שימוש בכתמים אדומים של אליזרין לאיתור אובדן עצם הנגרם כימית בזחלי דגי זברה

שיטה זו יכולה לסייע באיתור רעילות העצם הנגרמת על ידי כימיקלים בדגי זברה. Alizarin צביעה אדומה של רקמה קבועה יוצרת תיעוד קבוע של שינויים בשלד שיכולים להקל על השוואות של מספר דגימות. טכניקה זו עשויה לעזור לחקור אוסטאופורוזיס במודל דגי הזברה, שכן אחד המאפיינים של אוסטאופורוזיס הוא הירידה במסת העצם.

הסר 10 זחלי דגי זברה באופן אקראי מכל קבוצה תשעה ימים לאחר ההפריה, ותקן את הדגים במיליליטר אחד של 2% פרדפורם אלדהיד ו- 1X PBS למשך שעתיים. לרוקן את התמיסה ולשטוף את הזחל דג זברה באמצעות 100 מילימולר Tris HCL עם pH של 7.5 או 10 מילימולר מגנזיום כלוריד. לצורך הסרת כתמים, פזרו את התמיסה ודגרו את הזחל במשך חמש דקות בסדרה של תמיסות כמתואר בכתב היד.

לאחר הדגירה הסופית, decant את הפתרון ולהסיר את הפיגמנט על ידי הלבנה עם תמיסה המורכבת של 3% מי חמצן ו 0.5% אשלגן הידרוקסיד. שימו לב אחת ל-10 דקות עד שהפיגמנט יוסר לחלוטין. שטפו את זחל דגי הזברה מספר פעמים עם 25% גליצרין, 0.1% אשלגן הידרוקסיד למשך 10 דקות כל אחד עד שאין בועות.

כתם בזחל על ידי השרייה במיליליטר אחד של 0.01% אליזרין. הפחת את התמיסה, והוסף מיליליטר אחד של 50% גליצרין או 0.1% אשלגן הידרוקסיד כדי לנקות את הרקע. אחסנו את הדגים ב-50% גליצרין טרי או 0.1% אשלגן הידרוקסיד לתצפית הבאה.

מעבירים זחל אחד בכל פעם על מגלשת הזכוכית ומשאירים את הזחל באמצע טיפת הנוזל. התבונן בזחל תחת מיקרוסקופ סטריאו. הפעל את המצלמה.

פתח את התוכנה ושמור על הגדרות ברירת המחדל. לחץ על AE ובחר זמן חשיפה מתאים כדי לקבל את התמונה הטובה ביותר. צלם את כל התמונות תחת אותן הגדרות.

שמור את התמונות בתבנית dot tiff לניתוח מאוחר יותר. לחץ פעמיים על סמל imageJ. כדי לנתח את התמונות השמורות, לחץ על הקובץ, ואז פתח, לאחר מכן לחץ על התמונה, ולאחר מכן הקלד ובחר שמונה סיביות.

לחץ על עריכה, והפוך. לחץ על נתח ולאחר מכן כייל. בחר OD לא מכויל בממשק המוקפץ.

בדוק את הכיול הכללי בפינה השמאלית התחתונה של הממשק התחתון ולחץ על אישור. לחץ על ניתוח, הגדר קנה מידה ולאחר מכן הסר קנה מידה. בדוק גלובלי למטה, ולחץ על אישור.

לחצו על 'נתח', ואחר כך קבעו מידות. בחר את אזור הפריט בממשק המוקפץ. בדוק את המגבלה לסף למטה כדי למדוד רק את הטווח שנבחר, ולחץ על אישור.

לחץ על התמונה, התאם ואז סף, והחלק את המחוון באמצע הממשק הקופץ. כדי לבחור את הסף המתאים כך שייבחרו כל היעדים לבדיקה בתמונה אחת. ולחץ על הגדר.

לחץ על נתח, ואז מדוד, שמור את התאריכים. צביעה אדומה של אליזרין היא שיטה רגישה וספציפית למדידת שינויים במינרליזציה של העצם בזחלי דגי זברה. בתשעה ימים לאחר ההפריה, עצמות רבות של שלד הראש כגון פרספנואיד, אופרקולרי, ceratobranchial ו notochord הם מינרליזציה ולכן מוכתמים באדום.

לעומת זאת, מבנים לא גרמיים כמו אוטוליטים, נראים שחורים חומים. ניתוח דיגיטלי שבוצע כדי לכמת את השטח המוכתם הכולל, הראה ירידה משמעותית באזור המוכתם עבור 10 ו 20 מיליגרם לליטר של קבוצות טיפול אצטט עופרת. השינויים במינרליזציה של העצם הראו תלות במינון.

לאפקט צביעה ותצפית טובים יותר, חשוב להסיר את הפיגמנט המקורי של זחלי דגי הזברה, ולהסיר את הבועות לאחר ההלבנה.