Name: a method for extracting pigments from squid doryteuthis pealeii
Uploaded: 2016-11-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii at JoVE.com

The authors gratefully acknowledge the use of facilities at the University of New Hampshire including the University Instrumentation Center. This work was supported by the University of New Hampshire, Department of Chemistry.

מחקרים בבעלי חיים חסרי חוליות שנערכו במסמך זה אינם מוסדרים בארצות הברית; ולכן ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש אין סמכות לבדיקה של פרוטוקולים כאלה. במקום אלה לא נופלים תחת תחום השיפוט של רגולציה בארצות הברית, בזאת המחברים קובעים כי המחקרים הללו נערכו עם מאמץ כנה כלפי השימוש האתי, טיפול, וטיפול של בעלי חיים אלה, את מספר האנשים היה ממוזער ומאמצים אלה עולה בקנה אחד עם הנחיות אתיקת הכרזת המועצה הבינלאומית באזל למדע בעלי חי מעבדה (ICLAS). 1. pealeii Doryteuthis (ד pealeii) Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיונון הרכישה הערוף ד pealeii ממח&#39; המשאבים הימיים במעבדה לביולוגיה הימית בוודס הול, MA או מכל שוק דגים טריים. אין להשתמש דגימות כי כבר שפרוסות או שינה קודמים כדי שתוכל להחיל הליך זה. באופן ספציפי, chromaשכבת tophore עדיין חייבת להיות ללא שינוי על הדגימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם בעלי החיים אינם משמשים מיד, לאחסן אותם ב -20 ° C עד השימוש. כדי להפשיר את דגימות, למקם אותם במים בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 לפני לנתיחה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים לנתיחה קנס נקודות ישר נירוסטה, לחתוך לאורך הצד האחורי של החיה. בגין בבסיס מעטפת הגחון, ולסיים ב באזור הסנפיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל האיברים הפנימיים (בטן, זימים, בלוטת דיו, אברי רבייה, לב מערכתי, ולב זרוע) על ידי הרמה אותם עם לנתח מלקחי ניתוק רקמת החיבור שלהם באמצעות מספריים לנתיחה. בטל איברים בתוך שקית דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש לנתח T-סיכות להצמיד המעטפת (צד סנפיר למעלה) בתוך 2 תקן 11-1 / &quot;x 7-1 / 2&quot; x 1-1 / 2 &quot;פאן לנתיחה אלומיניום המכיל כרית לנתיחה גמישה. להטביע את הרקמה 250 מיליליטר של מי ים כי סונן דרך מערכת סינון ואקום קלקר חד פעמיהמכיל גודל נקבובי 0.2 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את שכבת העור אפידרמיס (צבע אטום) עם מלקחיים לנתח, משאיר את שכבת העור המכיל כרומטופור ללא פגע. לאחר שכבת אפידרמיס מוסר, וזורק אותו בשקית דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח קטן (1 ס&quot;מ x 1 ס&quot;מ) סעיפים של השכבה כרומטופור עם מלקחיים ומספריים דיסקציה. לאסוף דגימות ב 1.5 מ&quot;ל צינורות מיקרו צנטריפוגות (למלא מחצית צינור אחד ריק עם הרקמה גזור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של מי ים מסונן אל הרקמה המכילה צינורות. הדגימות ניתן לאחסן לילה בשעה 4 ° C.. </li></ol> 2. בידוד כרומטופור גרגרי פיגמנט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיכול רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Papain / collagenase <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשקול 30 מ&quot;ג של collagenase ו -5 מ&quot;ג פפאין באמצעות חנקן 4 &quot;x 4&quot; נמוך לשקול נייר. העבר אלה לתוך צינור צנטריפוגות פוליפרופילן 50 מ&quot;ל עם ראש מתברג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד 10 מ&quot;ל של deionizמי ed בעזרת פיפטה בוגרת. להוסיף ישירות בקבוקון המכיל פפאין / collagenase. וורטקס על ההגדרה הגבוהה ביותר עד הפתרון הוא ברור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת רקמות תאיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה רקמת כרומטופור שנאספו צעד 1.7 במשך 5 דקות ב 14,000 x ז. מחק את השכבה העליונה של מי ים לתוך דלי פסולת פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של פתרון פפאין / collagenase אל הרקמה באמצעות micropipette ערוץ יחיד משתנה נפח P1000. וורטקס כל מדגם למשך 1-2 דקות על ההגדרה הגבוהה ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate את הדגימות למשך 5 דקות בתדירות של 40 kHz לנתק תאים מן הרקמה הסובבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 5 דקות ב g 14,000 x. בטל supernatant לתוך דלי פסולת פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה רקמת כרומטופור שנאספו במשך 5 דקות ב 14,000 x ז. מחק את השכבה העליונה של מי ים לתוך דלי פסולת פלסטיק. חזור שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה ידנית כל שניות רקמה גדולות הנותרותמשא שלא לעכל בתהליך זה עם מלקחיים לפני שתמשיך לשלב הבא. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד גרגרי פיגמנט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מאגר המגון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול 2.38 גר &#39;(4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic) (HEPES, 100 מ&quot;מ), 0.095 גרם של מגנזיום כלוריד (10 מ&quot;מ), 0.856 גרם של-אספרטט אשלגן (50 מ&quot;מ), ו 0.015 גרם של dithiothreitol (1 מ&quot;מ). העבר לתוך מיכל קלקר 150 מ&quot;ל עם ראש מתברג. להוסיף אחד מעכב פרוטאז Tablet מיני מסחרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד 100 מ&quot;ל מים ללא יונים באמצעות גליל סיים. להוסיף ישירות מיכל המכיל מלחי המגון. וורטקס עד הפתרון הוא ברור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המגון של גרגרי פיגמנט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם משלב 2.1 ב 14,000 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant לתוך דלי פסולת פלסטיק. מדגם זה אמור להיות ריק רקמת תאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 &amp;# 181; l של חיץ homogenization כדי צינור כל מערבולת במשך 1-2 דקות כל אחד לערבב את הדגימות ביסודיות. Sonicate את הדגימות למשך 30 דקות (~ 40 kHz) ופעל עם 5 דקות של צנטריפוגה ב 14,000 x ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant לתוך דלי פסולת פלסטיק, חזור על השלב הקודם 2-3 פעמים כדי להבטיח את העיכול המלא של רצועות sacculus וחלבון כרומטופור. הפתרון הנותר צריך להכיל supernatant אור צהובה גלולה אדומה בצבע המכיל את גרגרי פיגמנט מבודדים. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. הפקת פיגמנט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מתנול חומציים (HCl-MeOH) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להוסיף 25 μl של מרוכז (36.5-38% (w / w)) חומצה הידרוכלורית (HCl) עד 5 מ&quot;ל של מתנול (MeOH). אחסן את הפתרון HCl-MeOH בבקבוקון מדגם זכוכית מתברג. מערבולת בעדינות לתערובת הפתרון באופן אחיד. הערה: ככל חומצי הפתרון, הפיגמנט יותר יחולצו במהלך fiחילוץ ראשון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקת פיגמנט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה גרגר פיגמנט (מ 2.2.2) במשך 5 דקות ב 14,000 XG וזורקים supernatant לדלי פסולת פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של פתרון HCl-MeOH מערבולת מדגם עבור ~ 3-4 דקות. Sonicate את הדגימות למשך 10 דקות (~ 40 kHz), ואז צנטריפוגות במשך 5 דקות ב g 14,000 x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה העברה, לאסוף את supernatant בבקבוקון זכוכית 1 DRAM הברגה. את supernatant צריך להיות אדום כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על 3.2.2 מיצוי שלב עד אין צבע נוסף מופק (~ 4-5 שוטף). הערה: כל חילוץ יניב ~ 1.5 מיליליטר של פיגמנט. הגלולה חסרת הצבע שנותרת היא גרגרי חילוץ פיגמנט. הערה: שני גרגרי צבע ופיגמנטים שחולצו ניתן לאחסן מים ב 4 ° C עד לשימוש נוסף. </li></ol></li></ol> 4. אפיון לאורך תהליך החילוץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> El סריקהמיקרוסקופי ectron <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרגרי לתמונה (unreacted משלב 2.2.1 ו-חילוץ פיגמנט משלב 3.2.3) באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) כדי לאמת את הטוהר של תהליך החילוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין דוגמאות גרגיר הדמיה, צנטריפוגה הראשונה הוא גרגרי unreacted וגרגרי חילוץ פיגמנט במשך 5 דקות ב 14,000 XG, וזורקי supernatant לדלי פסולת פלסטיק. Re- להשעות אלה ב 1 מ&quot;ל של אתנול, והפקדת 2-3 טיפות של השעיה גרגיר על הספחים SEM אלומיניום בעזרת פיפטה ההעברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ייבוש דגימות לילה, גמגום מעיל עם ציפוי זהב-פלטינה במשך 3 דקות כדי להשיג ציפוי 15 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה באמצעות SEM עם פולט שוטקי וגלאי אלקטרונים משניים. השתמש מתח קורה 5-7 ק ו ו מרחק עבודה בין 8 ו -9 מ&quot;מ לתמונת חומרים אלה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultraviolet-גלוי (UV-VIS) מדידות spectrophotometric <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על פרו ספיגתקבצים עבור כל 3 התנאים (גרגיר unreacted מן 2.2.2, פיגמנט מופק 3.2.3, וגרגרי חילוץ פיגמנט מ 3.2.4) באמצעות ספקטרופוטומטר קרן כפול מ 200-800 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף מדידה ריק באמצעות מים ללא יונים ב קובט 1 מ&quot;ל עבור גרגרי unreacted ואת גרגרי חילוץ פיגמנט. אסוף ספקטרום ספיגת UV-Vis הן דוגמאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף מדידה ריק באמצעות פתרון מתנול חומצי קובט 1 מ&quot;ל עבור הפיגמנט חילוץ. אסוף ספקטרום ספיגת UV-Vis למדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע אורך גל מרבי של כל דגימה על ידי זיהוי את אורך הגל שבו השיא הספיג מגיע לגובה ביחס המקסימלית שלה. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bell, G. R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatophore+radial+muscle+fibers+anchor+in+flexible+squid+skin.">Chromatophore radial muscle fibers anchor in flexible squid skin.</a> Invertebr Biol. 132 (2), 120-132 (2013).</li><li>Crookes, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflectins:+The+unusual+proteins+of+squid+reflective+tissues.">Reflectins: The unusual proteins of squid reflective tissues.</a> Science. 303 (5655), 235-238 (2004).</li><li>Deravi, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure-function+relationships+of+a+natural+nanoscale+photonic+device+in+cuttlefish+chromatophores.">The structure-function relationships of a natural nanoscale photonic device in cuttlefish chromatophores.</a> J. R. Soc. Interface. 11 (93), 1-9 (2014).</li><li>M&#228;thger, L. M., Denton, E. J., Marshall, N. J., Hanlon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+behavioural+functions+of+structural+coloration+in+cephalopods.">Mechanisms and behavioural functions of structural coloration in cephalopods.</a> J. R. Soc. Interface. 6 (2), 149-163 (2009).</li><li>M&#228;thger, L. M., Hanlon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+basis+for+camouflaged+polarized+light+communication+in+squid.">Anatomical basis for camouflaged polarized light communication in squid.</a> Biol. Lett. 2 (4), 494-496 (2006).</li><li>M&#228;thger, L. M., Hanlon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malleable+skin+coloration+in+cephalopods:+selective+reflectance,+transmission+and+absorbance+of+light+by+chromatophores+and+iridophores.">Malleable skin coloration in cephalopods: selective reflectance, transmission and absorbance of light by chromatophores and iridophores.</a> Cell Tissue Res. 329 (1), 179-186 (2007).</li><li>Cloney, R. A., Brocco, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatophore+Organs,+Reflector+Cells,+Iridocytes+and+Leucophores+in+Cephalopods.">Chromatophore Organs, Reflector Cells, Iridocytes and Leucophores in Cephalopods.</a> Amer. Zool. 23 (3), 581-592 (1983).</li><li>Hanlon, R. T., Messenger, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+coloration+in+young+cutttlefish+(Sepia+officinalis+L)-+The+morphology+and+development+of+body+patterns+and+their+relation+to+behaviour.">Adaptive coloration in young cutttlefish (Sepia officinalis L)- The morphology and development of body patterns and their relation to behaviour.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 320 (1200), 437-487 (1988).</li><li>Sutherland, R. L., M&#228;thger, L. M., Hanlon, R. T., Urbas, A. M., Stone, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cephalopod+coloration+model.+II.+Multiple+layer+skin+effects.">Cephalopod coloration model. II. Multiple layer skin effects.</a> J. Opt. Soc. Am. 25 (8), 2044-2054 (2008).</li><li>Florey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+and+function+of+cephalopod+chromatophores.">Ultrastructure and function of cephalopod chromatophores.</a> Amer. Zool. 9 (2), 429-442 (1969).</li><li>Florey, E., Kriebel, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+and+mechanical+responses+of+chromatophore+muscle+fibers+of+squid,+Loligo+opalescens,+to+nerve+stimulation+and+drugs.">Electrical and mechanical responses of chromatophore muscle fibers of squid, Loligo opalescens, to nerve stimulation and drugs.</a> Z. Vergl. Physiol. 65 (1), 98-130 (1969).</li><li>Williams, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+Phenoxazone-Based+Pigments+to+the+Structure+and+Function+of+Nanostructured+Granules+in+Squid+Chromatophores.">Contributions of Phenoxazone-Based Pigments to the Structure and Function of Nanostructured Granules in Squid Chromatophores.</a> Langmuir. , (2016).</li><li>Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ommochrome+pigmentation+of+the+linea+and+rosa+seasonal+forms+of+Precis+coenia+(Lepidoptera:+Nymphalidae).">Ommochrome pigmentation of the linea and rosa seasonal forms of Precis coenia (Lepidoptera: Nymphalidae).</a> Arch. Insect. Biochem. Physiol. 36 (3), 215-222 (1997).</li><li>Van Den Branden, C., Decleir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Study+of+the+Chromatophore+Pigments+in+the+Skin+of+the+Cephalopod+Sepia+Officinalis.">A Study of the Chromatophore Pigments in the Skin of the Cephalopod Sepia Officinalis.</a> L. Biol. Jb. Dodonaea. 44 (2), 345-352 (1976).</li><li>Aubourg, S., Torres-Arreola, W., Trigo, M., Ezquerra-Brauer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Jumbo+Squid+Skin+Pigment+Extract+and+its+Antioxidant+Potential+ina+Marine+Oil+System.">Characterization of Jumbo Squid Skin Pigment Extract and its Antioxidant Potential ina Marine Oil System.</a> Eur. J. Lipid Sci. Technol. 118, (2016).</li></ol>

We have nothing to disclose.

אנחנו הוכחנו שיטה לחלץ פיגמנטים מתוך גרגרי כרומטופור דיונון. על ידי מיקוד הגרגרים במיוחד, המטרה שלנו היא לקבוע את תפקידם לתווך צבע אדפטיבית. שיטה זו בשונה מדוחות קודמים נועד לאפיין פיגמנטים סילוניות באמצעות דגימות רקמה בתפזורת 14 או מיובש בהקפאה העור 15. </p...

<html> דיונונים כגון דיונון, דיונון, תמנון יש את היכולת לשנות את המראה שלהם באופן דינמי עבור הסוואה ואיתות. 1-6 יכולת זו נתמכת בחלקה על ידי ההרחבה האזורית סלקטיבית של איברים פיגמנט המכונים כרומטופור. 4,7-9 כרומטופור הוא ומפעילים רכים המכילים רשת של גרגרי פיגמנט nanostructured הכלוא בתוך sacculus cytoelastic מעוגנים רדיאלית ידי סיבי שריר. 1,3 כפי שהם מופעלים, כרומטופור להרחיב ב -500% ב שטח פנים הציג הפצת גרגרי ברחבי האיברים. 3,7 , 10,11 כאשר פעולה זו מתואמת על פני מספר כרומטופור, הצבעוניות הכללית של החיה משתנית. אמנם ידוע כי גרגרי פיגמנט לתרום לשינוי הצבע הזה, הרכבן נותר עלום. אנו מתארים הליך לבודד ולטהר פיגמנטים כרומטופור אשר עשוי להיות מותאם ללימודי הלחנה בעתיד. ss = &quot;jove_content&quot;&gt; הבידוד של גרגרי פיגמנט כרוך מיצוי רב שלבים, המגון, הליך טיהור. 3,12 רקמה המכילה כרומטופור נאספה באמצעות כריתה זהירה מן סילוניות. תהליך העיכול ויצירת הומוגניות מכן נעשה שימוש כדי לנתק את הרקמה שמסביב ולהפריד התאים כרומטופור. גרגרי nanostructured אז הם מבודדים מטוהרים מן כרומטופור הנותר באמצעות sonication חוזרת צנטריפוגה. לאחר טיהור, פיגמנטים המחולצים הגרגירים תהליך מותאמת החילוץ של צבע גלוי כנפי הפרפר באמצעות פתרונות מתנול חומצי. 13 במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) ו spectrophotometry משמשים כדי לאשר את הפיגמנטים כרומטופור המחולצים בהצלחה באמצעות תהליך זה. שיטה זו מתארת ​​את הבידוד של גרגרי כרומטופור המשמש לחקור את התרומות המולקולריות גoloration ב דיונונים. 12 עקירות מולקולה קטנה מחיות כולו לעתים קרובות יכול להיות תהליך ארוך ומייגע. המטרה כאן היא ליידע חוקרים עתידיים של פרוטוקול יעיל קליל לרכישת פיגמנטים מן הגרגרים nanostructured ב דיונונים.

<table><tbody><tr><td>Collagenase</td><td>Alfa Aesar</td><td>9001-12-1</td><td>No hazard</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3482-12-3</td><td>Irritant, acute toxicity</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7365-45-9</td><td>Mild irritant</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>EMD Chemicals</td><td>7647-01-0</td><td>Corrosive</td></tr><tr><td>k-Aspartate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1115-63-5</td><td>Reacts violently with oxidants</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td>Mild eye irritant</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>67-56-1</td><td>Highly flammable</td></tr><tr><td>Mini tablet prtoease inhibitor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>469315-90-01</td><td>Corrosive to metal and skin</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-73-4</td><td>Irritant&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

a method for extracting pigments from squid doryteuthis pealeii

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities are supported in part by the areal expansion and retraction of pigmented organs known as chromatophores. While it is known that the chromatophores contain a tethered network of pigmented granules, their structure-function properties have not been fully detailed. We describe a method for isolating the nanostructured granules in squid Doryteuthis pealeii chromatophores and demonstrate how their associated pigments can be extracted in acidic solvents. To accomplish this, the chromatophore containing dermal layer is first manually isolated using a superficial dissection, and the pigment granules are removed using sonication, centrifugation, and washing cycles. Pigments confined within the purified granules are then extracted via acidic methanol solutions, leaving nanostructures with smaller diameters that are void of visible color. This extraction procedure produces a 58% yield of soluble pigments isolated from granules. Using this method, the composition of the chromatophore pigments can be determined and used to provide insight into the mechanism of adaptive coloration in cephalopods.

כרומטופור הוא גזור מן ד המעטפת הגבי pealeii (איור 1A, 1B). ברגע שהם מוסרים, כרומטופור הם lysed ו מטוהרים באמצעות מחזורים צנטריפוגה ושטיפת לבודד את גרגרי פיגמנט (איורים 2A, 2B). פתרונות מתנול חומציים (HCl-MeOH) משמשים כדי...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii at JoVE.com

A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii

פרוטוקול להפקת פיגמנטים מן גרגרי nanostructured ב כרומטופור דיונון Doryteuthis pealeii מוצג.

שיטה לחילוץ פיגמנטים מן קלמארי<em&gt; Doryteuthis pealeii</em

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities ...

a-method-for-extracting-pigments-from-squid-doryteuthis-pealeii

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii

9.3K Views.  University of New Hampshire.  פרוטוקול להפקת פיגמנטים מן גרגרי nanostructured ב כרומטופור דיונון Doryteuthis pealeii מוצג. 

Video: A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii

A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with the goal of examining the ecological functions of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. The result has been a progression of protocols that have increasingly refined the ecological relevance of the experimental approach. Here we present the most up-to-date version of a fish-feeding laboratory bioassay that enables investigators to assess the antipredatory activity of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. Organic metabolites of all polarities are exhaustively extracted from the tissue of the target organism and reconstituted at natural concentrations in a nutritionally appropriate food matrix. Experimental food pellets are presented to a generalist predator in laboratory feeding assays to assess the antipredatory activity of the extract. The procedure described herein uses the bluehead, Thalassoma bifasciatum, to test the palatability of Caribbean marine invertebrates; however, the design may be readily adapted to other systems. Results obtained using this laboratory assay are an important prelude to field experiments that rely on the feeding responses of a full complement of potential predators. Additionally, this bioassay can be used to direct the isolation of feeding-deterrent metabolites through bioassay-guided fractionation. This feeding bioassay has advanced our understanding of the factors that control the distribution and abundance of marine invertebrates on Caribbean coral reefs and may inform investigations in diverse fields of inquiry, including pharmacology, biotechnology, and evolutionary ecology.

This bioassay employs a model predatory fish to assess the presence of feeding-deterrent metabolites from organic extracts of the tissues of marine organisms at natural concentrations using a nutritionally comparable food matrix.

מעבדה מבדק-האכלת דגים לבחינת פעילות Antipredatory של משני מטבוליטים מהרקמות של אורגניזמים ימיים

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

Environment

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for understanding the development and evolution of morphological phenotypes. Abdominal pigmentation in Drosophila melanogaster has been particularly useful, allowing researchers to identify the loci that underlie inter- and intraspecific variations in morphology. Hitherto, however, D. melanogaster abdominal pigmentation has been largely assayed qualitatively, through scoring, rather than quantitatively, which limits the forms of statistical analysis that can be applied to pigmentation data. This work describes a new methodology that allows for the quantification of various aspects of the abdominal pigmentation pattern of adult D. melanogaster. The protocol includes specimen mounting, image capture, data extraction, and analysis. All the software used for image capture and analysis feature macros written for open-source image analysis. The advantage of this approach is the ability to precisely measure pigmentation traits using a methodology that is highly reproducible across different imaging systems. While the technique has been used to measure variation in the tergal pigmentation patterns of adult D. melanogaster, the methodology is flexible and broadly applicable to pigmentation patterns in myriad different organisms.

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

This work presents a method to quickly and precisely quantify the abdominal pigmentation of Drosophila melanogaster using digital image analysis. This method streamlines the procedures between phenotype acquisition and data analysis and includes specimen mounting, image acquisition, pixel value extraction, and trait measurement.

כימות פיגמנטציה בטן ב<em&gt; תסיסנית מלנוגאסטר</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

Genetics

Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. Their functionality critically depends on their specific organization within large and elaborate multisubunit transmembrane protein complexes. In order to understand at the molecular level how these complexes facilitate solar energy conversion, it is essential to understand protein-pigment, and pigment-pigment interactions, and their effect on excited dynamics. One way of gaining such understanding is by constructing and studying complexes of Chls with simple water-soluble recombinant proteins. However, incorporating the lipophilic Chls and BChls into water-soluble proteins is difficult. Moreover, there is no general method, which could be used for assembly of water-soluble proteins with hydrophobic pigments. Here, we demonstrate a simple and high throughput system based on water-in-oil emulsions, which enables assembly of water-soluble proteins with hydrophobic Chls. The new method was validated by assembling recombinant versions of the water-soluble chlorophyll binding protein of Brassicaceae plants (WSCP) with Chl a. We demonstrate the successful assembly of Chl a using crude lysates of WSCP expressing E. coli cell, which may be used for developing a genetic screen system for novel water-soluble Chl-binding proteins, and for studies of Chl-protein interactions and assembly processes.

This manuscript describes a simple and high-throughput method for assembling water-soluble proteins with hydrophobic pigments that is based on water-in-oil emulsions. We demonstrate the effectiveness of the method in the assembly of native chlorophylls with four variants of recombinant water-soluble-chlorophyll binding proteins (WSCPs) of Brassica plants expressed in E. coli.

המים אמולסיות שמן: מערכת חדשה להרכבת חלבונים מסיסים במים כלורופיל מחייב עם פיגמנטים הידרופובי

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. ...

Chemistry

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy transfer processes in the thylakoid membrane of chloroplasts. The light harvesting antenna of diatoms, the so called fucoxanthin chlorophyll a/c binding proteins (FCP), are required for the light absorption and efficient transfer to the photosynthetic reaction centers as well as for photo-protection from excessive light. The switch between these two functions is a long-standing matter of research. Many of these studies have been carried out with FCP in detergent micelles. For interaction studies, the detergents have been removed, which led to an unspecific aggregation of FCP complexes. In this approach, it is hard to discriminate between artifacts and physiologically relevant data. Hence, more valuable information about FCP and other membrane bound light harvesting complexes can be obtained by studying protein-protein interactions, energy transfer and other spectroscopic features if they are embedded in their native lipid environment. The main advantage is that liposomes have a defined size and a defined lipid/protein ratio by which the extent of FCP clustering is controlled. Further, changes in the pH and ion composition that regulate light harvesting in vivo can easily be simulated. In comparison to the thylakoid membrane, the liposomes are more homogenous and less complex, which makes it easier to obtain and understand spectroscopic data. The protocol describes the procedure of FCP isolation and purification, liposome preparation, and incorporation of FCP into liposomes with natural lipid composition. Results from a typical application are given and discussed.

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Here, we present a protocol to isolate fucoxanthin chlorophyll a/c binding proteins (FCP) from diatoms and incorporate them into liposomes with natural lipid compositions to study excitation energy transfer upon ion composition changes.

בידוד, שילוב אנטנות קציר-אור של צורניות Cyclotella Meneghiniana בתוך ליפוזומים עם שומנים תילקואיד

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

Biochemistry

Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) for Experimental Studies

Gelatinous zooplanktons play a crucial role in ocean ecosystems. However, it is generally difficult to investigate their physiology, growth, fecundity, and trophic interactions primarily due to methodological challenges, including the ability to culture them. This is particularly true for the doliolid, Dolioletta gegenbauri. D. gegenbauri commonly occurs in productive subtropical continental shelf systems worldwide, often at bloom concentrations capable of consuming a large fraction of daily primary production. In this study, we describe cultivation approaches for collecting, rearing, and maintaining D. gegenbauri for the purpose of conducting laboratory-based studies. D. gegenbauri and other doliolid species can be captured live using obliquely towed conical 202 &micro;m mesh plankton nets from a drifting ship. Cultures are most reliably established when water temperatures are below 21 &deg;C and are started from immature gonozooids, maturing phorozooids, and large nurses. Cultures can be maintained in rounded culture vessels on a slowly rotating plankton wheel and sustained on a diet of cultured algae in natural seawater for many generations. In addition to the ability to establish laboratory cultures of D. gegenbauri, we demonstrate that the collection condition, algae concentration, temperature, and exposure to naturally conditioned seawater are all critical to the culture establishment, growth, survival, and reproduction of D. gegenbauri.

Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri Uljanin 1884 for Experimental Studies

Doliolids, including the species Dolioletta gegenbauri, are small gelatinous marine zooplankton of ecological significance found on productive subcontinental shelf systems worldwide. The difficulty of culturing these delicate organisms limits their investigation. In this study, we describe cultivation approaches for collecting, rearing, and maintaining the doliolid Dolioletta gegenbauri.

הטיפוח-תרגול של החיל הימי ( uljanin 1884) למחקרים ניסיוניים

Gelatinous zooplanktons play a crucial role in ocean ecosystems. However, it is generally difficult to investigate their physiology, growth, fecundity, ...

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer segments (POS) can be performed in vitro. Photoreceptor outer segments with stacks of membranous discs containing the phototransduction machinery are continuously renewed in the retina. Spent POS are eliminated daily by RPE cells. Rodent, porcine/bovine and human RPE cells recognize POS from various species in a similar manner. To facilitate performing large series of experiments with little variability, a large stock of POS can be isolated from porcine eyes and stored frozen in aliquots. This protocol takes advantage of the characteristic of photopigments that display an orange color when kept in the dark. Under dim red light, retinae are collected in a buffer from opened eyecups cut in halves. The retinal cell suspension is homogenized, filtered and loaded onto a continuous sucrose gradient. After centrifugation, POS are located in a discrete band in the upper part of the gradient that has a characteristic orange color. POS are then collected, spun, resuspended sequentially in wash buffers, counted and aliquoted. POS obtained this way can be used for phagocytosis assays and analysis of protein activation, localization or interaction at various times after POS challenge. Alternatively, POS can be labeled with fluorophores, e.g., FITC, before aliquoting for subsequent fluorescence quantification of POS binding or engulfment. Other possible applications include the use of modified POS or POS challenge combined with stress conditions to study the effect of oxidative stress or aging on RPE cells.

This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 &#176;C.

טיהור בקנה מידה גדולה של מגזרי בשר חזירים או שור קולטי אור חיצוני למבחני phagocytosis על תאי הרשתית פיגמנט אפיתל

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

Immunology and Infection

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Studies concerning the role of the immune system in mediating molecular signaling between beneficial bacteria and their hosts have, in recent years, made significant contributions to our understanding of the co-evolution of eukaryotes with their microbiota. The symbiotic association between the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes and the bioluminescent bacterium Vibrio fischeri has been utilized as a model system for understanding the effects of beneficial bacteria on animal development. Recent studies have shown that macrophage-like hemocytes, the sole cellular component of the squid host's innate immune system, likely play an important role in mediating the establishment and maintenance of this association. This protocol will demonstrate how to obtain hemocytes from E. scolopes and then use these cells in bacterial binding assays. Adult squid are first anesthetized before hemolymph is collected by syringe from the main cephalic blood vessel. The host hemocytes, contained in the extracted hemolymph, are adhered to chambered glass coverslips and then exposed to green fluorescent protein-labeled symbiotic Vibrio fischeri and non-symbiotic Vibrio harveyi. The hemocytes are counterstained with a fluorescent dye (Cell Tracker Orange, Invitrogen) and then visualized using fluorescent microscopy.

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

This video will demonstrate how to obtain hemocytes (blood cells) from the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes for use in cell biological and bacterial adhesion assays. Hemocytes will be stained with a fluorescent dye and exposed to GFP-labeled bacteria.

קבלת Hemocytes מן הוואי Bobtail קלמארי Euprymna scolopes והתבוננות דבקותם חיידקים סימביוטיים שאינן הסימביוטי

Studies concerning the role of the immune system in mediating molecular signaling between beneficial bacteria and their hosts have, in recent years, made ...

Adsorptive Bioprocess Improves Yield of Melanin from Pseudomonas stutzeri

Melanins are natural pigments, and the presence of indole ring and numerous functional groups makes melanin an ideal choice for many applications such as UV protective agents, skincare, cosmetics etc. A marine Pseudomonas stutzeri produces melanin without the addition of tyrosine. The feedback inhibition was observed by melanin in the culture of a melanin-producing marine bacterium, Pseudomonas stutzeri. Melanin also demonstrated microbial growth inhibition. The Han-Levenspiel model-based analysis identified uncompetitive type product inhibition of melanin on the cell growth. Tyrosinase enzyme, which produces melanin, was inhibited by melanin. The double reciprocal plot of the enzymatic reaction in the presence of different melanin concentrations revealed uncompetitive product inhibition. An adsorbent-based adsorptive bioprocess was developed to reduce the feedback inhibition by melanin. Different adsorbents were screened to select the best adsorbent for melanin adsorption. Dosage amount and time were optimized to develop the adsorptive bioprocess, which resulted in an 8.8-fold enhancement in melanin production by the marine bacteria Pseudomonas stutzeri (153 mg/L to 1349 mg/L) without supplementation of tyrosine and yeast extract.

<meta charset="utf8"></head><body>תהליך ביולוגי סופח משפר את תפוקת המלנין מ-Pseudomonas stutzeri

Here we present a protocol on adsorptive bioprocess to produce a biological product, especially a pigment that inhibits its own biosynthesis and inhibits the growth of the microorganism that produces it.

תהליך ביולוגי סופח משפר את תפוקת המלנין מ-Pseudomonas stutzeri

Melanins are natural pigments, and the presence of indole ring and numerous functional groups makes melanin an ideal choice for many applications such as ...

Engineering

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls and carotenoids. In vivo, these proteins are folded with pigments to form complexes which are inserted in the thylakoid membrane of the chloroplast. The high similarity in the chemical and physical properties of the members of the family, together with the fact that they can easily lose pigments during isolation, makes their purification in a native state challenging. An alternative approach to obtain homogeneous preparations of LHCs was developed by Plumley and Schmidt in 19871, who showed that it was possible to reconstitute these complexes in vitro starting from purified pigments and unfolded apoproteins, resulting in complexes with properties very similar to that of native complexes. This opened the way to the use of bacterial expressed recombinant proteins for in vitro reconstitution. The reconstitution method is powerful for various reasons: (1) pure preparations of individual complexes can be obtained, (2) pigment composition can be controlled to assess their contribution to structure and function, (3) recombinant proteins can be mutated to study the functional role of the individual residues (e.g., pigment binding sites) or protein domain (e.g., protein-protein interaction, folding). This method has been optimized in several laboratories and applied to most of the light-harvesting complexes. The protocol described here details the method of reconstituting light-harvesting complexes in vitro currently used in our laboratory, and examples describing applications of the method are provided.

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

במבחנת כינונה מחדש של מכלולי אור קציר של צמחים ואצות ירוקות

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

שיטה לחילוץ פיגמנטים מן קלמארי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מעבדה מבדק-האכלת דגים לבחינת פעילות Antipredatory של משני מטבוליטים מהרקמות של אורגניזמים ימיים

כימות פיגמנטציה בטן ב

המים אמולסיות שמן: מערכת חדשה להרכבת חלבונים מסיסים במים כלורופיל מחייב עם פיגמנטים הידרופובי

בידוד, שילוב אנטנות קציר-אור של צורניות Cyclotella Meneghiniana בתוך ליפוזומים עם שומנים תילקואיד

הטיפוח-תרגול של החיל הימי ( uljanin 1884) למחקרים ניסיוניים

טיהור בקנה מידה גדולה של מגזרי בשר חזירים או שור קולטי אור חיצוני למבחני phagocytosis על תאי הרשתית פיגמנט אפיתל

קבלת Hemocytes מן הוואי Bobtail קלמארי Euprymna scolopes והתבוננות דבקותם חיידקים סימביוטיים שאינן הסימביוטי

תהליך ביולוגי סופח משפר את תפוקת המלנין מ-Pseudomonas stutzeri

תהליך ביולוגי סופח משפר את תפוקת המלנין מ-Pseudomonas stutzeri

במבחנת כינונה מחדש של מכלולי אור קציר של צמחים ואצות ירוקות