Este proyecto fue financiado por subvenciones del Ministerio de Educación de Singapur (MOE, el número de concesión 2013-T2-2-126) y el Instituto Nacional de Salud, EE.UU. (NIH, el número de concesión 1R21AT008452-01A1). TY recibió una beca de postgrado del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Singapur. Agradecemos a la unidad confocal del Centro de Ciencias de la Universidad Nacional de Singapur para Bioimagen (CBIS) por su apoyo constante.

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con protocolos Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) aprobados de la Universidad Nacional de Singapur (R14-293). 1. Pescado Ganadería y la recogida de embriones <ol><li> Elevar WT, ctsk: nlGFP 24, RANKL: HSE: PPC 24, y OSX: 21 mCherry simple o compuesto peces medaka transgénico a 26 ° C bajo un ciclo de luz controlada (14 h de luz, 10 h oscuridad) para inducir el desove. </li><li> desove tiene lugar todos los días durante los primeros 30 minutos después de que la luz se enciende. Los huevos se pegan entre sí a través de filamentos y se unen al abdomen de la hembra durante varias horas. Utilice una red de malla fina para atrapar una mujer adulta que lleva un racimo de huevos. Deje que los peces descansar brevemente en la red y luego masajear suavemente el abdomen del pescado para pelar cuidadosamente el clúster óvulo fertilizado desde el abdomen de la hembra. NOTA: Una mujer sana medakapuede producir 10 - 20 huevos por día durante aproximadamente 5 meses. </li><li> Coloque los huevos en una placa Petri de plástico de 60 mm. Usar una pipeta de plástico para enjuagar los embriones con 5 a 10 ml de de 0.3x Danieau medio solución de (pescado; NaCl 19,3 mM, KCl 0,23 mM, 0,13 mM MgSO 4, mM Ca 0,2 (NO 3) 2, y 1,7 mM HEPES, pH 7.0). Añadir 1 ml de una 0,25% (w / v) de solución de azul de metileno de la a 2,5 L de medio de pescado para prevenir el crecimiento de hongos. </li><li> rodar suavemente clúster huevo para formar un nudo de filamentos de fijación. El uso de fórceps para retirar cuidadosamente los filamentos de unión de las masas de huevos fertilizados para obtener embriones individuales (Figura 1A). </li><li> Organizar los embriones de acuerdo con Iwamatsu 2004 13. </li><li> Cultura 20 - 30 embriones por 60 mm placa Petri de plástico en un 28 ° C incubadora. Cambiar el medio a diario para garantizar el desarrollo normal de los embriones. NOTA: El tiempo de vuelta de la fase de eclosión (8 - 9 d después de la fecundación,DPF) es especialmente crítico para la supervivencia. Retire chorions de libre flotación para mantener limpio el medio y para asegurar buenas tasas de supervivencia de las larvas. </li></ol> 2. selección de embriones transgénicos <ol><li> Utilice un estereomicroscopio equipado con una lámpara de mercurio de imágenes de fluorescencia y GFP, RFP, y los filtros de la PPC para detectar embriones transgénicos para la expresión del indicador fluorescente utilizando magnificación de 40X. </li><li> Identificar visualmente OSX: mCherry embriones por la expresión del indicador mCherry en la temprana formación de los huesos craneales, como el cleithrum, en ambos lados de la cabeza posterior (Figura 1B, flecha), y el parasphenoid, en una posición central en el cráneo ventral ( la Figura 1B, punta de flecha). NOTA: la expresión del indicador comienza a partir de 5 DPF 21 en adelante. </li><li> Identificar ctsk: nlGFP embriones por fuerte expresión nlGFP en la cabeza (Figura 1C, flecha) y la cola (Figura 1C, punta de flecha), a partir de6 DPF. NOTA: los osteoclastos endógenos sólo se forman después del 21 de DPF. Las células en esta etapa temprana (6 DPF) nlGFP-expresión de los osteoclastos no son sino otra, hasta ahora no caracterizada, ctsk células positivas 24. </li><li> Identificar RANKL: HSE: PPC embriones transgénicos por la expresión ubicua PPC después de un tratamiento a corto choque de calor durante 20 minutos a 39 ° C, llevado a cabo en 2 DPF o posterior para fines de selección. NOTA: El RANKL y la PPC transgenes están bajo el control del mismo choque elemento de calor bidireccional (HSE). PPC expresión indica la inducción exitosa RANKL 24. </li><li> Realizar un 1,5 - tratamiento de choque térmico de 2 horas a 9 DPF o posterior para inducir a un gran número de osteoclastos ectópicos en la región del tronco, que en consecuencia resulta en un fenotipo similar a la osteoporosis 24. NOTA: RANKL expresión transgénica inducida a los 9 resultados DPF en una activación ectópica de células progenitoras de osteoclastos latentes, que forma endógena no se desencadenaantes del 21 de DPF. Use un baño de agua para obtener 39 ° C Condiciones estables. Deje que los embriones de medaka placa de Petri que contienen flotan en la superficie del agua. Asegúrese de que la tapa de la caja de Petri es seco para evitar el hundimiento del plato. </li><li> Embriones de pantalla de líneas compuestas, tales como RANKL: HSE: PPC / ctsk: nlGFP doble transgénico y OSX: mCherry / RANKL: HSE: PPC / ctsk: nlGFP triple transgénico, de acuerdo con el patrón de expresión de cada transgén individual. NOTA: embriones transgénicos hemicigotos y homocigotos se distinguen por diferentes niveles de fluorescencia del transgén reportero. embriones homocigóticos tenían una intensidad de fluorescencia que aproximadamente se duplicó en comparación con la de los transgénicos hemicigotos. Líneas de compuestos que son homocigotos para ambos RANKL: HSE: PPC y ctsk: nlGFP fueron obtenidos por incrossing repetido durante varias generaciones. Para triple transgénico OSX: mCherry / RANKL: HSE: PPC / ctsk: peces nlGFP,<html> RANKL homocigotos: HSE: PPC / ctsk: peces nlGFP se cruzaron con OSX homocigotos: mCherry portadores. La progenie de triple transgénicos heterocigotos resultante se plantearon y incrossed para obtener embriones homocigotos para RANKL: HSE: PPC. El RANKL: HSE: PPC transgén debe ser homocigótico con el fin de obtener la inducción eficiente de los osteoclastos ectópicos. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55025/55025fig1.jpg" /> Figura 1: WT y transgénicos medaka embriones a las 7 D después de la fecundación (DPF). A. embriones WT observaron con iluminación de campo claro. B. Embriones transgénicos que muestran OSX: expresión mCherry alrededor del cleithrum (flecha) y parasphenoid (punta de flecha). C. Embriones transgénicos que muestran expresión ctsk: nlGFP en la cabeza (flecha) y la cola (punta de flecha). Barras de escala: 500 m.025 / 55025fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 3. El tratamiento con bisfosfonatos de Medaka larvas <ol><li> Se preparan soluciones que contienen diferentes concentraciones de bifosfonatos (BPS) para los estudios de dosis-respuesta. NOTA: El BP ejemplar utilizado en este protocolo es el alendronato. <ol><li> Disolver alendronato en medio de pescado a una concentración de 100 mg / ml para preparar una solución madre. </li><li> Utilice un mezclador de vórtice para asegurar la disolución completa. La solución madre, a 4 ° C. </li><li> Preparar diferentes soluciones de trabajo por dilución de la solución madre con medio de pescado a una serie de concentraciones (es decir, 25, 37,5, 50, 62,5, y 75 mg / ml). NOTA: Diferentes fármacos pueden tener diferentes, distribución, metabolismo y parámetros (ADME) Absorción de excreción, que deben tenerse en cuenta durante las pruebas usando este sistema larvas medaka. Además, la solubilidad del fármaco y la estabilidad pueden variar si seaplicado como una solución acuosa. compuestos solubles en agua menor que tenga que ser disuelto primero en disolventes orgánicos, tales como DMSO. En este caso, una solución de reserva se prepara en DMSO, que luego se diluyó adicionalmente en un medio de pescado. Tenga en cuenta que las soluciones de trabajo en el agua (medio de pescado) se pueden almacenar en la nevera durante varias semanas. Sin embargo, las soluciones que contienen DMSO se deben almacenar a temperatura ambiente para evitar la cristalización. </li></ol></li><li> Transferencia medaka larvas en placas de seis pocillos (seis larvas / pocillo) para su posterior tratamiento BP (alendronato). </li><li> Eliminar el medio de pescado con cuidado usando una pipeta de plástico limpio y añadir un volumen pequeño (aprox. 0,5 ml) de solución de alendronato a cada pocillo. </li><li> Evitar medio de pescados de sobra, como podría ser diluida la solución BP añadido, que es especialmente crítico para las soluciones de alendronato menos concentrada. </li><li> Retirar un pequeño volumen de solución de alendronato (hasta 0,5 ml) de cada pocillo con una pipeta de plástico limpio y sustituirla por una mayor volume (4 ml) de solución de alendronato. </li><li> Cambie medio diario para garantizar el desarrollo normal de embriones. </li></ol> 4. La tinción vivo de matriz mineralizada-hueso <ol><li> Disolver 0,5 g de alizarina complexona (ALC; ácido alizarina-3-metiliminodiacético) o 0,05 g de calceína en 50 ml de medio de pescado para preparar 1% y 0,1% de soluciones madre, respectivamente. Utilice un mezclador de vórtice para asegurar la disolución completa. NOTA: medio Fish sin la adición de azul de metileno se utiliza en este y en los pasos subsiguientes para reducir la autofluorescencia en las larvas. </li><li> Utilice un filtro de jeringa y de un solo uso (0,2 m) para filtrar la solución de tinción. Almacenar la solución filtrada en la oscuridad a temperatura ambiente. NOTA: El color de la solución de tinción filtrada, claro ALC es de color amarillo oscuro a naranja. El color de la solución filtrada calceína, claro es de color amarillo brillante. Las soluciones pueden ser utilizadas para varios meses. </li><li> Se diluye la solución filtrada ALC o calceína Stock 1:10 en medio de pecese incubar la larva medaka durante 1,5 - 2 h (0,1% de solución de ALC) o 2 - 2,5 h (solución de calceína 0,01%) en un 28 ° C incubadora si se utilizan larvas de entre 9 y 17 DPF. Mantener las muestras en la oscuridad. </li><li> Transferir las larvas al medio pescado fresco con una pipeta de plástico limpio. </li><li> Retire el medio de pescado con una pipeta de plástico limpia y se añade medio de pescado fresco. Repita este paso para 3 - 4 veces hasta que hay una solución rojas o de color amarillo manchado (ALC o calceína, respectivamente) son sobras. Deja las larvas en medio de pescado durante 30 - 60 min antes de su montaje para formación de imágenes para evitar epifluorescencia a partir del medio. NOTA: 0,1% de solución de tinción ALC es perjudicial para las larvas de medaka para tiempos de exposición prolongados. tiempos de incubación de más de 2 h afectan a la supervivencia de las larvas. por lo tanto, necesitan ser optimizados para las diferentes etapas con el fin de lograr la supervivencia del embrión y tinción resultados óptimos concentración y tiempo de tinción. </li></ol> 5. vivo la imagen de fluorescencia </<html> p&gt; <ol><li> Anestesiar a las larvas medaka con 0,01% Tricaína (etil metanosulfonato de 3-aminobenzoato) en medio de los peces. NOTA: anestesiados larvas se convierten en inmovilizada después de 5 - 10 minutos en solución Tricaína y por lo general están mintiendo, ya sea en sus lados o la espalda. </li><li> Use un microloader plástico para orientar las larvas de acuerdo a la región de interés. La orientación de las larvas utilizado en este protocolo es lateral. </li><li> Use un microscopio estereoscópico con iluminación de fluorescencia para la imagen. Utilice una gran ampliación al tomar imágenes, centrándose en diferentes partes de las larvas (cabeza, tronco anterior, posterior del tronco y cola). Cosa imágenes individuales juntos en regiones solapadas utilizando un software de procesamiento de imágenes adecuado (inserciones en la figura 3G). NOTA: Esto ayuda a mejorar la calidad de imagen de todas las partes del cuerpo correspondientes en el plano focal correcta. </li><li> Devolver las larvas al medio de pescado para la recuperación después de la formación de imágenes. </li></ol>tle &quot;&gt; 6. Vive Imagen confocal <ol><li> Anestesiar a las larvas con un 0,01% Tricaína en medio de pescado durante 5 - 10 minutos a hasta que se convierten inmovilizada. </li><li> Disolver bajo punto de fusión de agarosa al 1,5% en medio de pescado por calentamiento en un horno microondas. Enfriar esta solución a aproximadamente 30 ° C. </li><li> Añada 0,5 - 1 ml de líquido de 1,5% de agarosa de baja fusión en medio de pescado a una placa de Petri con fondo de vidrio. Transferir las larvas anestesiado en la solución con una pipeta de plástico limpio. NOTA: Tome precauciones especiales que la temperatura de la agarosa de bajo punto de fusión líquido es lo suficientemente bajo para no dañar las larvas. </li><li> Antes de que los solidifica de agarosa, utilizar un microloader plástico para empujar las larvas a la parte inferior de la placa de Petri y orientar las larvas de acuerdo con la región de interés. La orientación de las larvas utilizado en este protocolo es lateral. NOTA: Las muestras están listas para imágenes en vivo confocal después de la agarosa solidifica por completo. </li><li> Utilizar un microscopio confocal para ACQUIRE imágenes. </li><li> Utilice una línea de láser de 543 nm para el análisis y mCherry ALC tinción. Utilice una línea de láser de 488 nm para nlGFP y analiza la tinción de calceína. </li><li> Después de formación de imágenes, se añade medio de los peces a la placa de Petri y el uso de un par de finas agujas de jeringa (27 G x 1 ½ &quot;) para eliminar cuidadosamente las larvas de la agarosa. Transferencia de las larvas con residualmente adjunto de agarosa para una placa de Petri con medio de pescado para recuperar . </li><li> Procesar las imágenes usando un software de análisis de imagen 27. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses en competencia o financieras.

Los pasos críticos dentro del Protocolo Es esencial que las condiciones para el tratamiento de choque térmico son consistentes y estables cuando se comparan diferentes muestras. Condiciones de temperatura estables garantizan niveles similares de la inducción de RANKL en las larvas transgénicas y, en consecuencia, la formación de osteoclastos comparable, que puede ser confirmada por la detección de ctsk: expresión nlGFP. En última instancia, esto conduce a un grado similar de la...

El esqueleto de los vertebrados proporciona soporte estructural y la protección de órganos, permite la movilidad, y sirve como una fuente de calcio. A lo largo de la vida, la matriz ósea extracelular se gira constantemente a mantener la estabilidad del hueso y la rigidez. Este proceso requiere la actividad estrechamente coordinada y la interacción de los osteoblastos que forman el hueso y los osteoclastos de resorción ósea. Los osteoblastos se derivan a partir de progenitores mesenquimales multipotentes y producen colágeno para formar el osteoide, la parte proteica de la matriz ósea 10. Los osteoblastos interactúan con los osteoclastos para lograr una actividad equilibrada de ambos tipos de células, que se requiere para el control de la homeostasis ósea 7. Debido a estas interacciones reguladoras intrincados, las respuestas al tratamiento de drogas y la homeostasis ósea no pueden ser examinadas utilizando plenamente los estudios in vitro. Por lo tanto, existe una fuerte demanda de los modelos animales. En comparación con la configuración de cultivo de células, en modelos in vivo puede proporcionarinformación valiosa sobre las redes multicelulares en el entorno de los huesos. Existen numerosos modelos de ratón para una variedad de trastornos de los huesos humanos, incluyendo osteoporosis 16. Sin embargo, el tamaño y la accesibilidad de los embriones de ratón representan limitaciones significativas para formación de imágenes en vivo de los procesos esqueléticos. Pequeños peces teleósteos, por otra parte, servir como una alternativa atractiva para formación de imágenes in vivo. El pez cebra (Danio rerio) y medaka (Oryzias latipes) se han convertido en modelos animales populares para la investigación del esqueleto en las últimas dos décadas 17, 19, 22, 24. Bone en peces teleósteos y en los mamíferos es muy similar, tanto en un estructural y en un nivel fisiológico, y muchos de los genes reguladores clave y vías de señalización se conservan 3. Como en los mamíferos, peces teleósteos regular cuidadosamente la actividad de los osteoblastos y osteoclastos para equilibrar la formación de hueso y la resorción 26. Lo más importante, la claridad óptica de fish larvas permite el uso de indicadores fluorescentes para etiquetar las células óseas y de la matriz ósea calcificada 8, 9, 12, 21, 23, lo que facilita la observación de procesos celulares en el animal vivo. Además, una serie de herramientas genéticas se ha generado para facilitar la investigación biomédica relevante en el pescado. Para medaka, en particular, los métodos para la mutación génica dirigida por CRISPR / Cas9 2, de células de linaje rastreo de 6 y específica del sitio transgénesis 14 se han establecido recientemente y ahora son ampliamente en uso 15. Pequeñas larvas de teleósteos se han utilizado con éxito para pantallas químicas, lo que llevó al descubrimiento de varios medicamentos farmacológicamente relevantes 1, 18. Las larvas de peces son tolerantes a bajas concentraciones de DMSO y son capaces de absorber compuestos de su medio ambiente acuático, ya sea a través de la piel o a través del tracto gastrointestinal 1, 5. Nuestro laboratorio previamente representanteorted líneas medaka transgénicos que expresan reporteros fluorescentes en células de hueso bajo el control de diferentes promotores y osteoblast--osteoclastos específico. Estos incluyen los osteoblastos prematuros (10a1 colágeno, Col10a1; osterix, OSX) 20, 21, osteoblastos maduros (osteocalcina, OSC) 27, y los osteoclastos (catepsina K, ctsk) 24. También generó una línea transgénica que expresa el factor de osteoclastos inductor activador del receptor de factor nuclear kappa B ligando (RANKL) bajo el control de un promotor de choque 24 inducible por calor. La inducción de RANKL en este sistema resulta en la formación ectópica de osteoclastos activos. Esto conduce a un aumento de la resorción ósea y una grave fenotipo osteoporosis similar, con reducido drásticamente la mineralización en los cuerpos vertebrales. Recientemente, hemos mostrado que la actividad de los osteoclastos en este modelo puede ser bloqueada por el etidronato y alendronato bifosfonatos, two Los medicamentos que se usan comúnmente en la terapia de la osteoporosis humana, validando así medaka como un sistema modelo adecuado para la osteoporosis 27. Debido a su gran tamaño de la camada, el rápido desarrollo, y el pequeño tamaño de los embriones, larvas medaka transgénico son especialmente adecuado para el cribado a gran escala de medicamentos para la osteoporosis y para el análisis in vivo de la conducta de las células óseas. Los estudios realizados en medaka por lo tanto pueden complementar de manera eficiente experimentos en cultivos celulares y en ratones que tienen como objetivo el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas y nuevas terapias para los trastornos óseos humanos. En el presente estudio, se describe un protocolo para el tratamiento de las larvas de hueso-reportero medaka con el medicamento para la osteoporosis común, alendronato. También describimos en detalle cómo las larvas tratadas están montados y preparados para la formación de imágenes en vivo de la matriz ósea y de células óseas. Estos protocolos pueden ser adaptados fácilmente a otros compuestos químicos pequeños que, o bien el trabajo como anabólico óseo o fármacos antirresortivos. &lt;/ P&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1101">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">Alendronate&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">A4978</td>
			<td style="width:535px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:249px;">alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:249px;">ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ImageJ (1.4.3.67)</td>
			<td style="width:177px;">National Institute of Health (NIH)</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">LSM 510 Meta confocal&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">LSM Image Browser (4.2.0.121)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro-loader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>Eppendorf ep T.I.P.S 20 &#956;l</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">NIS-Elements BR 3.0 software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">Photoshop CS6 (13.0.0.0)</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">SMZ1000 stereomicroscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drug treatment and in vivo imaging of osteoblast-osteoclast interactions in a medaka fish osteoporosis model

Formadoras de hueso osteoblastos interactúan con los osteoclastos de resorción ósea para coordinar la renovación de la matriz ósea y para el control de la homeostasis esquelética. Medaka y larvas de pez cebra se utilizan ampliamente para analizar el comportamiento de las células óseas durante la formación de hueso, degeneración y reparación. Su claridad óptica permite la visualización de las células óseas marcadas con fluorescencia y colorantes fluorescentes unidos a la matriz ósea mineralizada. Nuestro laboratorio ha generado peces medaka transgénicos que expresan el factor de osteoclastos inducir activador del receptor de factor nuclear kappa B ligando (RANKL) bajo el control de un promotor de choque inducible por calor. La expresión ectópica de los resultados de RANKL en el exceso de formación de osteoclastos activados, que pueden ser visualizados en líneas reportero con la expresión nlGFP bajo el control del promotor catepsina K (ctsk). inducción RANKL y la formación de osteoclastos ectópico conduce a graves fenotipos osteoporosis similares. Compuesto li medaka transgénicones que expresan ctsk: nlGFP en osteoclastos, así como mCherry bajo el control del promotor osterix (osx) en osteoblastos prematuros, se pueden usar para estudiar la interacción de ambos tipos de células. Esto facilita la observación in vivo del comportamiento celular bajo condiciones de degeneración ósea y reparación. A continuación, describimos el uso de este sistema para probar un fármaco comúnmente usado en la terapia de la osteoporosis humana y describir un protocolo para la formación de imágenes en vivo. El modelo de medaka complementa estudios en cultivo celular y de los ratones, y ofrece un nuevo sistema para el análisis in vivo de la acción del fármaco en el sistema esquelético.

número de huevos abundantes, así como el pequeño tamaño de las larvas, hacen medaka un modelo excelente para la detección de drogas. Una placa de seis pocillos solo se utilizó para la cultura hasta 36 larvas, lo cual fue suficiente para proporcionar datos estadísticamente significativos. Otra gran ventaja de la utilización de pescado para el análisis del esqueleto es la posibilidad de hacer las imágenes en directo. La transparencia de las larvas de peces permite el uso de proteínas fluorescentes para etiqueta...

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Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

El tratamiento de drogas y<em&gt; En Vivo</em&gt; Imagen de osteoblasto-osteoclastos Interacciones en un modelo Medaka pescado osteoporosis

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

drug-treatment-vivo-imaging-osteoblast-osteoclast-interactions-medaka

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

9.1K vistas.  National University of Singapore. Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Video: Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. However, the analysis and quantification of cellular localization is difficult, as in many cases it relies on manual counting, thus bearing the risk of introducing a rater-dependent bias and reducing interrater reliability. Moreover, it is often difficult to judge whether the co-localization between two cells results from random positioning, especially when cell types differ strongly in the frequency of their occurrence. Here, a method for unbiased quantification of cellular co-localization in the bone marrow is introduced. The protocol describes the sample preparation used to obtain histological sections of whole murine long bones including the bone marrow, as well as the staining protocol and the acquisition of high-resolution images. An analysis workflow spanning from the recognition of hematopoietic and non-hematopoietic cell types in 2-dimensional (2D) bone marrow images to the quantification of the direct contacts between those cells is presented. This also includes a neighborhood analysis, to obtain information about the cellular microenvironment surrounding a certain cell type. In order to evaluate whether co-localization of two cell types is the mere result of random cell positioning or reflects preferential associations between the cells, a simulation tool which is suitable for testing this hypothesis in the case of hematopoietic as well as stromal cells, is used. This approach is not limited to the bone marrow, and can be extended to other tissues to permit reproducible, quantitative analysis of histological data.

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Automatizado Cuantificación de células hematopoyéticas - Interacciones de células del estroma en histológicas Imágenes de descalcificados Hueso

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analizando<em&gt; En Vivo</em&gt; Migración de células usando trasplantes de células y time-lapse en embriones de pez cebra

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells differentiate into primary trophoblast giant cells (TGCs) while the polar trophectoderm overlying the inner cell mass continues to proliferate later differentiating into secondary TGCs. TGCs play a key role in developing placenta and are essential for a successful pregnancy. Investigation of transcriptional regulation of specific genes during post-implantation development can give insights into TGCs development. Cells of the ectoplacental cone (EPC) from embryos at 7-7.5 days of gestation (E7-7.5), derived from the polar trophectoderm, differentiate into secondary TGCs1. TGCs can be studied in situ, on cryostat sections of embryos at E7 although the number of TGCs is very low at this stage. An alternative means of analyzing secondary TGCs is to use short-term cultures of individual EPCs from E7 embryos. We propose a technique to investigate the transcriptional status of genes of interest both in vivo and in vitro at the single-cell level using fluorescent in situ hybridization (RNA FISH) to visualize nascent transcripts. This technique provides a direct readout of gene expression and enables assessment of the chromosomal status of TGCs, which are large endoreplicating cells. Indeed, a key feature of terminal differentiation of TGCs is that they exit the cell cycle and undergo multiple rounds of endoreplication.This approach can be applied to detect expression of any gene expressed from autosomes and/or sex chromosomes and can provide important information into developmental mechanisms as well as placental diseases.

Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.

Análisis de la transcripción por ARN naciente de FISH<em&gt; En Vivo</em&gt; Células trofoblásticas gigantes o<em&gt; In Vitro</em&gt; Los cultivos a corto plazo de Ectoplacental Cono explantes

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Dirige la diferenciación de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivo de las células madre Pluripotent humanas

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imágenes en vivo de la fusión secundaria del paladar del ratón

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended intracellular endotubes that build and stabilize the lumen with a membrane and submembraneous cytoskeleton of apical character. The excretory cell expands its length approximately 2,000 times to generate these canals, making this model unique for the in vivo assessment of de novo polarized membrane biogenesis, intracellular lumen morphogenesis and unicellular tubulogenesis. The protocol presented here shows how to combine standard labeling, gain- and loss-of-function genetic or RNA interference (RNAi)-, and microscopic approaches to use this model to visually dissect and functionally analyze these processes on a molecular level. As an example of a labeling approach, the protocol outlines the generation of transgenic animals with fluorescent fusion proteins for live analysis of tubulogenesis. As an example of a genetic approach, it highlights key points of a visual RNAi-based interaction screen designed to modify a gain-of-function cystic canal phenotype. The specific methods described are how to: label and visualize the canals by expressing fluorescent proteins; construct a targeted RNAi library and strategize RNAi screening for the molecular analysis of canal morphogenesis; visually assess modifications of canal phenotypes; score them by dissecting fluorescence microscopy; characterize subcellular canal components at higher resolution by confocal microscopy; and quantify visual parameters. The approach is useful for the investigator who is interested in taking advantage of the C. elegans excretory canal for identifying and characterizing genes involved in the phylogenetically conserved processes of intracellular lumen and unicellular tube morphogenesis.

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans excretory canal is a unique single-cell model for the visual in vivo analysis of de novo polarized membrane biogenesis. This protocol describes a combination of standard genetic/RNAi and imaging approaches, adaptable for the identification and characterization of molecules directing unicellular tubulogenesis, and apical membrane and lumen biogenesis.

El Canal de Excretory C. elegans como modelo de morfogénesis Lumen intracelular y En Vivo biogénesis de la membrana polarizada en una sola celda: etiquetado por fusiones de GFP, ARNi interacción pantalla e imagen

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

Establecimiento de pez cebra Larval como modelo Animal para investigar Trypanosoma cruzi motilidad En Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

En Vivo Proyección de imagen del músculo-tendón morfogénesis en Drosophila pupa

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Imágenes de células vivas de la segregación de cromosomas durante la Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...