. The specificity, sensitivity and flexibility of this technique allow unparalleled insights into RNA metabolism.

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

The use of thiolated uracil to sensitively and specifically purify newly transcribed RNA from the yeast Saccharomyces cerevisiae.

מהירה מאוד וספציפית תיוג מטבולי של RNA ב Vivo עם 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This publication presents a complete interaction proteomics workflow designed for identifying low abundance protein-protein interactions from the nucleus that could also be applied to other subcellular compartments. This workflow includes subcellular fractionation, immunoprecipitation, sample preparation, offline cleanup, single-shot label-free mass spectrometry, and downstream computational analysis and data visualization. Our protocol is optimized for detecting compartmentalized, low abundance interactions that are difficult to identify from whole cell lysates (e.g., transcription factor interactions in the nucleus) by immunoprecipitation of endogenous proteins from fractionated subcellular compartments. The sample preparation pipeline outlined here provides detailed instructions for the preparation of HeLa cell nuclear extract, immunoaffinity purification of endogenous bait protein, and quantitative mass spectrometry analysis. We also discuss methodological considerations for performing large-scale immunoprecipitation in mass spectrometry-based interaction profiling experiments and provide guidelines for evaluating data quality to distinguish true positive protein interactions from nonspecific interactions. This approach is demonstrated here by investigating the nuclear interactome of the CMGC kinase, DYRK1A, a low abundance protein kinase with poorly defined interactions within the nucleus.

Described is a proteomics workflow for identifying protein interaction partners from a nuclear subcellular fraction using immunoaffinity enrichment of a given protein of interest and label-free mass spectrometry. The workflow includes subcellular fractionation, immunoprecipitation, filter aided sample preparation, offline cleanup, mass spectrometry, and a downstream bioinformatics pipeline.

Immunoprecipitation ללא תווית של זרימת עבודה בהיקפים גדולים של החברה ליצירת פרופיל רב-ממדי של Interactome גרעינית

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...