פרוטוקול זה מספק מודל שימושי מבוסס תאים לחקר התפקוד והחדירות של מחסומי כלי דם סלקטיביים כגון מחסום דם-רשתית או דם-מוח עם התמקדות ספציפית באנדותל טרנסציטוזה. בדיקה זו קלה להתקנה ולשימוש שאינה דורשת בעלי חיים חיים. ניתן להשתמש בו לחקר רגולטורים מולקולריים שונים של חדירות תאי אנדותל וטרנסציטוזה המשפיעים על שלמות מחסום הרשתית הפנימית.
בדיקה זו יכולה לספק תובנות על ביולוגיה של כלי הדם ועל חקר העיניים והמוח, ומאפשרת הבנה טובה יותר של מנגנוני המולקולה העומדים בבסיס בקרת BRB BBB ולחקור העברת תרופות פוטנציאלית מעבר למחסומים. כדי להתחיל, הכינו את תוסף מסנן תרבית התאים לזריעת תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית אנושית או HRMECs, על ידי ציפוי כל תוסף ב-200 מיקרוליטרים של תמיסת ג'לטין 0.1% למשך 30 דקות מתחת למכסה מנוע זרימה למינרית. ודא שהפתרון מכסה את כל המשטח התחתון של תוספת המסנן.
קחו צלחת פטרי עם HRMECs מתורבתים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני, ושאפו את מדיית הצמיחה. שטפו בעדינות את התאים פעמיים עם 10 מיליליטר של 1X PBS מתחת למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית כדי להיפטר מהתאים הצפים או המתים הפוטנציאליים. לנתק את התאים עם 0.5 עד 1 מיליליטר של 0.25% תמיסת טריפסין-EDTA ולהניח את צלחת פטרי באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 5 דקות.
להרוות את פעילות הטריפסין על ידי הוספת 4.5 עד 9 מיליליטר של מדיה גדילה ולהעביר את תרחיף התא לתוך צינור 15 מיליליטר באמצעות פיפטה 10 מיליליטר. סובבו את התאים 200 פעמים גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות להסיר את supernatant ולתלות את הכדור ב 3 מיליליטר של מדיה צמיחה.
לספור את מספר התאים באמצעות hemocytometer ידני או מונה תאים אוטומטי וזרע בצפיפות של 40, 000 תאים לכל מסנן להוסיף. נפח ההשעיה של התא עבור כל תוספת הוא 250 microliters. שאפו את תמיסת הציפוי מהבארות המכילות תוספות חדירות והעבירו 250 מיקרוליטרים של תרחיף התא לכל הוספה, ולאחר מכן הוסיפו רק מדיום לאחת התוספות, אשר ישמשו כבקרה ריקה להתנגדות חשמלית טרנסאנדותלית, או TEER, מדידה.
בו זמנית, גם להוסיף 750 microliters של בינוני לכל באר בתאים basolateral. שמור את צלחת 24 באר עם תוספות חדירות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 7 עד 12 ימים עד תאים בתרבית להיות מפגש מלא ואת הערך TEER הרצוי של כ 20 אוהם לסנטימטר מרובע מושגת. לפני מדידות TEER, הנח את הלוח המכיל 24 בארות בתא במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 20 דקות לשיווי משקל טמפרטורה.
כדי למדוד את ה-TEER עבור HRMECs, באמצעות מערכת התנגדות חשמלית של וולט/אוהם האפיתל, חבר את האלקטרודה למטר, ושיווי משקל האלקטרודה על ידי השרייתה תחילה ב-70% אתנול למשך 15 עד 20 דקות ולאחר מכן טבילתה לזמן קצר במדיום הגדילה של תרבית התאים EGM. בצע מדידת TEER על ידי טבילה זהירה של האלקטרודה, כך שהקצה הקצר יותר נמצא בתוסף והקצה הארוך יותר נוגע בתחתית הבאר. מדוד תחילה את ההתנגדות על-פני הפקד הריק, ולאחר מכן עבור כל תוספת, מדוד את TEER במשולשים.
עם ההגעה למפגש עם ערכי TEER סביב 20 אוהם סנטימטרים רבועים, לשלול את התאים בסרום למשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני באמצעות 0.5% FBS ב- EBM בשני התאים לפני הטיפול עם הליגנד. EBM מופחת סרום שימש לאורך כל הבדיקה. דגירה של התאים באמצעות המדיום המופחת בסרום בתא האפיקלי עם תג ציאנין-3 פלואורסצנטי לליגנד טרנספרין למשך 60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
לאחר שטיפת המונולאייר באופן אפי ובזולטרלי 4 פעמים עם המדיום מופחת הסרום, הוסיפו מדיום טרי לתוספות המסנן המכילות את התאים והעבירו את התוספות לבארות טריות של צלחת 24 הבארות המכילות מדיום מופחת סרום שחומם מראש. דגירה של התאים במשך 90 דקות נוספות באינקובטור ולאחר מכן לאסוף את המדיום מן התא basolateral. רשום את עוצמת הפלואורסצנטיות של התמיסה מתא הבזולטרלי באמצעות גלאי פלואורסצנטי.
עם ההגעה למפגש עם ערכי TEER סביב 20 אוהם סנטימטר מרובע, לסרום לשלול את התאים למשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני באמצעות 0.5% FBS ב- EBM בשני התאים לפני הטיפול עם הליגנד. EBM מופחת סרום שימש לאורך כל הבדיקה. לאחר מכן, יש לטפל בתאים שבחדר האפיקלי באמצעות הטיפולים הרצויים ובקרות הרכב.
מוסיפים 5 מיליגרם למיליליטר של פרוקסידאז חזרת, או HRP, לתאים, ודוגרים במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הוסיפו מדיום טרי מופחת סרום לתא האפיקלי והעבירו את התוספות לבאר טרייה המכילה מדיה שחוממה מראש. לדגור את המונולייר במשך 90 דקות נוספות באינקובטור.
לאחר איסוף מדיום מתא basolateral, להוסיף 100 microliters של HRP פלואורוגני peroxidase מצע למדיום שנאסף לדגרה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. עצור את התגובה עם 100 מיקרוליטרים של תמיסת עצירה וזהה את הרמות של תוצר תגובת מצע HRP בתקשורת באמצעות קורא צלחות פלואורסצנטי. לפני הדגמת מבחני הטרנסציטוזה במבחנה, הדמיה של טרנסציטוזה של תאי אנדותל ברשתית מוצגת כמידע רקע.
כאן, תמונת מיקרוסקופ האור מראה לומן כלי דם מלא HRP ממקטע רשתית של עכבר מסוג פרא בן 3 חודשים המוכתם ב- DAB. HRP הוזרק רטרו-מסלולי. ניתן לראות כלי רשתית מלאים ב-HRP כמשקעים חומים כהים מתחת למיקרוסקופ הבהיר.
מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים דק במיוחד מראה כלי דם טרנסציטוטיים מלאים HRP עם RMECs המתארים טרנסציטוזה EC על פני מחסום הדם-רשתית הפנימי. כאן, השלפוחית הגדולה עשויה לשקף מקרופינוזום ותא דם אדום בצד הזוהר. תמונת TeM מציגה שלפוחיות טרנסציטוטיות קטנות מלאות HRP, ככל הנראה שלפוחיות קאוולה, בתוך RMEC.
צביעה אימונוהיסטוכימית של נוגדן CAV-1 ואיזולקטין B4 מדגימה את לוקליזציה של CAV-1, סמן של שלפוחיות קייבולה בכלי הדם ברשתית, ברשתית עכבר מסוג בר בת 3 חודשים. תמונת TeM של CAV-1 עם תווית אימונוגולד בתוך תאי האנדותל ברשתית מוצגת כאן עם תמונה מוגדלת של שלפוחית קייבולה חיובית CAV-1. עבור בדיקת טרנסציטוזה EC בתיווך קלתרין ב- HRMECs באמצעות טרנספרין, כאן, תמונה במיקרוסקופ פלואורסצנטי מראה העברה אנדוציטוזית של Cy3 בצבע אדום בתוך HRMECs מוכתמים ב- DAPI בכחול.
עבור טרנסציטוזה EC בתיווך מערות באמצעות HRP, איתות Wnt כאן משמש כדוגמה להדגמת הבדיקה. איתות Wnt נמצא לאחרונה כדי לווסת טרנסציטוזה EC בתיווך caveolae. התאים טופלו באמצעות מפעיל מסלול Wnt עם מדיום מותנה Wnt3a ונורין רקומביננטי, עם או בלי מעכב איתות Wnt XAV939 והבקרות הריאקטיביות שלהם.
מפעילי Wnt הפחיתו את רמת הטרנסציטוזה מבוססת HRP, שהתהפכה על ידי XAV939. מדידת TEER נכונה היא חיונית כדי לקבוע את שלמות החד-שכבתי. הוא מושפע מאוד מגורמים שונים כגון טיפול לא תקין, תנודות טמפרטורה, מדיום תרבות, משך תרבות וכו '.
בדיקה זו יכולה להשתנות כתרבית משותפת או כמערכות תרבית אורגנוטיפית תלת-ממדית המחקות תנאי in vivo.
