ניתוח מטבוליזם התא של גזע המטפאות

שינויים מטבוליים בגזע hematopoietic ותאי אביהם מאפשרים להם לעבור מהמדינה ההפוגה שלהם למצב התברואה כדי לקיים את הדרישות של היווצרות הדם. שינוי בפלסטיות מטבולית של גזע hematopoietic ותאי צאצא מוביל להפרעות המטולוגיות. הפרוטוקול שלנו יעזור למדוד את הרגולציה המטבולית ואת הבריאות של גזע hematopoietic ותאי ההמה במהלך התפתחות הדם ומחלות.

ניתוח של הנשימה המיטוכונדרית וגליקוליזה של גזע hematopoietic ותאי הצאצא קשה כפי שהם אוכלוסייה שברירית ונדירה. הפרוטוקול האופטימי שלנו מאפשר בידוד של כמות גבוהה יותר של תאי גזע וצאצאים מהמורין עצם, משפר את הכדאיות שלהם במהלך הדגירה, מקל על ניתוח שטף חוץ-תאי של HSPCs שאינם חסידים, ומספק פרמטרי הזרקה אופטימליים לתרופות המכוונות לזרחון חמצוני כמו גם מסלולים גליקוליטיים. כדי להתחיל בהליך זה, למלא את הבארים של צלחת השירות ואת התאים סביב הבארים עם מים סטריליים.

להטביע את מחסנית החיישן לתוך לוח השירות לוודא כי החיישנים מכוסים לחלוטין על ידי מים. לאחר מכן מניחים את המחסנית שקועה בצלחת השירות באינקובטור שאינו CO2 ב 37 מעלות צלזיוס כדי להדגור בן לילה. בארונות biosafety מסוג II, הוסיפו 40 מיקרוליטרים של פתרון מסחרי זמין של 0.1%PLL לכל באר של צלחת ההתמדה.

מכסים את צלחת ההסגר עם המכסה המסופק בערכה ודורגים את הצלחת הסגורה בטמפרטורת החדר מתחת למכסה המנוע במשך שעה. לאחר מכן, השתמשו בהשראה סטרילית המבוססת על ואקום כדי להסיר את הפתרון העודף ולייבש את הצלחת מתחת למכסה המנוע. כדי לקצור תאי מח עצם מורין מונונוקלציה, להוסיף חמישה מיליליטר של בינוני שיפוע צפיפות לצינור חרוט 15 מיליליטר.

לאט להוסיף חמישה מיליליטר של המתלה תא מח העצם לוודא כי התאים נשארים כשכבה מעל המדיום שיפוע צפיפות. צנטריפוגה ב 500 פעמים g ו בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות לוודא כי הצנטריפוגה היא ההאצה הנמוכה ביותר האפשרית. לקצור את הממשק האמצעי של תאים mononucleated לתוך צינור טרי 15 מיליליטר.

לאחר מכן לשטוף את התאים עם חמישה מיליליטר של PBS 1X המכיל 2%FBS. צנטריפוגה ב 500 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. הסר את העל-טבעי ולחץ מחדש על התאים ב- 300 מיקרוליטרים של PBS 1X המכילים 2%FBS.

לאחר מכן, aliquot 10 microliters של ההשעיה התא עבור שליטה לא מוכתמת או חד-צבעית בצינור FACS. כדי לקצור LSK HSPCs מתאים חד-גרעיניים של מח עצם מורין, הוסיפו 15 מיקרוליטרים של קוקטייל נוגדנים ביוטין ל-300 מיקרוליטרים של תאי מח עצם חד-גרעיניים. כדי לקצור LSK HSPCs מתאים חד-גרעיניים של מח עצם מורין, הוסיפו 15 מיקרוליטרים של קוקטייל נוגדנים ביוטין ל-300 מיקרוליטרים של תאי מח עצם חד-גרעיניים.

מניחים את הצינורות בדלי קרח ממוקם על שייקר במקרר כדי דגירה בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה במשך 30 דקות. לאחר מכן הוסיפו 10 מיליליטר של PBS 1X מקורר מראש המכיל 2%FBS לתאים. צנטריפוגה ב 500 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.

השלך את העל-טבעי ולחץ מחדש על גלולת התא ב-400 מיקרוליטרים של 1X PBS המכילים 2%FBS. בקצרה מערבולת microbeads אנטי ביוטין לפני השימוש. מוסיפים 80 מיקרולייטרים של המיקרוביאדים לכל דגימה ומערבבים היטב.

דגירה במשך 20 דקות נוספות בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה. לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של PBS מקורר מראש המכיל 2%FBS לתאים. צנטריפוגה הצינור ב 500 פעמים g ו בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.

השלך את העל-טבעי ולחץ מחדש על גלולת התא במיליליטר אחד של PBS המכיל 2%FBS. אחסן את מתלי התא בארבע מעלות צלזיוס בעת הגדרת יחידת ההפרדה המגנטית. מקם את העמודה בשדה מגנטי עבור מפריד מיון התאים בסיוע מגנטי בארבע מעלות צלזיוס.

הכן את העמודה להפרדה מגנטית על ידי שטיפתה בשלושה מיליליטר של PBS 1X המכיל 2% FBS תחת זרימת כבידה בארבע מעלות צלזיוס. מוסיפים את מתלי התא לעמודה הרטובה מראש בארבע מעלות צלזיוס. אפשר לכל התאים לעבור דרך העמוד בארבע מעלות צלזיוס ולאסוף את הצלם בצינור חרוט 15 מיליליטר.

לאחר מכן, לשטוף את העמוד עם שלושה מיליליטר של 1X PBS ו 2% FBS בארבע מעלות צלזיוס. חזור על שטיפה זו שלוש פעמים. לאסוף את הזרימה דרך ולשמור אותו בארבע מעלות צלזיוס.

צנטריפוגה הצינור חרוט המכיל את הזרימה דרך ב 500 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והעבר את התאים ב- 0.5 מיליליטר של 1X PBS עם 2%FBS והעבר את ההשעיה לצינור FACS. לאחר מכן הוסיפו 24 מיקרוליטרים של קוקטייל הנוגדנים LSK לכל 10 מיליון תאים.

מכסים את הצינור בנייר כסף ודגירה בחושך בארבע מעלות צלזיוס בתסיסה במשך שעה. לאחר מכן, הוסף שלושה מיליליטר של PBS 1X עם 2%FBS לצינור FACS. צנטריפוגה ב 500 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.

השלך את העל-טבעי ולחץ מחדש על התאים המסומן בנוגדנים במיליליטר אחד של 1X PBS המכיל 2%FBS. רגע לפני המיון, מוסיפים מיקרוליטר אחד של מיליגרם אחד למיליליטר פרופידיום יודיד לתליית התא ולהשתמש מסננת 40 מיקרומטר כדי לסנן את התוכן של צינור FACS. ראשית, צנטריפוגה תאים LSK שנאספו ב 500 פעמים g ו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.

השלך את העל-טבעי ולחץ מחדש על התאים במדיה מלאה לריכוז סופי של לפחות 70,000 תאים לכל 40 מיקרוליטרים. זרעים 40 microliters של ההשעיה תא זה לתוך הבארים של צלחת מצופה 8 בארות הקפדה להשאיר את כל בארות הפינה ריקות. צנטריפוגה הצלחת ב 450 פעמים g ו בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת.

השתמש במיקרוסקופ הפוך כדי להבטיח שהתאים מחוברים לתחתית בארות. לאחר מכן, להוסיף 135 microliters של מדיה מלאה לתאים בכל באר להביא את הנפח הסופי של כל באר ל 175 microliters. הוסף 175 מיקרוליטרים של מדיה מלאה לשתי הפינות של הלוח כריק.

דגירה התאים באינקובטור שאינו CO2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. לאחר מכן הגדר תוכנית עבור המנתח כדי להוסיף תרופות לכל באר של הלוח כפי שמתואר בטבלה 2 וטבלה שלוש של פרוטוקול הטקסט. לבדיקת הלחץ המיטוכונדריאלי, אחזר את מחסנית החיישן בצלחת השירות מהחמה כך שלכל באר יש ריכוז סופי של שני אוליגומיצין מיקרומולרי, 1.5 מיקרומולרי FCCP ו- 0.5 מיקרומולר של רוטנונה ואנטי מיצין A לפי הצורך.

הסר את המכסה ממחסנית החיישן והצב אותו על מגש המכשיר. התחל את תהליך הכיול שייקח 20 דקות. לאחר השלמת הכיול, הסר את לוחית השירות והחליף אותה בצלחת ההתקלה המכילה את תאי LSK.

לחץ על המשך כדי להפעיל את התוכנית הקודמת שנקבעה. לאחר השלמת התוכנית, אחזר את הנתונים ונתח אותם. במחקר זה, כמות מקסימלית של HSPCs LSK מורין קיימא מבודדים חילוף החומרים גליקוליזה המיטוכונדריאלי שלהם נמדד עם מנתח שטף חוץ תאיים.

למרות ניתוח שטף חוץ תאי משמש באופן מסורתי עבור תאים חסידים, שיטה זו עושה LSK HSPCs דבק בארות מצופה PLL המאפשר מדידה של שטף חוץ תאי ובכך בריאות מטבולית של LSK HSPCs. על מנת למדוד את הנשימה המיטוכונדרית באמצעות קצב צריכת החמצן וגליקוליזה באמצעות שיעור החומציות החוץ תאית בתנאי בסיס ומתח, תרופות המפריעות לגליקוליזה ולנשימה מיטוכונדרית מוזרקים ברצף. כצפוי, הרמה הבסיסית של שיעור החומציות החוץ-תאית גבוהה יותר עבור LSK HSPCs בתרבות של גלוקוז ופירובט מדיה חיובית בהשוואה לאלה שתורבת במדיה שלילית.

הזריקה עם גלוקוז לא לשנות את שיעור חומציות חוץ תאית עבור התאים מתורבתים בתקשורת חיובית, אבל זה הגביר את גליקוליזה של תאים במדיה שלילית. עם זאת, הרמה הבסיסית של תאים אלה עדיין נותרה נמוכה יותר בקבוצה החיובית. הזריקה עם אוליגומיצין הפעילה את הגליקוליסיס ברמתו המרבית בקבוצה החיובית, אך לא השפיעה על הקבוצה השלילית.

ההזרקה עם אנלוגי הגלוקוז ב-2-DG החזירה את קצב החומציות החוץ-תאי לרמות שאינן גליקוליטיות. לבדיקת הלחץ המיטוכונדריאלי, הזריקה של אוליגומיצין היפרפולרית הממברנה המיטוכונדרית מונעת שאיבת פרוטון יותר דרך קומפלקסים ETC ובכך להפחית את קצב הנשימה המיטוכונדרית. הזרקת FCCP דוחפת את שיעור צריכת החמצן למקסימום כאשר תאים מנסים לשחזר את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית.

הזריקה עם שני מעכבי שרשרת הובלת אלקטרונים אחרים גורמת לנשימה המיטוכונדרית להפסיק לחלוטין ובכך קצב צריכת החמצן חזר לרמתו המינימלית. נא הימנע משימוש במאגר תותים של תא אדום לבידוד התא המונונוקליארי. אנו ממליצים על הפרדת מעבר צבע Ficoll כדי למנוע היווצרות גוש ולהפחית את אובדן LSK.

באמצעות השיטה האופטימלית שלנו, אנו יכולים למדוד נשימה מיטוכונדרית וגליקוליזה של גזע hematopoietic נדיר ושברירי ותאי הצאצאים וחקר רמזים מטבוליים לווסת hematopoiesis נורמלי וממאאיר.