שיטה זו מאפשרת קביעת חילוף החומרים הטבעי של התא הרוצח. פרמטר מרכזי בהפעלה על ידי מדידת צריכת חמצן ושינויי pH במדיום החוץ-תאי. היתרון של מנתח השטף החוץ תאי הוא שהוא אוטומטי לחלוטין ומ מסוגל לבדוק עד 92 דגימות בזמן אמת עם כמויות נמוכות של תאים.
ובכך מאפשר מסכי תפוקה גבוהה. שיטה תקפה כדי לקבוע גליקוליזה ונשימה בתאים inky חשוב מאוד במרפאה. מאז יש מחלות רבות כולל השמנת יתר וסרטן שבו חילוף החומרים של תאים inky לקוי.
התחל על ידי צינורות 20 מיליליטר של מדיום הפרדת לימפוציטים לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר. תוך שמירה על הצינור בזווית של 30 מעלות, בעדינות pipette 20 מיליליטר של דם על המדיום. יצירת ממשק גלוי ומוגדר היטב בין שני הנוזלים.
צנטריפוגה את הצינורות במשך 25 דקות ב 1000 פעמים G. ואז בזהירות לקחת את הצינורות מתוך הצנטריפוגה ולה למקם אותם במדף. בדוק את נוכחותה של שכבה בולטת של תאים בממשק בין LSM ופלזמה. שאף בעדינות את שכבת התא המונונוקלרית עם פיפטה פלסטיק 10 מיליליטר והצב אותה בצינור חרוט חדש של 50 מיליליטר.
לשטוף את התאים mononuclear פעמיים עם 45 מיליליטר של PBS. וצנטריפוגה אותם ב 800 פעמים G במשך חמש דקות. כדי לבודד את התאים הרוצח הטבעי או engaves, לספור את התפרים PVM ולתלות אותם מחדש במאגר הפרדת NK באחת פעמים 10 לתאים השמיניים למיליליטר.
ואז להעביר 10 מיליליטר של ההשעיה התא לתוך צינור חדש 50 מיליליטר. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של תערובת נוגדנים לבידוד תאי NK. ו-10 מיקרוליטרים של אנטי-CD שלושה נוגדני בידוד חיוביים מתערבבים למחשבים האישיים.
ולהדרור אותם בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. מערבולת חרוזים מגנטיים ולהוסיף מיליליטר אחד PBMCs ונוגדנים. לאחר מכן הדגירה MIGS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב מדי פעם.
מוסיפים 35 מיליליטר של חיץ בידוד NK ומ מניחים את הצינור על המגנט במשך 15 דקות. בזהירות לאסוף את supernatant עם פיפטה פלסטיק 50 מיליליטר מבלי לגעת בצדדים או בתחתית הצינור. לספור את התאים צנטריפוגה אותם ב 800 פעמים G במשך חמש דקות.
כדי לעורר את תאי ה-NK במעבר מסיס 15, יש להשתמש מחדש ב-750,000 תאים ב-100 מיקרוליטרים של IMDM המכילים 10%HS באר של 96 צלחות באר. לדלל את המעבר האנושי 15 כדי מיקרוגרם אחד למיליליטר ב IMDM ו 10% HS. ולהוסיף 100 מיקרוליטרים של המעבר האנושי המדולל 15 לתאים.
לתקן דגימת בקרה עם תאים לא גירויים ולמקם את שתי הדגימות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. לעורר את התאים במשך 48 שעות ולאחר מכן לבצע את בדיקת שטף חוץ תאית. יום לפני הניסוי, הפעל את המנתח ולתת לו להתחמם עד 37 מעלות צלזיוס.
פתח את חבילת מחסנית הצנזורה והפרד את המחסנית מצלחת השירות. לאחר מכן להוסיף 200 microliters של הפתרון כיול לכל באר של צלחת השירות. ותחזרו את המחסנית המרכזית לוודא שהחיישנים שקועים לגמרי.
לתוצאות מיטביות חמוסים את המחסנית למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור ללא פחמן דו חמצני. אשר לח כראוי. כדי להכין להב מצופה דבק, פיפטה 25 microliters של פתרון דבק התא לכל באר של הצלחת.
ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. לאחר מכן להסיר את הפתרון ולשטוף את הצלחת פעמיים עם 200 microliters של מים סטריליים לכל באר. שמור את הצלחת פתוחה במשך 15 דקות בתוך מכסה המנוע של תרבות התא כדי לאפשר ל בארות להתייבש.
צנטריפוגה תאי NK מבודדים בעבר להוסיף 200 פעמים G במשך חמש דקות. לאחר מכן להסיר על טבעי ולשטוף את התאים במבחן מתח מיטוכונדריאלי מחומם בינוני או בדיקת מתח גליקוליזה בינוני. גלולה את התאים שוב resuspend אותם לריכוז התא המועדף באותו מדיום.
הנח 180 מיקרוליטרים של מתלי תאים לתוך צלחת ההתלה. השתמש בארות אחד, A 12 H אחד ו H 12 כמו בארות בקרה לתיקון רקע. הוספת 180 מיקרוליטרים של מדיום ההתמדה לאילת וולס אלה חוממת את הצלחת במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור ללא פחמן דו חמצני.
צנטריפוגה הצלחת ב 200 פעמים G במשך חמש דקות. ואז להתבונן בתאים מתחת למיקרוסקופ כדי לבדוק שהם יוצרים שכבת מנו בתחתית האגם. דגירה התאים לעוד 25 דקות.
פתרונות עבודה חמים ל-37 מעלות צלזיוס. ולהסתגל pH שלהם ל7.4 במידת הצורך. טען את התרכובות שהוכנו בעבר לבדיקת מאמץ מיטוכונדריאלי או לבדיקת מאמץ גליקוליזה ללוחות A, B ו- C של מחסנית הצנזורה hydrated לשים את מחסנית הצנזורה טעון בחזרה באינקובטור בעת הגדרת התוכנית.
כדי להגדיר את פרוטוקול בדיקת השטף החוץ-תאי, פתח את התוכנה ולהשתמש בהגדרות הקבוצה כדי להגדיר את תנאי הקדם-טיפול. השתמש בכרטיסיה מפת לוח כדי לציין את קבוצות בארות בעלי תנאים דומים גם לציין את תיקון הרקע בארות ריקות. לאחר מכן הגדר את התוכנית בכרטיסיה פרוטוקולים.
הפעל את התוכנית והצב את מחסנית החיישן ואת לוחית השירות על המגש. לאחר שלב הכיול, החלף את לוח הכיול של לוחית ההתדגם בתאים המחוברים. לאחר השלמת הריצה, אחזר את הנתונים ונתח אותם.
על מנת להעריך את הטוהר ואת הכדאיות של תאי NK. קטן אלק ווטס מן התפרים PVM ואת אוכלוסיית תאי NK מבודדים היו מוכתמים ונותחו על ידי ציטומטריה זרימה. הטוהר של אוכלוסיית תאי NK נקבע על ידי שהייה כפולה מול CD 3 ו- CD 56 או NKP 46.
הרבה שיעור צריכת חמצן מיטוכונדריאלי עבור תאי NK האנושיים מוצגים כאן. כצפוי, מספרי התאים שלי הציגו ערכי זיהוי תווים אופטי (OCR) גבוהים יותר. מספרי תאים גם בקורלציה ליניארית עם כמות ה- DNA או החלבון הבאר.
מצד שני, מספרי תאים גבוהים יותר לא היו אופטימליים. כי עם תוספת של DNP, ריכוז החמצן הבאר היה מדולדל לחלוטין בכל מחזור. מה שמנע את החישוב המדויק של זיהוי תווים אופטי (OCR).
בתאי NK אנושיים, 100 DNP micromolar נמצאה להיות המינון האופטימלי. ניסוי מבחן מתח מיטוכונדריאלי טיפוסי עם 750, 000 תאי NK ל הבאר מוצג כאן. במבחן זה אוליגומיצין מוביל לירידה דרמטית בצריכת החמצן.
וגידול ב-ECAR. המייצג מעבר לגליקוליזה ומאמץ לשמור על רמות ATP תאיות. הפעלת תאי ה-NK במעבר 15 גרמה לעלייה הן בצריכת החמצן המיטוכונדריאלי והן בחומציות חוץ-תאית.
הנשימה הבסיסית המקסימלית וה-ATP מקושרת גדלה אך לא דליפת פרוטון או נשימה לא מיטוכונדרית. יתר על כן, שיעור OCR / ECA ירד המציין מעבר לחילוף חומרים גליקוליטי לאחר גירוי IL 15. בעת ביצוע פרוטוקול זה, חשוב מאוד להשיג אוכלוסיית תאים טהורה ובריאה כדי לקבוע את מספר התא האופטימלי כדי titrate את הריכוז של uncablers.
