פרויקט זה מומן על ידי תרומות של סינגפור משרד החינוך (משרד החינוך, מספר מענק 2013-T2-2-126) והמכון הלאומי לבריאות, ארה&quot;ב (NIH, להעניק מספר 1R21AT008452-01A1). TY קיבל מלגה לתואר שני מהמחלקה NUS של מדעי הביולוגיה. אנו מודים יחידת confocal של מרכז NUS למדעי bioimaging (CBIS) בתמיכה המתמשכת שלהם.

כל הניסויים בוצעו בהתאם טיפול בבעלי חיים מוסדיים אישרה ועדת שימוש (IACUC) פרוטוקולים של האוניברסיטה הלאומית של סינגפור (R14-293). 1. בעלי דגים ואת האוסף של עובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרי WT, ctsk: 24 nlGFP, RANKL: HSE: CFP 24, ו OSX: mCherry 21 דגים יחידים או תרכובת מהונדסת medaka ב 26 מעלות צלזיוס מתחת מחזור אור מבוקר (14 שעות אור, 10 שעות חושכות) כדי לגרום השרצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השרצה יומית מתקיימת במהלך 30 הדקות הראשונות אחרי האור דולק. הביצים נדבקות זה לזה באמצעות חוטים לצרף את הבטן של הנקבה במשך כמה שעות. השתמש נטו בסדר-מרושת לתפוס מבוגר נקבה נושאת אשכול ביצה. תנו דגים למנוחה קצרה ברשת ולאחר מכן לעסות בעדינות את הבטן של הדג להתפשט באשכול הביצית המופרית בזהירות מהבטן של הנקבה. הערה: נקבת medaka בריאהיכול לייצר 10 - 20 ביצים כל יום במשך כ 5 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הביצים לתוך צלחת פטרי פלסטיק 60 מ&quot;מ. השתמש פיפטה פלסטיק לשטוף את העוברים עם 5 - 10 הפתרון של מ&quot;ל של 0.3x Danieau (בינוני דגים; 19.3 מ&quot;מ NaCl, 0.23 KCl מ&quot;מ, 0.13 מ&quot;מ MgSO 4, 0.2 מ&quot;מ Ca (NO 3) 2, ו -1.7 מ&quot;מ HEPES, pH 7.0). הוסף 1 מ&quot;ל של% 0.25 (w / v) פתרון המניות מתילן כחול ל -2.5 ליטר של המדיום דגים כדי למנוע את צמיחת הפטריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לגלגל אשכול ביצה כדי ליצור קשר של חוטים מצורפים. שימוש במלקחיים כדי להסיר החוטים המצורפים בקפידה מתוך אשכולות ביצית המופרים להשיג עובר בודד (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לביים את העוברים על פי Iwamatsu 2004 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות 20 - 30 עובר לכל 60 מ&quot;מ פלסטיק צלחת פטרי C חממת 28 °. שינוי המדיום יומי על מנת להבטיח התפתחות תקינה של העוברים. הערה: בפעם סביב הבמה הבקיעה (8 - 9 D postfertilization,DPF) הוא קריטי במיוחד עבור הישרדות. הסר chorions &quot;פנויות&quot; לשמור המדיום נקי כדי להבטיח שיעורי הישרדות זחל טובים. </li></ol> 2. הקרנת עובר טרנסגניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סטראו מצויד מנורה כספית עבור דימות פלואורסצנטי ו- GFP, RFP, ומסנני CFP להקרין עוברים מהונדסים לביטוי כתב ניאון באמצעות גדלת 40X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראייה לזהות OSX: עוברים mCherry על ידי ביטוי הכתב mCherry בתחילת שנות יוצרי עצמות הגולגולת, כגון cleithrum, משני צידי הראש האחורי (איור 1 ב &#39;, חץ), ואת parasphenoid, במיקום מרכזי הגולגולת הגחון ( איור 1 ב &#39;, ראש חץ). הערה: הביטוי Reporter מתחיל מ 5 DPF ואילך 21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה ctsk: עוברים nlGFP ידי ביטוי nlGFP חזק בראש (איור 1 ג, חץ) וזנב (איור 1 ג, ראש חץ), החל6 DPF. הערה: osteoclasts אנדוגני מהווה רק לאחר 21 DPF. nlGFP להביע תאים בשלב מוקדם זה (6 DPF) אינם osteoclasts אבל אחרים, עד כה uncharacterized, ctsk תאים -positive 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה RANKL: HSE: עוברים מהונדס CFP ידי ביטוי CFP בכל מקום אחרי טיפול הלם חום קצר במשך 20 דקות ב 39 מעלות צלזיוס, שנערך ב -2 DPF או במאוחר למטרות ההקרנה. הערה: transgenes RANKL ו CFP נמצא בשליטתו של אותו יסוד הלם החום דו-כיוונית (HSE). ביטוי CFP מציין 24 אינדוקציה RANKL מוצלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 1.5 - טיפול בהלם חום 2 שעות ב 9 DPF או במאוחר לגרום למספר גדול של osteoclasts חוץ רחמי באזור תא המטען, אשר כתוצאה מכך גורמת פנוטיפ אוסטאופורוזיס דמוי 24. הערה: הביטוי RANKL טרנסגניים מושרה 9 תוצאות DPF ב מהפעלה אקטופי של ובתאים osteoclast רדומים, אשר באופן אנדוגני אינה מופעלתלפני 21 DPF. השתמש באמבט מים כדי להשיג תנאי 39 ° C יציבים. תנו עוברים Medaka צלחת פטרי המכילה לצוף על פני המים. ודאו המכסה של צלחת פטרי יבש כדי למנוע טביעתה של המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים מסך מקווי המתחם, כגון RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP פעמיים מהונדס ו OSX: mCherry / RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP משולשת מהונדס, על פי דפוס הביטוי של כל transgene הפרט. הערה: Hemizygous ו הומוזיגוטים עובר מהונדס התאפיינו רמות קרינה שונות של transgene הכתב. עובר הומוזיגוטים הייתה עוצמת קרינה כי הייתה כ הוכפלה בהשוואה לזו של transgenics hemizygous. קווי מתחם שהיו הומוזיגוטים הן RANKL: HSE: CFP ו ctsk: nlGFP התקבלו על ידי incrossing חזר במשך כמה דורות. עבור OSX משולשת מהונדס: mCherry / RANKL: HSE: CFP / ctsk: דגים nlGFP,<html> RANKL הומוזיגוטים: HSE: CFP / ctsk: דגי nlGFP היו שלובים עם OSX הומוזיגוטים: ספקי mCherry. הצאצאים הטרוזיגוטיים משולש המהונדס וכתוצאה מכך הועלו incrossed להשיג עוברי הומוזיגוטים RANKL: HSE: CFP. RANKL: HSE: transgene CFP חייב להיות הומוזיגוטים על מנת לקבל האינדוקציה היעילה של osteoclasts חוץ הרחמים. </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55025/55025fig1.jpg" /> איור 1: WT ו מהונדס Medaka עוברים ב -7 D Postfertilization (DPF). א. עובר WT ציין עם תאורת brightfield. B. עוברים מהונדס מראה OSX: ביטוי mCherry ברחבי cleithrum (חץ) parasphenoid (ראש חץ). ג. עוברים מהונדס מראה ctsk: ביטוי nlGFP בראש (חץ) והזנב (ראש חץ). ברי סולם: 500 מיקרומטר.025 / 55025fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 3. טיפול Bisphosphonate של Medaka הזחלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות המכילים ריכוזים שונים של ביספוספונטים (BPS) ללימודי מנה-תגובה. הערה: BP למופת להשתמש בפרוטוקול זה הוא alendronate. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים alendronate במדיום דגים בריכוז של 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​להכין פתרון המניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במיקסר מערבולת כדי להבטיח פירוק מוחלט. אחסן את הפתרון המניה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות עבודה שונים על ידי דילול פתרון המניות עם מדיום דגים לסדרה של ריכוזים (כלומר, 25, 37.5, 50, 62.5, ו -75 מיקרוגרם / מיליליטר). הערה: סמים שונים עשויים להיות קליטים שונים, הפצה, מטבוליזם, והפרשה (ADME) פרמטרים, אשר יש לקחת בחשבון בעת ​​בדיקת שימוש זה medaka זחלי מערכת. כמו כן, מסיסות ויציבות תרופה עשויות להשתנות כאשרמיושם כמו בתמיסה מימית. פחות תרכובות מסיסים במים ייתכן שיהיה צורך מומס הראשון בממסים אורגניים, כגון DMSO. במקרה זה, פתרון המניות מוכן ב DMSO, אשר לאחר מכן הוא מדולל יותר במדיום דגים. ראוי לציין, כי פתרונות קידוח במים (בינוני דגים) ניתן לאחסן במקרר למשך כמה wk. עם זאת, פתרונות המכיל DMSO חייב להיות מאוחסן על RT כדי למנוע התגבשות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת זחלים medaka לתוך צלחות שש היטב (שישה הזחלים / טוב) עבור עוקבות BP (alendronate) טיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני הדג בזהירות בעזרת פיפטה פלסטיק נקי להוסיף נפח קטן (כ. 0.5 מ&quot;ל) של פתרון alendronate היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע בינוני דגים שאריות, כפתרון הוסיף BP יכול להיות מדולל, אשר היא קריטית במיוחד עבור פתרונות alendronate פחות מרוכז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר נפח קטן של פתרון alendronate (עד 0.5 מ&quot;ל) מבאר כל עם טפטפת פלסטיק נקי ולהחליפה volu גדוללי (4 מ&quot;ל) של פתרון alendronate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה בינונית מדי יום כדי להבטיח התפתחות עוברים נורמלית. </li></ol> 4. מכתים חיה של מטריקס עצם Mineralized <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 0.5 גרם של Alizarin complexone (ALC; Alizarin-3-methyliminodiacetic חומצה) או 0.05 גרם של calcein ב 50 מ&quot;ל של מדיום דגים להכין 1% ו -0.1% פתרונות המניות, בהתאמה. במיקסר מערבולת כדי להבטיח פירוק מוחלט. הערה: בינוני דגים ללא תוספת של מתילן כחול משמשת זה ואת הצעדים הבאים כדי להפחית autofluorescence ב הזחלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במסנן מזרק לשימוש חד-פעמי (0.2 מיקרומטר) כדי לסנן את הפתרון מכתים. אחסן את הפתרון המסונן בחושך ב RT. הערה: הצבע של מסונן, ברור הפתרון מכתים ALC הוא צהוב כהה לכתום. הצבע של פתרון calcein המסונן, הברור הוא צהוב בהיר. פתרונות ניתן להשתמש במשך מספר חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את מניות ALC או calcein מסונן פתרון 1:10 ב בינוני דגיםדגירת זחלי medaka עבור 1.5 - 2 h (0.1% פתרון ALC) או 2 - 2.5 שעות (פתרון 0.01% calcein) באינקובטור 28 ° C אם זחלים בין 9 ו -17 DPF משמשים. שמור את הדגימות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הזחלים עד בינוני דגים טריים בעזרת פיפטה פלסטיק נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני דגים עם טפטפת פלסטיק נקי ולהוסיף בינוני דגים טריים. חזור על פעולה זו במשך 3 - 4 פעמים עד אין פתרון אדום או צהוב מוכתם (ALC או calcein, בהתאמה) שנשאר. השאירו את הזחלים במדיום דגים עבור 30 - 60 דקות לפני מקבע אותם הדמיה להימנע epifluorescence מהמדיום. הערה: 0.1% פתרון מכתים ALC מזיק הזחלים medaka לזמנים בחשיפה ממושכת. פעמים הדגירה של יותר מ -2 h להשפיע על ההישרדות של הזחלים. ריכוז וזמן מכתים ולכן צריכים להיות מותאם במיוחד בשלבים שונים על מנת להשיג תוצאות הישרדות מכתים עובר אופטימליות. </li></ol> 5. דימות פלואורסצנטי חי </<html> p&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את הזחלים medaka עם 0.01% Tricaine (אתיל methanesulfonate 3-aminobenzoate) במדיום דגים. הערה: מורדמים הזחלים להיות משותק לאחר 5 - 10 דקות בתמיסה Tricaine ובדרך כלל משקרים או על צדם או גבם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש microloader פלסטיק להתמצא הזחלים בהתאם לאזור של עניין. האוריינטציה של הזחלים להשתמש בפרוטוקול זה הוא לרוחב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש stereomicroscope עם תאורה פלואורסצנטי הדמיה. השתמש בהגדלה גדולה כאשר לוקח תמונות, התמקדות בחלקים שונים של הזחלים (הראש, גזע קדמי, מטען אחורי, וזנב). וסטיץ &#39;תמונות בודדות יחד אזורים חופפים באמצעות תוכנת עיבוד תמונה מתאימה (ריבועים באיור 3G). הערה: פעולה זו מסייעת לשפר את איכות התמונה של כל חלקי הגוף הרלוונטיים במישור הנכון המוקדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את הזחלים למדיום הדגים להתאוששות לאחר ההדמיה. </li></ol>tle &quot;&gt; 6. חיים הדמיה Confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את הזחלים עם 0.01% Tricaine במדיום דגים עבור 5 - 10 דקות עד שהם נעשים משותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים נמוכה ההיתוך agarose 1.5% בטווח הבינוני דגים על ידי חימום במיקרוגל. מגניב פתרון זה כ -30 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 - 1 מ&quot;ל של-התכה נמוכה נוזלי 1.5% agarose במדיום דגים בצלחת פטרי עם רצפת זכוכית. מעביר את הזחלים הרדימו לתוך התמיסה בעזרת פיפטה פלסטיק נקיה. הערה: קח זהירות מיוחדת כי הטמפרטורה של agarose ההתכה נמוכה הנוזלי היא נמוכה מספיק כדי לא לפגוע הזחלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני agarose מתמצק, להשתמש microloader פלסטיק לדחוף את הזחלים אל החלק התחתון של צלחת פטרי להתמצא הזחלים בהתאם לאזור של עניין. האוריינטציה של הזחלים להשתמש בפרוטוקול זה הוא לרוחב. הערה: הדגימות מוכנות הדמית confocal לחיות לאחר agarose לחלוטין מבצרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במיקרוסקופ confocal כדי ACQתמונות uire. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקו לייזר 543 ננומטר עבור מכתים mCherry ו ALC מנתח. השתמש בקו לייזר 488 ננומטר עבור nlGFP והכתים calcein מנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדמיה, להוסיף בינוני דגים כדי בצלחת פטרי ולהשתמש זוג מחטים מזרק בסדר (27 x G ½ 1 &quot;) כדי להסיר את הזחלים בזהירות מן agarose. מעבירים את הזחלים עם המצורפת residually agarose בצלחת פטרי עם המדיום דגים להתאושש . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את התמונות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה 27. </li></ol>

<ol>
	<li>Ablain, J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+fish+and+men:+using+zebrafish+to+fight+human+diseases.">Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases.</a> Trends Cell Biol. 23 (12), 584-586 (2013).</li><li>Ansai, S., Kinoshita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+using+CRISPR/Cas+system+in+medaka.">Targeted mutagenesis using CRISPR/Cas system in medaka.</a> Biol Open. 3 (5), 362-371 (2014).</li><li>Apschner, A., Schulte-Merker, S., Witten, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+all+bones+are+created+equal-using+zebrafish+and+other+teleost+species+in+osteogenesis+research.">Not all bones are created equal-using zebrafish and other teleost species in osteogenesis research.</a> Methods Cell Biol. 105, 239-255 (2011).</li><li>Bajoghli, B., Aghaallaei, N., Heimbucher, T., Czerny, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+artificial+promoter+construct+for+heat-inducible+misexpression+during+fish+embryogenesis.">An artificial promoter construct for heat-inducible misexpression during fish embryogenesis.</a> Dev Biol. 271 (2), 416-430 (2004).</li><li>Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+high+content,+in+vivo+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis.">A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Biotechnol J. 1 (6), 651-655 (2006).</li><li>Centanin, L., Ander, J. J., Hoeckendorf, B., Lust, K., Kellner, T., Kraemer, I., Urbany, C., Hasel, E., Harris, W. A., Simons, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exclusive+multipotency+and+preferential+asymmetric+divisions+in+post-embryonic+neural+stem+cells+of+the+fish+retina.">Exclusive multipotency and preferential asymmetric divisions in post-embryonic neural stem cells of the fish retina.</a> Development. 141 (18), 3472-3482 (2014).</li><li>Charles, J. F., Aliprantis, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclasts:+more+than+'bone+eaters.">Osteoclasts: more than 'bone eaters.</a> Trends Mol Med. 20 (8), 449-459 (2014).</li><li>DeLaurier, A., Eames, B. F., Blanco-Sanchez, B., Peng, G., He, X., Swartz, M. E., Ullmann, B., Westerfield, M., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+sp7:EGFP:+a+transgenic+for+studying+otic+vesicle+formation,+skeletogenesis,+and+bone+regeneration.">Zebrafish sp7:EGFP: a transgenic for studying otic vesicle formation, skeletogenesis, and bone regeneration.</a> Genesis. 48 (8), 505-511 (2010).</li><li>Du, S. J., Frenkel, V., Kindschi, G., Zohar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+normal+and+defective+bone+development+in+zebrafish+embryos+using+the+fluorescent+chromophore+calcein.">Visualizing normal and defective bone development in zebrafish embryos using the fluorescent chromophore calcein.</a> Dev Biol. 238 (2), 239-246 (2001).</li><li>Eriksen, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+bone+remodeling.">Cellular mechanisms of bone remodeling.</a> Rev Endocr Metab Disord. 11 (4), 219-227 (2010).</li><li>Hockendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+embryogenesis:+a+perspective+for+light+sheet+microscopy.">Quantitative analysis of embryogenesis: a perspective for light sheet microscopy.</a> Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).</li><li>Inohaya, K., Takano, Y., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+teleost+intervertebral+region+acts+as+a+growth+center+of+the+centrum:+in+vivo+visualization+of+osteoblasts+and+their+progenitors+in+transgenic+fish.">The teleost intervertebral region acts as a growth center of the centrum: in vivo visualization of osteoblasts and their progenitors in transgenic fish.</a> Dev Dyn. 236 (11), 3031-3046 (2007).</li><li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+normal+development+in+the+medaka+Oryzias+latipes.">Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121 (7), 605-618 (2004).</li><li>Kirchmaier, S., Hockendorf, B., Moller, E. K., Bornhorst, D., Spitz, F., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+site-specific+transgenesis+and+enhancer+activity+tests+in+medaka+using+PhiC31+integrase.">Efficient site-specific transgenesis and enhancer activity tests in medaka using PhiC31 integrase.</a> Development. 140 (20), 4287-4295 (2013).</li><li>Kirchmaier, S., Naruse, K., Wittbrodt, J., Loosli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+and+genetic+toolbox+of+the+teleost+medaka+(Oryzias+latipes).">The genomic and genetic toolbox of the teleost medaka (Oryzias latipes).</a> Genetics. 199 (4), 905-918 (2015).</li><li>Komori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+osteoporosis.">Animal models for osteoporosis.</a> Eur J Pharmacol. 759, 287-294 (2015).</li><li>Mackay, E. W., Apschner, A., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bone+to+pick+with+zebrafish.">A bone to pick with zebrafish.</a> Bonekey Rep. 2, 445 (2013).</li><li>MacRae, C. A., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+tools+for+drug+discovery.">Zebrafish as tools for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).</li><li>Mitchell, R. E., Huitema, L. F., Skinner, R. E., Brunt, L. H., Severn, C., Schulte-Merker, S., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish.">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).</li><li>Renn, J., Buttner, A., To, T. T., Chan, S. J., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+col10a1:nlGFP+transgenic+line+displays+putative+osteoblast+precursors+at+the+medaka+notochordal+sheath+prior+to+mineralization.">A col10a1:nlGFP transgenic line displays putative osteoblast precursors at the medaka notochordal sheath prior to mineralization.</a> Dev Biol. 381 (1), 134-143 (2013).</li><li>Renn, J., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osterix-mCherry+transgenic+medaka+for+in+vivo+imaging+of+bone+formation.">Osterix-mCherry transgenic medaka for in vivo imaging of bone formation.</a> Dev Dyn. 238 (1), 241-248 (2009).</li><li>Schilling, T. F., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segment+and+cell+type+lineage+restrictions+during+pharyngeal+arch+development+in+the+zebrafish+embryo.">Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo.</a> Development. 120 (3), 483-494 (1994).</li><li>Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J., Trowe, T., Kranenbarg, S., Winkler, C., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+and+Cyp26b1+are+critical+regulators+of+osteogenesis+in+the+axial+skeleton.">Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton.</a> Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).</li><li>To, T. T., Witten, P. E., Renn, J., Bhattacharya, D., Huysseune, A., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rankl-induced+osteoclastogenesis+leads+to+loss+of+mineralization+in+a+medaka+osteoporosis+model.">Rankl-induced osteoclastogenesis leads to loss of mineralization in a medaka osteoporosis model.</a> Development. 139 (1), 141-150 (2012).</li><li>Wakamatsu, Y., Pristyazhnyuk, S., Kinoshita, M., Tanaka, M., Ozato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+see-through+medaka:+a+fish+model+that+is+transparent+throughout+life.">The see-through medaka: a fish model that is transparent throughout life.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (18), 10046-10050 (2001).</li><li>Witten, P. E., Huysseune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+view+on+mechanisms+and+functions+of+skeletal+remodelling+in+teleost+fish,+with+special+emphasis+on+osteoclasts+and+their+function.">A comparative view on mechanisms and functions of skeletal remodelling in teleost fish, with special emphasis on osteoclasts and their function.</a> Biol Rev Camb Philos Soc. 84 (2), 315-346 (2009).</li><li>Yu, T., Witten, P. E., Huysseune, A., Buettner, A., To, T. T., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+osteoclast+inhibition+by+bisphosphonates+in+a+medaka+osteoporosis+model.">Live imaging of osteoclast inhibition by bisphosphonates in a medaka osteoporosis model.</a> Dis Model Mech. 9 (2), 155-163 (2016).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים או פיננסיים.

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול זה חיוני כי התנאים לטיפול הלם חום הם עקביים ויציבים כאשר משווים מדגמים שונים. בתנאי טמפרטורה יציבים להבטיח רמות דומות של אינדוקצית RANKL ב הזחלים המהונדסים, וכתוצאה מכך, היווצרות osteoclast דומה, אשר יכול להי?...

שלד החוליות מספק תמיכה מבנית והגנה על איברים, מאפשר ניידות, ומשמש מקור לסידן. לכל אורך חייו, מטריצת העצם התאית מופעלת מעל רף כדי לשמור על יציבות עצם ונוקש. תהליך זה דורש פעילות מתואמת בחוזקה הגומלין של אוסטאובלסטים יוצרי העצם osteoclasts-resorbing העצם. Osteoblasts נגזרות אבות mesenchymal מולטיפוטנטיים ולייצר קולגן ליצירת דמוי עצם, החלק חלבוניים של מטריקס העצם 10. Osteoblasts אינטראקציה עם osteoclasts להשיג פעילות מאוזנת של שני סוגי התאים, אשר נדרש שליטת עצם הומאוסטזיס 7. בגלל אינטראקציות רגולציה המורכבות האלו, תגובות טיפול תרופתי הומאוסטזיס עצם לא ניתן לבדוק באופן מלא באמצעות במבחנה. לפיכך, קיימת דרישה חזקה במודלים של בעלי חיים. בהשוואה להגדרות תרבית תאים, במודלים vivo יכול לספקתובנה חשובה רשתות רבות-תאי בתוך סביבת העצם. במודלים של עכברים רבים קיימים עבור מגוון רחב של הפרעות עצמות אדם כוללים אוסטאופורוזיס 16. עם זאת, הגודל והנגישות של עוברי עכברים מייצגים מגבלות משמעותיות עבור הדמית חיה של תהליכי שלד. דגים teleost קטנים, ומצד שני, לשמש חלופה אטרקטיבית הדמיה in vivo. דג זברה (Danio rerio) ו medaka (Oryzias latipes) הפכו במודלים של בעלי חיים פופולריים למחקר שלד במהלך שני העשורים האחרונים 17, 19, 22, 24. עצם חוליות דגים ביונקים דומה מאוד, הוא על מבני ברמה פיזיולוגית, ורבי גני רגולטוריים מפתח מסלולי איתות שמורים 3. כמו יונקים, דגים teleost בזהירות להסדיר את הפעילות של אוסטאובלסטים ו osteoclasts לאזן היווצרות העצם ספיגת 26. והחשוב מכל, הבהירות האופטית של fish זחלים מאפשרים שימוש כתבי ניאון לתייג תאי עצם ומטריצת השלד המסוידת 8, 9, 12, 21, 23, המאפשרת התצפית של תהליכים תאיים בתוך החי. בנוסף, שורה של כלים גנטיים נוצרה כדי להקל על מחקר biomedically רלוונטי בדגים. לקבלת medaka בפרט, שיטות מוטצית גן ממוקדת על ידי CrispR / Cas9 2, תא שושלת התחקות 6, ואתר ספציפי transgenesis 14 הוקם לאחרונה וכעת הם נרחב בשימוש 15. זחלי חוליות קטנים שמשו בהצלחה עבור מסכים כימי, אשר הוביל לגילוי של מספר תרופות רלוונטיות פרמקולוגית 1, 18. הזחלים דג סובלניים לריכוזים נמוכים של DMSO והם מסוגלים לספוג תרכובות מן הסביבה המימית שלהם, או דרך העור או דרך מערכת העיכול 1, 5. נציג המעבדה שלנו בעברקווי medaka מהונדסים orted מבטאי כתבי ניאון בתאי עצם בשליטת osteoblast- השונה ומקדמים ספציפיים osteoclast. אלה כוללים אוסטאובלסטים מוקדמים (קולגן 10a1, col10a1; osterix, OSX) 20, 21, אוסטאובלסטים בוגר (osteocalcin, OSC) 27, ו osteoclasts (cathepsin K, ctsk) 24. כמו כן, אנו שנוצרנו קו מהונדס המבטא את הגורם וישכנע osteoclast קולטן Activator של גרעיני-גורם κB ליגנד (RANKL) תחת השליטה של מקדם הלם-מושרה חום 24. אינדוקציה של RANKL במערכת זו התוצאה היא ההיווצרות אקטופי של osteoclasts הפעיל. זה מוביל ספיגת עצם מוגברת פנוטיפ אוסטאופורוזיס דמוי חמור, עם מינרליזציה באופן דרסטי בגופים בחוליות. הראינו לאחרונה כי פעילות האוסטאוקלסטים במודל זה יכול להיחסם על ידי etidronate ביספוספונטים ו alendronate, TWתרופות o נפוצות בטיפול באוסטיאופורוזיס אדם, ובכך אימות medaka כמערכת מודל מתאימה אוסטאופורוזיס 27. בשל גדליו הגוזלים הגדולים שלהם, התפתחות מהירה, וגודל קטן של עוברים, זחלי medaka מהונדסים מתאימים בצורה ייחודית להקרנה בקנה המידה הגדולה של תרופות לאוסטאופורוזיס לניתוח vivo של התנהגות תא עצם. עיוני medaka ובכך יכולים להשלים ניסויים ביעילות בתרביות תאים והן בעכברים ומיועדים לגלות מטרות טיפוליות חדשות טיפולים חדשניים להפרעות עצמות אדם. במחקר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול לטיפול זחלי medaka עצם כתב עם התרופה לאוסטאופורוזיס המשותפת, alendronate. כמו כן, אנו מתארים בפירוט כיצד מטופלים הזחלים הם רכובים והוכנו הדמיה חיה של מטריקס העצם תאי עצם. ניתן פרוטוקולים אלה להתאים בקלות תרכובות כימיות קטנות אחרות כי גם לעבוד אנבוליים עצם או תרופות תרופתיות. &lt;/ P&gt;

<table><tbody><tr><td>Alendronate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A4978</td><td></td></tr><tr><td>alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone</td><td>Sigma</td><td>A3882</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (1.4.3.67)</td><td>National Institute of Health (NIH)</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>LSM 510 Meta confocal&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM Image Browser (4.2.0.121)</td><td>Zeiss</td><td></td><td>http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html</td></tr><tr><td>Micro-loader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Eppendorf ep T.I.P.S 20 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>NIS-Elements BR 3.0 software</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS6 (13.0.0.0)</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SMZ1000 stereomicroscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

drug treatment and in vivo imaging of osteoblast-osteoclast interactions in a medaka fish osteoporosis model

עצם יוצרי אוסטאובלסטים אינטראקציה עם osteoclasts-resorbing עצם לתאם את המחזור של מטריקס העצם לשלוט הומאוסטזיס שלד. Medaka וזחלי דג זברה נמצאים בשימוש נרחב כדי לנתח את ההתנהגות של תאי עצם במהלך היווצרות, ניוון עצם, ותיקון. הבהירות האופטית שלהם מאפשרת ההדמיה של תאי עצם צבעי ניאון שכותרתו fluorescently כבול מטריצת שלד mineralized. המעבדה שלנו יצרה דגי medaka המהונדס המבטאים את הגורם וישכנע osteoclast קולטן Activator של גרעיני-גורם κB ליגנד (RANKL) תחת השליטה של ​​מקדם הלם-מושרה חום. ביטוי אקטופי של תוצאות RANKL להיווצרות העודפת של osteoclasts מופעל, אשר ניתן דמיין בקווים הכתב עם ביטוי nlGFP תחת השליטה של אמרגן cathepsin K (ctsk). אינדוקצית RANKL והיווצרות osteoclast אקטופי מובילה פנוטיפים אוסטאופורוזיס דמוי חמורים. li medaka מהונדס מתחםנס מבטאי ctsk: nlGFP ב osteoclasts, כמו גם mCherry תחת השליטה של אמרגן osterix (OSX) ב אוסטאובלסטים מוקדמת, יכול לשמש כדי לחקור את האינטראקציה של שני סוגי התאים. זה מקל על התצפית in vivo של התנהגות הסלולר בתנאים של ניוון העצם ואת החלמתה. כאן אנו מתארים את השימוש במערכת זו כדי לבדוק תרופה המשמשת בדרך כלל בטיפול באוסטיאופורוזיס אדם מתאר פרוטוקול הדמיה לחיות. מודל medaka מוסיף למחקרים בתרבות תא ועכברים, ומציע מערכת חדשה לניתוח vivo של פעולת תרופה במערכת השלד.

מספרי ביצה שופעים, כמו גם את הגודל הקטן של הזחלים, להפוך medaka מודל מצוין הקרנת סמים. צלחת אחת שש גם שמשה לתרבות עד 36 זחלים, אשר היו מספיק כדי לספק נתונים בעלי משמעות סטטיסטית. יתרון גדול נוסף של שימוש דג לניתוח שלד הוא האפשרות לעשות הדמיה לחיות. השקיפות של זחלים דגים מאפש...

Watch this Scientific Journal Video about Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model at JoVE.com

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

ותרופות טיפול<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של אוסטאובלסטים-osteoclast אינטראקציות במודל אוסטאופורוזיס Medaka דגים

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

drug-treatment-vivo-imaging-osteoblast-osteoclast-interactions-medaka

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

9.2K Views.  National University of Singapore. Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Video: Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely used intra-cardiac and intra-tibial injections, IIA injection brings several advantages. First, it can deliver a large quantity of cancer cells specifically to hind limb bones, thereby providing spatiotemporally synchronized early-stage colonization events and allowing robust quantification and swift detection of disseminated tumor cells. Second, it injects cancer cells into the circulation without damaging the local tissues, thereby avoiding inflammatory and wound-healing processes that confound the bone colonization process. Third, IIA injection causes very little metastatic growth in non-bone organs, thereby preventing animals from succumbing to other vital metastases, and allowing continuous monitoring of indolent bone lesions. These advantages are especially useful for the inspection of progression from single cancer cells to multi-cell micrometastases, which has largely been elusive in the past. When combined with cutting-edge approaches of biological imaging and bone histology, IIA injection can be applied to various research purposes related to bone metastases.

This manuscript provides the detailed procedure of intra-iliac artery (IIA) injection, a technique to deliver cancer cells specifically to hind limb tissues including bones to establish experimental bone metastases. Although initially established with breast tumor models, this protocol can be easily extended to other cancer types.

הזרקת עורק Intra-כסל עבור דוגמנות יעילה וסלקטיבי של מיקרוסקופיים עצם גרור

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

Cancer Research

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

דג זברה בוגרת מודלים פציעה ללמוד את השפעות Prednisolone רגנרציה רקמת העצם

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

עוקב<em&gt; בvivo</em&gt; הדמיה של תאי גזע / אב osteogenic במהלך תיקון שבר

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Medicine

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that implantation of a bone autograft would induce greater bone regeneration by abundant blood vessel formation. To investigate the effect of the graft on neovascularization at the defect site, we developed a micro&#8211;computed tomography (&#181;CT) approach to characterize newly forming blood vessels, which involves systemic perfusion of the animal with a polymerizing contrast agent. This method enables detailed vascular analysis of an organ in its entirety. Additionally, blood perfusion was assessed using fluorescence imaging (FLI) of a blood-borne fluorescent agent. Bone formation was quantified by FLI using a hydroxyapatite-targeted probe and &#181;CT analysis. Stem cell recruitment was monitored by bioluminescence imaging (BLI) of transgenic mice that express luciferase under the control of the osteocalcin promoter. Here we describe and demonstrate preparation of the allograft, calvarial defect surgery, &#181;CT scanning protocols for the neovascularization study and bone formation analysis (including the in vivo perfusion of contrast agent), and the protocol for data analysis.
The 3D high-resolution analysis of vasculature demonstrated significantly greater angiogenesis in animals with implanted autografts, especially with respect to arteriole formation. Accordingly, blood perfusion was significantly higher in the autograft group by the 7th day after surgery. We observed superior bone mineralization and measured greater bone formation in animals that received autografts. Autograft implantation induced resident stem cell recruitment to the graft-host bone suture, where the cells differentiated into bone-forming cells between the 7th and 10th postoperative day. This finding means that enhanced bone formation may be attributed to the augmented vascular feeding that characterizes autograft implantation. The methods depicted may serve as an optimal tool to study bone regeneration in terms of tightly bounded bone formation and neovascularization.

Implantation of autologous and allogeneic bone grafts constitute accepted approaches to treat major craniofacial bone loss. Yet the effect of graft composition on the interplay among neovascularization, cell differentiation and bone formation is unclear. We present a multimodal imaging protocol aimed to elucidate the angiogenesis-osteogenesis interdependence at the graft proximity.

טומוגרפיה ממוחשבת והדמיה אופטית של צימוד Osteogenesis-אנגיוגנזה להערכת שילוב של Autografts עצם הגולגולת וAllografts

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

Bioengineering

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

רומן<em&gt; In vivo</em&gt; טכניקה וין העברה<em&gt; במבחנה</emמבחני תא בהתבסס&gt; לחקר אובדן עצם בפרעות השלד והשרירים

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ages. Animal OVCF models are essential to the preclinical development of translational tissue engineering strategies. While a number of models currently exist, this protocol describes an optimized method for inducing multiple highly reproducible vertebral defects in a single nude rat. A novel longitudinal semiautomated microcomputed tomography (&#181;CT)-based quantitative structural analysis of the vertebral defects is also detailed. Briefly, rats were imaged at multiple time points post-op. The day 1 scan was reoriented to a standard position, and a standard volume of interest was defined. Subsequent &#181;CT scans of each rat were automatically registered to the day 1 scan so the same volume of interest was then analyzed to assess for new bone formation. This versatile approach can be adapted to a variety of other models where longitudinal imaging-based analysis could benefit from precise 3D semiautomated alignment. Taken together, this protocol describes a readily quantifiable and easily reproducible system for osteoporosis and bone research. The suggested protocol takes 4 months to induce osteoporosis in nude ovariectomized rats and between 2.7 and 4 h to generate, image, and analyze two vertebral defects, depending on tissue size and equipment.

The goal of this protocol is to generate a nude rat osteoporosis-related vertebral compression fracture model that can be longitudinally evaluated in vivo using a semiautomated microcomputed tomography-based quantitative structural analysis.

Semiautomated האורך מבוסס-טומוגרפיה Microcomputed כמותיים ניתוח מבנה של מודל הקשורות אוסטיאופורוזיס שבר בחוליות עכברוש עירום

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ...

Using Alizarin Red Staining to Detect Chemically Induced Bone Loss in Zebrafish Larvae

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the specific effects and mechanisms in zebrafish remain unclear. Alizarin red has a high affinity for calcium ions and can help visualize the bone and illustrate skeletal mineral mass. In this study, we aimed to detect lead acetate (PbAc)-induced bone loss in zebrafish larvae by using alizarin red staining. Zebrafish embryos were treated with a series of PbAc concentrations (0, 5, 10, 20 mg/L) between 2 and 120 h post fertilization. Whole-mount skeletal staining was conducted on larvae at 9 days post fertilization, and the total stained area was quantified using ImageJ software. The results indicated that the mineralized tissues were stained in red, and the stained area decreased significantly in the PbAc-exposure group, with a dose-dependent change in bone mineralization. This paper presents a staining protocol for investigating skeletal changes in PbAc-induced bone defects. The method can also be used in zebrafish larvae for the detection of bone loss induced by other chemicals.

Here, we have used alizarin red staining to show that lead acetate exposure causes a bone mass change in zebrafish larvae. This staining method can be adapted to the investigation of bone loss in zebrafish larvae loss induced by other hazardous toxicants.

שימוש בכתמים אדומים של אליזרין לאיתור אובדן עצם הנגרם כימית בזחלי דגי זברה

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the ...

<meta charset="utf8"></head><body>שיטת אבלציה בלייזר לחקר התחדשות עצם בזחלי זברה

Two-Photon Laser-Mediated Ablation of Osteoblasts in Developing Zebrafish Larvae

Zebrafish (Danio rerio) have an outstanding capacity to regenerate different organs and appendages. Bone regeneration in zebrafish has been studied using different methods such as fin amputation, scale plucking, skull trepanation, and microscopic approaches. Using a confocal laser scanning setup equipped with a two-photon laser, a laser ablation method was developed as a lesion paradigm to ablate bone-forming cells (osteoblasts) in the developing opercle of zebrafish larvae. The method described here allows the ablation of cells in a precise manner, as the area, shape, and depth can be finely adjusted. In addition, this method allows imaging of the area before and just after the ablation, so that short-term effects of the injury can be analyzed. In this experimental setup, the immune response after ablation of osteoblasts in the injured area was studied. An increase in the recruitment of macrophages was observed after ablation, indicating the relevance of their presence during bone regeneration.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: התחדשות עצם בתיווך מערכת החיסון - התפקיד הקריטי של מקרופאגים ואימונומודולציה מבוקרת בתהליכים משקמים

This protocol describes a two-photon laser ablation approach carried out in zebrafish larvae, which serves as a model to study bone regeneration and the effects of the immune response to ablation.

אבלציה בתיווך לייזר דו-פוטוני של אוסטאובלסטים בהתפתחות זחלי דגי זברה

Zebrafish (Danio rerio) have an outstanding capacity to regenerate different organs and appendages. Bone regeneration in zebrafish has been studied using ...

ותרופות טיפול

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הזרקת עורק Intra-כסל עבור דוגמנות יעילה וסלקטיבי של מיקרוסקופיים עצם גרור

דג זברה בוגרת מודלים פציעה ללמוד את השפעות Prednisolone רגנרציה רקמת העצם

עוקב

טומוגרפיה ממוחשבת והדמיה אופטית של צימוד Osteogenesis-אנגיוגנזה להערכת שילוב של Autografts עצם הגולגולת וAllografts

רומן

Semiautomated האורך מבוסס-טומוגרפיה Microcomputed כמותיים ניתוח מבנה של מודל הקשורות אוסטיאופורוזיס שבר בחוליות עכברוש עירום

שימוש בכתמים אדומים של אליזרין לאיתור אובדן עצם הנגרם כימית בזחלי דגי זברה

אבלציה בתיווך לייזר דו-פוטוני של אוסטאובלסטים בהתפתחות זחלי דגי זברה

אבלציה בתיווך לייזר דו-פוטוני של אוסטאובלסטים בהתפתחות זחלי דגי זברה

אבלציה בתיווך לייזר דו-פוטוני של אוסטאובלסטים בהתפתחות זחלי דגי זברה